Genstilzwijging door siRNA vertegenwoordigt een handige experimentele strategie om BRCA2-afhankelijke biologische functies te analyseren met directe implicaties om de kankerbiologie beter te begrijpen. Een methode om BRCA2 efficiënt te stilzwijgen, samen met de experimentele procedure om veranderingen in BRCA2-eiwitexpressie te detecteren en te kwantificeren door immunoblotting in humane cellijnen, wordt gepresenteerd.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Silencing van het tumor suppressor eiwit BRCA2 en de detectie met conventionele biochemische analyses vormen een grote technische uitdaging vanwege de grote omvang van de menselijke BRCA2-eiwit (ongeveer 390 kDa). Wij rapporteren modificaties standaard siRNA transfectie en immunoblotting protocollen menselijke BRCA2 zwijgen te detecteren endogene BRCA2-eiwit, respectievelijk in humane epitheliale cellijnen. Belangrijke stappen zijn een hoge siRNA om transfectiereagens verhouding en twee daaropvolgende rondes van siRNA transfectie binnen hetzelfde experiment. Met behulp van deze en andere wijzigingen van het standaardprotocol we steeds meer bereiken dan 70% onderdrukking van het menselijke BRCA2-gen zoals beoordeeld door immunoblotting-analyse met anti-BRCA2 antilichamen. Bovendien denaturatie van de cellysaten bij 55 ° C in plaats van de gebruikelijke 70-100 ° C en andere technische optimalisaties van de immunoblotting procedure waarmee de aanwezigheid van intact eiwit BRCA2 zelfs when zeer kleine hoeveelheden uitgangsmateriaal zijn of als BRCA2 proteïne expressieniveaus zeer laag. Efficiënte silencing van BRCA2 in humane cellen een waardevolle strategie BRCA2 functies verstoren in cellen met intacte BRCA2, waaronder tumorcellen, om het moleculaire netwerk en celfuncties die beïnvloed kunnen worden door pathogene BRCA2 mutaties in tumoren te onderzoeken. Aanpassing van dit protocol voor efficiënte silencing en analyse van de andere 'grote' eiwitten zoals BRCA2 moet gemakkelijk haalbaar zijn.
Inleiding
De BRCA2 (borstkanker vatbaarheid gen-2) gen codeert voor een tumor suppressor eiwit dat een cruciale rol bij het herstel van DNA dubbelstrengige breuken door het reguleren van de functie van het recombinase enzym Rad51 1 speelt. BRCA2 is ook betrokken bij de modulatie van transcriptie en celcycluscontrole 2. Kiemlijn mutaties in het BRCA2-gen induceren een autosomaal dominant vatbaarheid voor borst- en eierstokkanker bij vrouwen en prostaatkanker bij mannen, en aanleg voor andere kankersoorten 3,4. Ondanks het verhoogde risico van kanker, BRCA2 mutaties die tegengaan of verminderen BRCA2 functie kankercellen gevoeliger voor chemotherapeutische middelen die DNA-beschadiging veroorzaken 5-7 maken. Sporadische kankers vertonen een lage BRCA2 mutaties (<3%) terwijl een lager niveau van BRCA2-eiwit werden bij sommige types kanker gedetecteerd, wat suggereert dat BRCA2-eiwitkan tijdens het ontstaan van tumoren worden verloren in sporadische kankers via niet-mutatie-afhankelijke mechanismen 7,8. Het is dus belangrijk om BRCA2 functies begrijpen in de context van kankerbiologie en in andere biologische instellingen.
Een krachtig hulpmiddel gebruikt om nieuwe functies van een gen in zoogdiercellen te identificeren om de expressie te onderdrukken. Als voorbeeld is silencing BRCA2-expressie in verschillende normale epitheelcellen recentelijk geleid tot de identificatie van een nieuwe functie van BRCA2 als regulator van anoikis weerstand, een belangrijke stap in het verkrijgen van kankercel invasieve en metastatische vermogen 9. Gene silencing kan worden bereikt door in de cellen of kleine interfererende (si) RNA of short hairpin (sh) RNA-moleculen gericht op de specifiek gen. De hoge potentie van siRNA en het gebruiksgemak maken het de preferentiële tool voor zwijgen experimenten gericht op het verwerven van nieuwe inzichten in biologische processen kritische eennd om nieuwe therapeutische targets te identificeren. Evenwel efficiënte knockdown van genexpressie niet gemakkelijk bereikbaar voor alle genen en kunnen zeer variabel zijn, afhankelijk van het celtype. Aangezien een afname in de intracellulaire eiwitgehalten het meest relevant fenotype onderzocht, is het cruciaal om gen-silencing kwantificeren immunoblotting analyse van het genproduct. Hiermee verband het BRCA2-eiwit vormt een extra uitdaging: wordt een groot eiwit (ongeveer 390 kDa), geen technische moeilijkheden aanwezig voor conventionele biochemische analyse, inclusief immunoblotting.
Wij rapporteren hier een protocol geoptimaliseerd voor efficiënte silencing van BRCA2 in menselijke epitheliale cellijnen en voor een snelle en succesvolle opsporing van BRCA2-eiwit knockdown door immunoblotting analyse.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Bereid siRNA oplossingen
- Resuspendeer 5 nmol van roerei (Ctrl) en 5 nmol van BRCA2 siRNA gedroogde pellets in 100 ul RNase-free water (uiteindelijke siRNA concentratie: 50 pm). Dit is de siRNA voorraad en moet bij -20 ° C in 10 gl aliquots worden opgeslagen.
- Neem een monster van 10 ul van de siRNA voorraad en voeg 40 ul van RNase-vrij water aan de 10 uM siRNA werkende oplossing te verkrijgen. Deze verdunning moet worden bewaard bij -20 ° C tot gebruik.
LET OP: Het siRNA werkende oplossing mag niet bevriezen ondergaan / ontdooien van meer dan 3 keer.
2. Seeding van menselijke epitheelcellen Lines
- Verwijder het groeimedium van menselijke epitheliale cellijnen groeien als monolagen cellen in weefselkweekplaten in een bevochtigde incubator bij 37 ° C, 5% CO 2.
- Was de cellen in de plaat eenmaal met RT PBS (10 ml PBS gedurende een 100 mm plaat).
- Om de cellen los van de plaat,Voeg 2 ml van 0,25% trypsine / 0,53 mM EDTA-oplossing en incubeer 3-5 min afhankelijk van het celtype.
- Voor het verzamelen van de losgemaakte cellen, trypsine te neutraliseren door het toevoegen van 2 ml compleet kweekmedium dat 10% foetaal runderserum.
- Overdracht van de cellen om een 15 ml buis.
- Centrifugeer de cellen bij 320-330 g gedurende 3 min bij 4 ° C in een swinging bucket rotor.
- Resuspendeer de celpellets in 5 ml antibiotica-vrij medium.
- Tel de cellen onder de microscoop in een Burker kamer of met een geautomatiseerd telsysteem volgens de instructies van de fabrikant.
- Zaad de cellen in 6-well platen tot ongeveer 80% confluent na 24 uren (0,5-1 x10 6 cellen in 2 ml medium per putje). Optimaal aantal cellen te geënt kan variëren naargelang de specifieke cellijnen en de groeisnelheid.
OPMERKING: Niet antibiotica toe te voegen in het medium op dit punt, omdat antibiotica negatief zal interfereren met de efficiëntie van ovectie. Het is belangrijk dat de cellen bij lage cultuur passages (<10) met hoge efficiëntie van BRCA2 siRNA transfectie bewerkstelligen.
3. Transfecteren cellen met siRNA
- Vierentwintig uur na het uitplaten van de cellen, tot de eerste ronde van transfectie.
- Verdun 6 pl lipide gebaseerde 10 specifieke siRNA transfectie reagens in 130 ul gereduceerd serum medium.
- Verdun 3 ul 10 uM siRNA (30 pmol) in 130 pl verminderde serum medium.
- Combineer de verdunde siRNA met verdunde transfectie reagens en incubeer gedurende 5-10 minuten bij kamertemperatuur.
- Tijdens de incubatie, verwijder het medium uit de cellen en voeg 2 ml vers medium voorverwarmd bij 37 ° C (zonder antibiotica).
- Voeg 250 ul van de siRNA-transfectie reagens complexen aan de cellen (dit bedrag voor een enkel putje van een 6-wells plaat).
- Incubeer de cellen in een bevochtigde incubator bij 3776, C met 5% CO 2.
- Na 24 uur werd verder met de tweede ronde van transfectie door stap 3.1.1-3.1.5 de volgende modificatie voor stap 3.1.2: verdun 5 ul 10 uM siRNA (50 pmol) in 130 pl verminderde serum medium.
- Incubeer de cellen gedurende 1-2 dagen bij 37 ° C voorafgaand aan de analyse.
OPMERKING: Twee ronden van transfecties en het gebruik van een hoge siRNA / transfectiereagens verhouding in de tweede ronde zijn essentieel om een hoge efficiëntie van BRCA2 silencing krijgen.
- Incubeer de cellen gedurende 1-2 dagen bij 37 ° C voorafgaand aan de analyse.
4. Lyse cellen voor immunoblotting analyse
- Bereid verse lysisbuffer met PBS (pH 7,4) die 1% van de niet-ionogene, niet-denaturerende detergens octylfenoxypolyethoxyethanol, 5 mM natriumpyrofosfaat, 1 mM natriumorthovanadaat, 10 mM natriumfluoride, 2 mM fenylmethylsulfonylfluoride, 10 ug / ml leupeptine, 10 gg / ml aprotinine. Houd het op het ijs.
- Verwijder het medium uit de cellen en was ze eenmaal met koud PBS (2 ml / putje) in de plaat. Om PBS overdracht te voorkomen, volledig te verwijderen van de plaat.
- Voeg 200 ul lysisbuffer aan elke well.
Opmerking: Als de cellen ook worden gebruikt voor andere testen, trypsinize de cellen zoals beschreven in stap 2,1-2,6 en resuspendeer de cellen in geschikte buffer / medium afhankelijk van de toepassing te gebruiken. - Voorzichtig zwenken de plaat uniform te verdelen de lysis buffer en incubeer gedurende 15 minuten bij 4 ° C op een rotator.
- Verzamel het cellysaat in een microcentrifuge buis op ijs met behulp van een celschraper.
- Centrifugeer bij 17.900 xg gedurende 25 min bij 4 ° C en verzamel de bovenstaande vloeistof in een nieuwe buis.
- Meet de eiwitconcentratie gebruikmaking van een commercieel verkrijgbaar eiwit assay volgens de aanwijzingen van de fabrikant.
5. BRCA2 immunoblotting analyse
- Bereid de lopende buffer door verdunning van 50 ml van 20x Tris-acetaat SDS lopende bUffer (50 mM Tricine, 50 mM Tris Base, 0,1% SDS, pH 8,24) met 950 ml gedestilleerd water.
- Bereid de sample als volgt: voeg 15 ug totaal cellysaat, 5 ul van 4x monsterbuffer bevattende lithium dodecyl sulfaat bij pH 8,4, 2 ui 10X monster reductiemiddel (0,5 M DTT) en lysis buffer tot een eindvolume van 20 ul.
NB: Dit protocol maakt de ontdekking van BRCA2 in normale cellijnen ook bij gebruik van een lager bedrag van de totale eiwitten (tot 5 ug). - Denatureren monsters bij 55 ° C gedurende 10 min.
LET OP: Het is cruciaal om 55 ° C te gebruiken. Aangezien BRCA2 proteïne warmtegevoelig 11, hogere denaturering temperaturen leiden consequent verlies van intacte full-length (390 kDa) BRCA2-eiwit. - Stel de elektroforetische kamer volgens de instructies van de fabrikant.
- Plaats de monsters en 10 ul hoogmoleculair vooraf gekleurde eiwitstandaard een precasted gel (Tris-acetaat 3-8%) en uitgevoerd bij 120 V gedurende about 2 uur 12. Stop de elektroforetische run voor de 55 kDa blauwe markering laat de precasted gel.
- Bereid de overdracht buffer met 50 ml van 20x overdrachtsbuffer, 100 ml 100% methanol en 850 ml water.
- Activeren PVDF-membraan (poriegrootte 0,45 um) door het weken in 100% methanol gedurende 5 minuten, spoelen met gedistilleerd water en equilibreren overdrachtbuffer tenminste voor 5 min. Week de sponzen van de overdrachtsinrichting in transfer buffer bij 4 ° C tot gebruik.
- Wanneer de elektroforetische run voorbij is, monteer de sandwich bij de overdracht stack in de volgende volgorde (bottom-up): drie sponsen verzadigd in de overdracht buffer, een 3MM grade papier vel verzadigd in de overdracht buffer, de gel, geactiveerde PVDF membraan, een 3MM grade papier vel verzadigd in de overdracht buffer, drie sponzen verzadigd in de overdracht buffer 13,14. Plaats de stapel in de inrichting en transporterende eiwitten bij 350 mA gedurende 4 uur bij 4 ° C of bij 180 mA gedurende de nacht bij 4 ° C.
OPMERKING: Being BRCA2 een groot eiwit, is het cruciaal om de overgang te verlengen van 1 uur (zoals voorgesteld door de fabrikant en meest transferprotocollen) tot 4 uur of gedurende de nacht volledige overdracht van hoogmoleculair eiwitten garanderen. Bovendien, vanwege de lange overdrachtstijd, is het essentieel om de blotting uitgevoerd in een koude kamer bij 4 ° C om oververhitting te minimaliseren en sandwich demonteren te vergemakkelijken. Semi-droge overdracht systemen zijn niet goed voor het overbrengen van grote eiwitten. - Na overdracht, was de membraan met TBS, blokkeren gedurende 1 uur bij KT in TBS-Tween 0,25% (TBS-T) met 5% magere melkpoeder en probe overnacht bij 4 ° C met 30 ul anti-BRCA2 konijnen polyklonaal antilichaam ( 200 gg / ml), verdund in 9 ml TBS-T + 5% magere melkpoeder [1: 300 (v / v) verdunning].
- Was het membraan driemaal (10 minuten elk) met TBS-T, dan incubeer het filter 1 uur met 1 pl mierikswortel peroxidase-geconjugeerd anti-konijn secundair antilichaam verdund in 10 ml TBS-T + 5% magere melkpoeder. Daarna was het membraan driemaal (10 minuten elk) met TBS-T.
- Voer immunodetectie door ECL te BRCA2 eiwitten openbaren met verbeterde chemiluminescentie (ECL) Western Blotting Detection Reagent, volgens de instructies van de fabrikant. Visualiseer immunochemiluminescent bands op hoge resolutie ECL films.
- Voer immunodetectie met een antilichaam voor een huishoud-gen, zoals β-tubuline (55 kDa), op hetzelfde filter als ladingscontrole met een monoklonaal antilichaam tegen β-tubuline verdund 1: 1000 (10 pl anti-tubuline antilichaam in 10 ml TBS-T + 5% magere melkpoeder) gedurende 1 uur bij KT. Was en incubeer secundair antilichaam zoals beschreven voor BRCA2 (5,10-5,11), behalve het gebruik van mierikswortel peroxidase-geconjugeerd anti-muizen in plaats van anti-konijn secundair antilichaam.
- Verwerven van een digitaal beeld van de films onder de indruk van immunochemiluminescent bands en de band intensiteit door toegewijde beeldanalyse software analyseren (bv., ImageJ).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Alvorens biologische / biochemische assay voor het effect van BRCA2 silencing op celfuncties onderzoeken de eerste stap is om de specificiteit van de silencing bevestigen via een vervormd siRNA (niet-gerichte siRNA) zij aan zij met BRCA2 siRNA (figuur 1A ). Het is belangrijk om een tweede ronde van siRNA transfectie uitgevoerd met een hoge siRNA / transfectie gekozen om een hoge efficiëntie van BRCA2 silencing krijgen. Inderdaad, die uitsluitend een ronde siRNA transfectie of een lager...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Door kiemlijn mutaties van het BRCA2-gen leiden tot een verhoogd risico van verschillende soorten kanker, zoals vrouwelijke en mannelijke borstkanker, eierstokkanker, prostaatkanker, pancreaskanker, melanoom en 3,4, een aantal studies ondernomen om de biologische functie begrijpen van het BRCA2-eiwit. De meeste van deze onderzoeken zijn genetisch bepaalde vooral door technische problemen bij het analyseren van een grote eiwitachtige BRCA2. De hier beschreven methode voor geluiddemping en analyseren B...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door FIRB-Merit-subsidies RBNE08YFN3_005 en RBNE08HWLZ_012, en het Italiaanse Ministerie van Economie en Financiën aan de CNR voor het project “FaReBio di Qualità”.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| BRCA2 siRNA | Dharmacon | L-003462-00 | SMARTpool: ON-TARGETplus BRCA2 siRNA |
| Ctrl siRNA | Dharmacon | D-001810-10-05 | ON-TARGETplus Non-targeting Pool |
| Lipofectamine RNAiMAX Reagent | Life Technologies | 13778075 | Transfectiereagens |
| OPTI-MEM I Reduced Serum Medium | Life Technologies | 31985-070 | Medium voor transfectieprocedure |
| NuPAGE Tris-Acetate 3-8% 1,5 mm Gel precast | Life Technologies | EA0378 | Gel voor eiwitelektroforese |
| NuPAGE LDS Sample buffer | Life Technologies | NP0007 | Reagens voor eiwitelektroforese |
| NuPAGE Sample Reducing agent (10x) | Life Technologies | NP0004 | Reagens voor eiwitelektroforese |
| NuPAGE Antioxidant | Life Technologies | NP0005 | Reagens voor eiwitelektroforese |
| HiMark Pre-stained protein standard | Life Technologies | LC5699 | Voorgekleurde marker voor gelelektroforese |
| XCell SureLoc Mini-Cell System | Life Technologies | EI0002 | Apparatuur voor eiwitelektroforese/overdracht |
| NuPAGE Tris-Acetate SDS Running Buffer | Life Technologies | LA0041 | Reagens voor Western blotting |
| PVDF membraan | Millipore | IPVH00010 | Reagens voor Western blotting |
| NuPAGE Transfer Buffer | Life Technologies | NP0006-1 | Reagens voor Western blotting |
| BRCA2 H-300 konijn polyklonaal antilichaam | Santa Cruz Biotechnology | sc-8326 | 1:300 verdunning |
| Beta-tubulin monoklonaal antilichaam | Sigma Aldrich | T4026-100UL | 1:1.000 verdunning |
| Skimmolkpoeder | Sigma Aldrich | 70166 | Reagens voor Western blotting |
| Tween-20 | Sigma Aldrich | P1379 | Reagens voor Western blotting |
| SuperSignal West Pico/Femto Chemiluminescent Substrate | Pierce Thermo Scientific | 34080/34096 | Chemiluminescentie systeem |
| PNT1A cellen | SIGMA Aldrich (voor ECACC) | 95012614 | PNT1A menselijk, normaal prostaatepitheel geïmmortaliseerd met SV40 |
| Nthy cellen | SIGMA Aldrich (voor ECACC) | 90011609 | Nthy-ori 3-1 Cellijn menselijk, schildklier folliculaire epitheliale cellen |
| Cell Proliferation Kit I (MTT) | Roche | 11465007001 | Kit voor celproliferatie-assays |
Referenties
- Thorslund, T., West, S. C. BRCA2: a universal recombinase regulator. Oncogene. 26, 7720-7730 (2007).
- Yoshida, K., Miki, Y. Role of BRCA1 and BRCA2 as regulators of DNA repair, transcription, and cell cycle in response to DNA damage. Cancer Sci. 95, 866-871 (2004).
- Martin, A. M., et al. Germline mutations in BRCA1 and BRCA2 in breast-ovarian families from a breast cancer risk evaluation clinic. J Clin Oncol. 19, 2247-2253 (2001).
- Castro, E., Eeles, R. The role of BRCA1 and BRCA2 in prostate cancer. Asian J Androl. 14, 409-414 (2012).
- Vencken, P. M., et al. Chemosensitivity and outcome of BRCA1- and BRCA2-associated ovarian cancer patients after first-line chemotherapy compared with sporadic ovarian cancer patients. Ann Oncol. 22, 1346-1352 (2011).
- Farmer, H., et al. Targeting the DNA repair defect in BRCA mutant cells as a therapeutic strategy. Nature. 434, 917-921 (2005).
- Arbini, A. A., et al. Mitochondrial DNA depletion sensitizes cancer cells to PARP inhibitors by translational and post-translational repression of BRCA2. Oncogenesis. 2, e82(2013).
- Yang, F., Guo, X., Yang, G., Rosen, D. G., Liu, J. AURKA and BRCA2 expression highly correlate with prognosis of endometrioid ovarian carcinoma. Mod Pathol. 24, 836-845 (2011).
- Guaragnella, N., Marra, E., Galli, A., Moro, L., Giannattasio, S. Silencing of BRCA2 decreases anoikis and its heterologous expression sensitizes yeast cells to acetic acid-induced programmed cell death. Apoptosis. 19, 1330-1341 (2014).
- Mahato, R. I., Rolland, A., Tomlinson, E. Cationic lipid-based gene delivery systems: pharmaceutical perspectives. Pharm Res. 14, 853-859 (1997).
- Su, L. K., et al. Characterization of BRCA2: temperature sensitivity of detection and cell-cycle regulated expression. Oncogene. 17, 2377-2381 (1998).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227, 680-685 (1970).
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc Natl Acad Sci U S A. 76, 4350-4354 (1979).
- Burnette, W. N. ' 'Western blotting': electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate--polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A. Anal Biochem. 112, 195-203 (1981).
- Hunter, F. W., et al. Dual targeting of hypoxia and homologous recombination repair dysfunction in triple-negative breast cancer. Mol Cancer Ther. , (2014).
- Drew, Y., et al. Therapeutic potential of poly(ADP-ribose) polymerase inhibitor AG014699 in human cancers with mutated or methylated BRCA1 or BRCA2. J Natl Cancer Inst. 103, 334-346 (2011).
- Bryant, H. E., et al. Specific killing of BRCA2-deficient tumours with inhibitors of poly(ADP-ribose) polymerase. Nature. 434, 913-917 (2005).
- Ihnen, M., et al. Therapeutic potential of the poly(ADP-ribose) polymerase inhibitor rucaparib for the treatment of sporadic human ovarian cancer. Mol Cancer Ther. 12, 1002-1015 (2013).
- Jeong, J. H., Jo, A., Park, P., Lee, H., Lee, H. O. Brca2 Deficiency Leads to T Cell Loss and Immune Dysfunction. Mol Cells. , (2015).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
