Isolatie en Voortplanting van circulerende tumorcellen uit een muis Cancer

Samenvatting

Circulerende tumorcellen (CTC's) hebben aangetoond een belangrijke rol te spelen bij tumormetastase. Hier wordt een methode beschreven voor het isoleren en vermenigvuldigen van CTC's uit het volledige bloed van een syngene model van muistumoren met leverkanker (HCC) metastase.

Samenvatting

Kankermetastase is de belangrijkste oorzaak van sterfgevallen geassocieerd met kanker. Recente studies hebben aangetoond dat circulerende tumorcellen (CTC's) belangrijk zijn voor kankermetastase. Inderdaad, het aantal CTC's correleert met de tumorgrootte. Hier wordt een gedetailleerde beschrijving gegeven van een methodologie voor het isoleren en vermeerderen van CTC's uit een syngeneïsch muismodel van hepatocellulair carcinoom (HCC) die downstream-analyse van potentieel belangrijke moleculaire mechanismen van solide orgaantumormetastase mogelijk maakt. Deze methode is efficiënt en reproduceerbaar. Het is een niet-invasieve techniek en heeft daarom het potentieel om de invasieve biopsie van weefsels van mensen te vervangen, wat geassocieerd kan zijn met complicaties. Daarom staat de hier besproken methode de isolatie en vermeerdering van CTC's uit volbloedmonsters toe, zodat ze kunnen worden onderzocht en gekarakteriseerd. Dit heeft potentieel voor toekomstige aanpassing voor klinische toepassingen zoals diagnose en gepersonaliseerde gerichte therapie.

Inleiding

De kankeronderzoeksgemeenschap is al bekend met het bestaan van circulerende tumorcellen (CTC's) sinds ze voor het eerst werden waargenomen door Thomas Ashworth in 1869¹. Sindsdien is aangetoond dat CTC's belangrijk zijn voor tumormetastase en ziekteprogressie^2-5. Tegenwoordig zijn solide tumoren een belangrijke oorzaak van morbiditeit en mortaliteit wereldwijd. CTC's zijn zeldzame cellen die afkomstig zijn van primaire tumoren en door de bloedbaan naar verschillende organen reizen, waarvan slechts een klein deel uiteindelijk uitgroeit tot metastasen^2-5. Opmerkelijk is dat er een positieve correlatie bestaat tussen tumorgrootte en het aantal CTC's^3,4.

Een beter begrip van de biologie van CTC's kan bijdragen aan de zoektocht naar gerichte therapie. Bovendien kunnen CTC's diagnostische toepassingen hebben. Om deze potentiële klinische toepassingen te bereiken, moeten enkele huidige uitdagingen bij het bestuderen van CTC's worden overwonnen. Een uitdaging houdt verband met het feit dat CTC's aanwezig kunnen zijn als enkele cellen of als clusters en ze mogelijk zelfs hun fenotype kunnen veranderen als reactie op de bloedomgeving². Bovendien kan detectie erg uitdagend zijn, deels vanwege het lage aantal CTC's (enkele tot honderden per milliliter) onder één miljard hematologische cellen per milliliter in het bloed⁶. Desondanks is in de afgelopen jaren het onderzoek naar de potentiële klinische toepassingen van CTC's uit solide orgaankankers geïntensiveerd.

Ondanks deze inspanningen, blijven de uitdagingen van het bestuderen en begrijpen van de rol van CTC's bestaan vanwege de zeldzaamheid van CTC's en de ontoereikendheid van de momenteel beschikbare technologische hulpmiddelen. Ondanks deze uitdagingen, blijft het enorme potentieel voor klinische toepassingen een stimulans om onderzoek naar de rol van CTC's bij kankermetastase te bevorderen.

We waren onlangs succesvol in het isoleren en vermeerderen in celkweek van CTC's uit een orthotopisch syngene model van hepatocellulair carcinoom (HCC) metastase⁵. Het doel van het huidige artikel is om alle aspecten van de succesvolle methodologie in detail te beschrijven. De betekenis van deze methodologie ligt in het feit dat deze aanpak kan worden aangepast om met succes humane CTC's te isoleren en in cultuur te vermeerderen, waardoor de mogelijkheid van in vitro studies van de biologie van CTC's wordt vergroot.

Er zijn meerdere potentiële klinische toepassingen voor het gebruik van CTC's. CTC's kunnen nuttig zijn voor prognose, responsbewaking, screening, dynamische bewaking van moleculaire tumorveranderingen en gepersonaliseerde therapie⁴. Daarom heeft een beter begrip van de biologie van CTC's een hoog potentieel voor klinische impact.

Protocol

Ethiek Verklaring: Alle dierproeven werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) van Hunter College van de City University van New York.

1. Pre-experiment Procedures

1. Bij aankomst in het dierverblijf aanvankelijk huis 3 BALB / c muizen een kooi met een gefilterde top en houtsnippers beddengoed. Zorg ervoor dat de muizen hebben gratis toegang tot voedsel, Purina knaagdieren voer en water. Beddengoed en voedsel moet tweemaal per week worden gewijzigd terwijl kooien keer per week worden schoongemaakt.
2. Induceren algemene anesthesie bij muizen met behulp van een isofluraan vaporizer samen met zuurstof bij een constante snelheid van 1 liter per minuut. Het systeem is zelfstandig en heeft een precisie vaporizer.
3. Positie dier in een plastic doos die de nauwkeurigheid verdamper en gas / anesthesiesysteem aangesloten is. Aanvankelijk de verdamper tot 2,5 tot dier bewusteloos is, op welk punt lager de verdamper 2.
4. Op dat moment, schakelt deklep lijn, afdichting aan de doos en het openen van de neuskegel.
5. Beweeg het dier naar de bereidingszone, de neuskegel correct opgesteld en aangesloten (onderhoud anesthesie).
6. Bereid 5 × 10 ⁶ BNL 1ME A.7R.1 muis HCC cellen voor implantatie per muis. BNL 1ME A.7R.1 moeten groeien in medium (10% hitte-geïnactiveerd FBS, 1% penicilline / streptomycine en 2 mM L-glutamine) incuberen in een celkweek schaal bij 37 ° C in een bevochtigde incubator met lucht en 5% CO _2.
7. Met een spuit met een 20 G naald implantaat 100 pl PBS dat 5 x 10 ⁶ BNL 1ME A.7R.1 muis hepatocellulaire carcinoomcellen in een kwab van de lever van BALB / c muizen om de primaire tumoren. Na implantatie, het huis van de BALB / c muizen in een kooi met hetzelfde huis voorschriften als pre-implantatie.
8. Aan het experimentele eindpunt klinisch bewijs van hepatocellulaire carcinoom is waarneembaar als significante vermindering van lichaamsconditiescore (meestal ontdekt na 4 weken). Op dit punt is er een kans dat primaire tumoren ontwikkeld in de lever, terwijl metastatische afzettingen in de longen hebben gevormd. Daarna begint het proces van de isolatie en vermeerdering van circulerende tumorcellen.

2. Verzameling van volbloed voor het circuleren van Tumor Cell Isolation

LET OP: Goed sanitized de operatie gebied en zorg ervoor dat het rommel-vrij. Autoclaaf alle chirurgische instrumenten of weken in een desinfecterend middel volgens de aanbevelingen van de fabrikant

1. Offer muizen door humane euthanasie bij experimentele eindpunt (klinisch bewijs van de ontwikkeling van tumoren). Euthanization muizen moeten CO ₂ stikken betrekken. Neem de muizen naar behoren anesthesie bevestigen dat juist verdeeld. Kooldioxide dient langzaam vrijkomen in de kamer gedurende 5 - 10 min, waardoor ademhalingsstilstand. Volg door intracardiale verbloeding en cervicoal dislocatie. ⁵
2. Gebruik van een 25 G naald bevestigd aan een injectiespuit 1 ml voor het verzamelen van bloed. Heparanize de spuit met 0,01 ml heparine. Punctie de huid onmiddellijk met de naald inferieur aan de xyphisternum bij ongeveer 45 ° hoek. Advance naald langzaam naar het hart doorboren, en vervolgens de hoek van de naald. Gestaag Houd de naald en spuit in de plaats, en trekken uit 500 ul - 1000 pi volledig bloed uit het hart.
3. Verwijder de spuit en naald en bloed over in een gelabelde 1,5 ml pyrogeenvrij buis. Centrifugeer de volbloed in 1,5 ml pyrogeenvrij buis verzameld op 1167 g gedurende 5 min.
   Opmerking: De centrifugatie scheidt het monster van compleet bloed in drie lagen: de onderste laag bestaande of hematocriet van rode bloedcellen, een tussenliggende dunne laag buffy coat en een bovenste plasmalaag.
4. Verwijder de plasma voorzichtig door pipetteren en het verzamelen van het in een afzonderlijke 1,5 ml pyrogeen-vrij buis Further experimenten zoals detectie van celvrije nucleïnezuren ^7.
5. Voor isolatie van circulerende tumorcellen (CTCs), verzamelt de bufferlaag in een afzonderlijke 1,5 ml pyrogeenvrij buis voorbereiding voor rode bloedcellen (RBC) lysis. Dit is noodzakelijk om resterend RBC in de buffy coat laag te verwijderen.

3. Recept voor rode bloedcellen (RBC) Lysis Buffer

1. Maak een 1 L oplossing van RBC lysis buffer.
2. Wordt 500 ml ammoniumchloride en 500 ml Tris. Meng een 1 L oplossing van RBC lysis buffer te creëren met een eindconcentratie van 155 mM ammoniumchloride en 10 mM Tris.
3. Buffer de oplossing een pH van 7,5. Bewaar de RBC lysis buffer bij 2 tot 8 ° C en breng tot kamertemperatuur onmiddellijk voor gebruik.

4. RBC Lysis van Buffy Coat

1. Voeg 1 ml RBC lysis buffer om de steriele pyrogeenvrije 1,5 ml buis die de verzamelde buffy coat.
2. Meng de inhoud van de buis doorinverterende meerdere keren. Incubeer de gemengde inhoud van de buis gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur op de bank. Centrifugeer de gemengde inhoud gedurende 5 min bij 1167 x g.
3. Na centrifugeren wordt een witachtige korrel verkregen. Gooi de roodachtige supernatant langzaam en voorzichtig in 10% bleekmiddel, zonder verstoring van de pellet. Als de pellet is niet witachtig, re-do stappen 3,1-3,5. Het verhogen van de incubatietijd in RBC lysis buffer om 10 - 15 min kunnen eveneens nuttig zijn.
4. Veilig verwijderen van de biologisch afval eenmaal ontsmetting van biologisch afval in 10% bleekwater is voltooid na 24 uur.

5. Vermeerdering in celkweek

OPMERKING: Tumorcellen worden meestal snel groeiende cellen witte bloedcellen die overvloedig in de oorspronkelijke combinatie van cellen gezaaid in de schaal zijn. Na herhaalde verandering van medium en daaropvolgende passages van CTCs, worden alle witte bloedcellen verwijderd en een relatief zuivere populatie van CTCs blijft.

1. Naweggooien van het supernatant tot 10% bleekmiddel, was de witachtige pellet in 1 ml met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) ten minste eenmaal, en resuspendeer in volledig kweekmedium voor propagatie in celcultuur.
2. Was eenmaal is voltooid, voeg 1 ml compleet BNL 1ME A.7R.1 kweekmedium (10% door warmte geïnactiveerd FBS, 1% penicilline / streptomycine en 2 mM L-glutamine) aan de pellet en resuspendeer de pellet in het kweekmedium.
3. Zaad de geresuspendeerde mix van cellen in een celkweek schotel. Incubeer de celkweekschaal bij 37 ° C in een bevochtigde incubator met lucht en 5% _CO2.
4. Verander het celkweekmedium elke 2-3 dagen. Na vijf tot zeven dagen, zal CTC's hebben gehandeld op grond van de celkweek gerecht en begonnen prolifererende. Deze cellen zullen levensvatbaar dan 25 passages en na herhaalde bevriezen en ontdooien cycli ⁵ blijven.

6. Keuring van Hepatocellulair Carcinoom doorgeven tumorcellijn

1. Voeren apolymerase kettingreactie (PCR) gebaseerde methode slechts één specifieke DNA segment van het muizen β-globine-gen te amplificeren om te bevestigen dat de nieuwe CTC vastgestelde cellijnen muizencellen zoals de oorspronkelijke geïmplanteerde BNL 1ME A.7R.1 HCC lijn. Methode werd oorspronkelijk beschreven en gevalideerd door Steube et al. ^5,8
2. Voer immunokleuring van de hepatocyt-specifieke marker cAMP responsief element bindingseiwit 3-achtige 3 (CREB3L3) door een specifiek antilichaam. Dit zal dat nieuwe gevestigde CTC inderdaad hepatocyten als het origineel geïmplanteerde BNL 1ME A.7R.1 cellijn te bevestigen. ⁵

Resultaten

De hier beschreven methode heeft aangetoond dat CTCs worden geïsoleerd. Muizen werden op humane wijze gedood bij experimentele eindpunt. Het proces betrokken kooldioxide stikken, intra-cardiale leegbloeden en cervicale dislocatie. Een schema van de belangrijkste stappen van de procedure zijn weergegeven in figuur 2. Volbloedmonsters door intra-cardiale leegbloeden verzameld werden verwerkt volgens de hierboven beschreven protocol. Daarna werd centrifugeren toegepast om de buffy coat laag die werd onderw...

Discussie

In deze studie is beschreven hoe CTC's geïsoleerd en gepropageerd kunnen worden uit het gehele bloed van een syngene muis met HCC. Het doel van dit werk is om de lopende studies naar de mechanismen van kankermetastase te verbeteren.

Een factor die bijdraagt aan de slechte prognose van veel kankers is het ontbreken van tijdige detectie en de daaruit voortvloeiende wijdverspreide verspreiding van de maligniteit³. CTC's komen voort uit primaire kankers en verspreiden zich via de bloedb...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Heparin Sodium Salt 1 g	VWR	89508-852
BTX Tube Micro 1.5 ml Clear NS	VWR	89511-254	1.5 ml  pyrogen-vrije eppendorf buizen
Needle Sterile Disp BD 25 G x 1 in	VWR	BD305125	25 G naald
Slp Tip SRNG 1 ml 200 each per pack	VWR	BD309659	1 ml spuittip
Syringe 1 ml leur lok Pk 100	VWR	BD309628	1 ml spuit
VWR Forceps Tissue 6	VWR	82027-446	Forceps
Cyromold intrm 15 x 15 x 5 mm PK 100	VWR	25608-924	Cyromold
Cryo-oct compund 4 oz	VWR	25608-930	Oct compound
VWR Slide sprfrst 25 x 75 mm PK72	VWR	48311-703	Glijbanen
VWR Cover Glass #2 22 x 50 mm	VWR	48-382-128	Dekglas
VWR Slide Box True North Fm Pu	VWR	89140-278	Glijbanenbox
Super HT PAP Pen	VWR	89427-058	PAP pen
Water RNASe and DNAse free 2 L	VWR	101454-204	Nuclease Vrij Water
Buffer Tris Ultra Pure Grade 500 g	VWR	97061-796	Tris Buffer
Ammonium Chloride ACS Grade 2, 5 Kg	VWR	97062-048	Ammonium Chloride Buffer
Falcon Tissue Culture Dish 60 x 15 mm Style polystyrene	VWR	353002	Weefselkwekerij Schaal
Clorox Germicidal Bleach, Regular	VWR	89501-620	Clorox Bleekmiddel
PBS, 1x (Phosphate-Buffered Saline) without calcium & magnesium (500 ml)	Thermo Fischer Scientific	21-040-CV	PBS, 1x
DMEM, 1x  with 4.5 g/L glucose & L-glutamine without sodium pyruvate	Thermo Fischer Scientific	10-017-CV	DMEM 1x media voor BNL 1ME A.7R.1 cellen
Fetal Bovine Serum	Thermo Fischer Scientific	35-010-CV	FBS
Penicillin Streptomycin Solution, 100x	Thermo Fischer Scientific	30-002-Cl	Penicilline Streptomycine
Sorvall Biofuge pico	Thermo Fischer Scientific	75002411	13.000 rpm Centrifuge