Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Isolatie van leukocyten uit de Murine Tissues de Maternal-Fetal Interface

17.4K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/52866

⸱

21 mei 2015

 ,  ,  ,  , 
1Department of Obstetrics & Gynecology, Wayne State University School of Medicine, 2School of Paediatrics and Reproductive Health, Research Centre for Reproductive Health, the Robinson Research Institute, The University of Adelaide, 3Department of Immunology & Microbiology, Wayne State University School of Medicine, 4Perinatology Research Branch, NICHD/NIH/DHHS

In dit artikel

Samenvatting

Beschreven hierin is een protocol om de infiltraterende leukocyten van weefsels bij de moeder-foetus interface (baarmoeder, decidua en placenta) van muizen te isoleren en te analyseren. Dit protocol behoudt de integriteit van de meeste celoppervlaktemarkers en levert voldoende levensvatbare cellen op voor downstream toepassingen, inclusief flowcytometrie-analyse.

Samenvatting

Immuuntolerantie in de zwangerschap vereist dat het immuunsysteem van de moeder ondergaat opvallende veranderingen om te accepteren en te koesteren de zich ontwikkelende foetus. Deze tolerantie wordt gestart tijdens de coïtus, tijdens bevruchting en implantatie opgericht en onderhouden tijdens de zwangerschap. Actieve cellulaire en moleculaire mediatoren van tolerantie maternale-foetale worden verrijkt op de plaats van contact tussen foetale en maternale weefsels, zogenaamde maternale-foetale interface, die de placenta en de baarmoeder en deciduale weefsel omvat. Deze interface omvat stromale cellen en infiltrerende leukocyten en hun overvloed en fenotypische karakteristieken verandert in de loop van de zwangerschap. Infiltrerende leukocyten in het maternale-foetale-interface omvatten neutrofielen, macrofagen, dendritische cellen, mestcellen, T-cellen, B-cellen, NK-cellen en NKT cellen die tezamen de lokale micro-omgeving die de zwangerschap in stand te creëren. Een onbalans tussen deze cellen of inappropriate verandering in hun fenotypen wordt beschouwd als een mechanisme van ziekte tijdens de zwangerschap. Daarom is de studie van leukocyten dat de maternale-foetale-interface infiltreren is essentieel om de immune mechanismen die leiden tot zwangerschap verwante complicaties helderen. Hierin beschreven is een protocol dat een combinatie van zachte mechanische dissociatie gevolgd door een sterke enzymatische disaggregatie met een proteolytische en collagenolytische enzymatische cocktail de infiltrerende leukocyten uit de muizen weefsels te isoleren van de maternale-foetale interface gebruikt. Dit protocol maakt de isolatie van grote aantallen levensvatbare leukocyten (> 70%) met voldoende geconserveerde antigene en functionele eigenschappen. Geïsoleerde leukocyten kan vervolgens worden geanalyseerd door verscheidene technieken, waaronder immunofenotypering, celsortering, imaging, immunoblotting, mRNA expressie, celkweek en in vitro functionele testen zoals gemengde leukocyt reacties, proliferatie of cytotoxiciteit assays.

Inleiding

Immunotolerantie bij zwangerschap is een periode waarin kenmerkende reactie plaatsvinden het immuunsysteem van de moeder. Deze veranderingen kan de moeder naar de foetus, een semi-allogeen transplantaat 1 tolereren. De foetus tot expressie vaderlijke major histocompatibility complex (MHC) antigenen 2 en foetale cellen gevonden in de moederlijke circulatie 3; echter de foetus niet verworpen 4,5. Dit raadsel is niet helemaal duidelijk.

De meest recente hypothese stelt dat de moeder-foetale tolerantie wordt gemaakt tijdens de coïtus en bevruchting 6,7 en onderhouden om een voldragen zwangerschap 8-10 ondersteunen. Een uitsplitsing van deze moeder-foetale tolerantie wordt beschouwd als een mechanisme van de ziekte tijdens de vroege en late stadia van de zwangerschap 10-16. Maternale-foetale tolerantie betreft de deelname van diverse leukocyten subpopulaties, waaronder T-cellen (regulatoire T-cellen, Th1-cellen, Th2-cellen, en Th17 cellen), macrophages, neutrofielen, mastcellen, NK-cellen en NKT-cellen, dendritische cellen en B-cellen, die verandering in dichtheid en lokalisatie gedurende de zwangerschap 15,17-19. Maternale-foetale tolerantie verrijkt ten maternale-foetale-interface 20 - de anatomische plaats waar het immuunsysteem van de moeder interageert met de foetale antigenen 20,21.

De moeder-foetale interface is gemaakt tijdens placentatie wanneer de foetale extravilleuze trofoblastcellen binnenvallen de baarmoeder slijmvlies 22-24. Aan de foetale kant van deze interface, de vliezen rond de foetus het creëren van een gespecialiseerde epitheeloppervlak binnen de placenta en de syncytiotrofoblast cellen controle van de uitwisseling van voedingsstoffen via hun direct contact met bloed van de moeder 22. Aan moederszijde van de interface, de decidua rekruteert heterogene pool van leukocyten in muizen die verantwoordelijk zijn voor 30% tot 50% van alle decidua cellen. Naast hun deelname aan Maternal immuun tolerantie, deze cellen zijn de belangrijkste bijdragers aan verschillende processen tijdens de zwangerschap, bijv., de bescherming van de voortplantingsorganen van infecties, bevruchting, embryo implantatie 7,25, deciduale angiogenese 26, vasculaire remodeling 24,27, trofoblastinvasie 28, placenta ontwikkeling 24,25, en, uiteindelijk, arbeid en levering 15,17. Daarom is het onderzoek van de bij maternale-foetale tolerantie leukocyten is essentieel voor het ophelderen van de pathogenese van zwangerschap gerelateerde complicaties.

Hoewel het gebruik van immunohistochemie en immunofluorescentie gegevens heeft gegenereerd voor de directe visualisatie en lokalisatie van baarmoeder, decidua of placenta leukocyten 29,30 flowcytometrie analyse bleek voorts specifieke subsets van leukocyten in elk van deze weefsels 31,32. Daarnaast flowcytometrie is gebruikt om de dichtheid en percentage mater vastnal-foetale-interface leukocyten 33 en expressie van extracellulaire en intracellulaire eiwitten 8-10,34. Flow cytometrische analyse van leukocyten bij de moeder-foetale-interface vereist een single-cell suspensie. Om infiltrerende leukocyten te isoleren van de deciduale, baarmoeder, placenta en weefsels zijn twee methoden weefsel dissociatie gebruikt: mechanische en enzymatische. Beide werkwijzen maken de scheiding van geïnfiltreerde leukocyten uit de extracellulaire matrix (ECM) van deze weefsels. Enzymatische weefsel dissociatie is superieur aan mechanische weefsel dissociatie omdat het zorgt voor een hogere opbrengst van leukocyten met minder shear-force-bijbehorende schade 35. Bijgevolg mechanische weefsel dissociatie vraagt ​​erom weefsel 36, waarbij de variabiliteit en heterogeniteit van de monsters kan toenemen. Toch kan mechanische dissociatie de keuze bij het antigeen van belang kan worden veranderd door enzymatische dissociatie of wanneer de functionaliteit van de cels plaats moeten worden behouden (bijv., cytotoxiciteit van NK-cellen) 35.

De toepassing van proteolyse van specifieke enzymen om de ECM breken elimineert de lage opbrengsten waargenomen met mechanische dissociatie. Verschillende studies hebben melding gemaakt van het gebruik van trypsine 32, collagenase 37, DNase 31, dispase 38 en commerciële cocktails van verschillende enzymen 32,39. Echter, de aard en concentratie van de verschillende enzymen en de duur van digestie nauwkeurig worden vastgesteld en gevalideerd om handhaving van de integriteit van het celoppervlak antigene epitopen vereist voor immunofenotypering waarborgen. De verschillende oppervlaktestructuren zijn differentieel gevoelig voor vernietiging door verschillende enzymen, met sommige enzymen, zoals trypsine, die bekend voor het strippen van leukocyten oppervlakte epitopen herkend door verschillende monoklonale antilichamen.

Hierin wordt geïntroduceerd is een methode waarbij een proteolytic en collagenolytische enzymatische cocktail, genaamd Accutase. Deze enzymatische oplossing is mild genoeg terwijl efficiënt dissociëren murine weefsels bij de maternale-foetale interface en vereist geen toevoeging van andere dissocieert reagentia of serum dat zij de dissociatie reactie te beëindigen. Bovendien is het klaar voor gebruik en behoeft, hoewel de tijd van dissociatie moet worden bevestigd, is robuuster dan de bovengenoemde enzymen 40,41.

Het gebruik van een combinatie van beide soorten weefsel disaggregatie verbetert de kwaliteit en de hoeveelheid cellen verkregen; aldus, hebben verschillende studies het gecombineerde gebruik van mechanische en enzymatische dissociatie uitgevoerd met bevredigende resultaten 31,32,37. De hierin beschreven protocol werd vastgesteld en gevalideerd in ons laboratorium; Het gebruikt een combinatie van een zachte mechanische dissociatie gevolgd door een sterke enzymatische uitsplitsing. Dit protocol maakt de isolatie en verdere studiede infiltrerende leukocyten in muizen weefsels bij de maternale-foetale interface (uterus, decidua en placenta). Het volgende protocol handhaaft de integriteit van celoppervlak markers en levert voldoende levensvatbare cellen voor verdere toepassingen zoals aangetoond door flow cytometrische analyse. Ten slotte is dit protocol handhaaft de samenhang van celpreparaat voor de analyse en vergelijking van verschillende murine weefsels van het maternale-foetale interface.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Voor het werken met de in dit protocol genoemde monsters, moet dier ethische goedkeuring worden gegeven door de lokale Research Ethics Committee en de Institutional Review Boards. Bij het werken met dierlijk bloed, cellen, of gevaarlijke stoffen als bedoeld in dit protocol, moet de juiste bioveiligheid en laboratorium veiligheid acties worden opgevolgd.

1. Mouse Handling en Tissue Collection

  1. Bereid een steriele werkplek en het verkrijgen van steriele instrumenten voor het weefsel collectie. Deze tools omvatten grote en kleine chirurgische schaar, pincet, en fijn-tip pincet. Omvatten kleine Petrischalen gelabeld met het geschikte weefsel namen, gevuld met 1x fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) oplossing (3-5 ml) geëquilibreerd tot kamertemperatuur (20-22 ° C). Ook een grote petrischaal, unlabeled, gevuld met 1x PBS-oplossing (10-15 ml).
  2. Euthanaseren een zwangere muis (10,5-19,0 ​​dagen na coïtum (DPC) en voor aflevering) op kooldioxide (CO 2). Om de muis gedood, gebruikt de cervicale dislocatie techniek.
    Opmerking: Alvorens 10,5 dpc, is het moeilijk om de deciduale weefsel handmatig scheiden van de baarmoederweefsels. Als de isolatie van deciduale leukocyten niet is vereist, leukocyten uit de baarmoederweefsels van niet-zwangere muizen of die van muizen <10,5 dpc kan ook worden uitgevoerd door het volgen van dit protocol.
  3. Met een paar steriele chirurgische schaar, de onderbuik gedeelte van de huid en spierweefsel volledig te verwijderen. Met een pincet, bewegen af ​​alle andere organen tot de baarmoeder en eierstokken zijn zichtbaar. Met de baarmoeder nog steeds verbonden, gebruikt de tang te bewegen buiten de peritoneale holte (figuur 1A).
  4. Zoek de eierstokken distale naar de eileider en tubale kruising van elke baarmoeder hoorn. De kleine chirurgische schaar, een insnijding in het tubale verbinding en scheiden de baarmoederhoorns van het mesenterium waarin de uterine vaten; Vervolgens,accijns bij de baarmoederhals naar de baarmoeder hoorns van de peritoneale holte (Figuur 1B) los.
  5. Met kleine chirurgische schaar, een insnijding tussen de baarmoederhals en het onderste segment van de baarmoederhoorns. Leave hierbij een gedeelte van de cervix tijdens dit proces (figuur 1C) voorkomen dat het openen van de baarmoederhoorn.
  6. Dompel de baarmoederhoorns (inclusief cervix) in een grote petrischaal gevuld met 1x PBS-oplossing (10-15 ml) aan de implantatieplaatsen hydrateren.
  7. Hoewel nog steeds ondergedompeld in 1x PBS-oplossing, trim het vet uit de baarmoeder hoorns met de kleine chirurgische schaar. Houd de weefsels ondergedompeld in 1x PBS oplossing gedurende de dissectie.
  8. Houd de baarmoeder hoorns op zijn plaats met de tang, verwijder dan één van de implantatieplaatsen uit de baarmoeder met een transversaal doorgesneden door de inter-implantatie regio, met behulp van de kleine chirurgische schaar (figuur 1D). De implantatie site bevat de foetus, omringd door dechorioallantoïsmembraan en de baarmoeder, deciduale, placentale en weefsels.
  9. Met behulp van de tang, houd de site in plaats en maken een kleine incisie in de baarmoederwand grenst aan de placenta en deciduale weefsels (figuur 1E). Randen rond de omtrek van de placenta / decidua totdat deze gescheiden worden van zowel de baarmoederwand en chorioallantoïsmembraan dat de foetus omvat (Figuur 1F).
  10. Verwijder de placenta en de bijgevoegde deciduale weefsels en plaats in 1x PBS-oplossing (3-5 ml; zie stap 1.12).
  11. Plaats de foetus omringd door het chorioallantoïsmembraan bevestigd aan de baarmoederweefsels in een petrischaal gevuld met 1x PBS oplossing (3-5 ml). De hydratatie van deze weefsels zal de scheiding van het chorioallantoïsmembraan van de baarmoederwand te vergemakkelijken (zie stap 1.14).
  12. Met behulp van een paar fijne-tip pincet, zachtjes schil de deciduale weefsel (wit-grijze laag) van de placenta oppervlak. Voer dezeStap voorzichtig om de integriteit van de placenta en deciduale weefsel (figuur 1G) handhaven.
  13. Plaats de placenta en deciduale weefsel in twee afzonderlijk gelabeld petrischaal gevuld met 1x PBS oplossing (3-5 ml elk).
  14. Verwijder voorzichtig de baarmoederwand van de chorion membraan met fine-tip pincet. Dit zijn de baarmoederweefsels.
  15. Plaats de baarmoederweefsels in een petrischaal gevuld met 1x PBS oplossing (3-5 ml).
  16. Herhaal stap 1,8 tot 1,15 totdat alle innestelingplaatsen zijn verwerkt.
  17. Verzamel verscheidene baarmoeder, deciduale, placentale en weefsels naar de opbrengst aan cellen tijdens enzymatische digestie verbeteren. De hoeveelheid weefsel hangt af van de worpgrootte; echter leukocyten isolatie vereist> 2 stukjes weefsel.
    Let op: Voor meer gedetailleerde informatie over de ontleding van de implantatie sites op verschillende zwangerschapsduur dagen, bekijk de foto's gevonden in hoofdstuk twee van de Guide to Investigatiop van de muis zwangerschap 42.

2. Baarmoeder, deciduale en placentaweefsel Dissociatie

  1. Label verschillende steriele 2 ml conische buizen met de juiste weefsel naam en plaats een flacon met 1000 ul van enzymatische oplossing op ijs.
  2. Uit de petrischaal gevuld met 1x PBS oplossing, overdracht twee stukken (100-150 mg) van de baarmoeder, deciduale, placentale of weefsels in een gelabelde 2 ml conische buis.
  3. Voeg 500 ul koude enzymatische oplossing in elk 2 ml conische buis.
  4. Met fijne steriele schaar, beginnen met het weefsel ondergedompeld in de enzymatische oplossing distantiëren totdat het fijn wordt gehakt. Na verloop van tijd, zal de schorsing van een melkachtig uiterlijk te ontwikkelen. Deze stap mag niet langer dan 2 minuten over-manipulatie van het monster te voorkomen.
  5. Wanneer het weefsel is gedissocieerd, een extra 500 pl koude enzymatische oplossing voor de 2 ml conische buis.
  6. Plaats de 2 ml conische buis op ijs.
  7. Herhaal stap 2,2 tot 2,6 per individu tissue totdat alle weefsels zijn verwerkt.
  8. Breng alle 2 ml conische buizen met gehomogeniseerd weefsel (gehakt weefsel + enzymatische oplossing) monsters van het ijs in een incubator bij 37 ° C en het uitvoeren van een zachte orbitale schudden (80 rpm). Incubeer gedurende 30 - 35 min. Zorg ervoor dat de temperatuur van de incubator wordt gestabiliseerd alvorens de incubatietijd.
  9. Na incubatie, verwijder de 2 ml conische buizen met los weefsels uit de incubator en plaats ze op ijs om verdere spijsvertering te voorkomen.
  10. Label steriele 50 ml conische buizen volgens het type weefsel. Verwijder de deksels en te vervangen door een steriele cel zeef (100 micrometer poriegrootte).
  11. Giet de gedissocieerde weefsel weg 2 ml conische buizen door de cel zeef middels ~ 20 ml 1x PBS oplossing. De stukjes weefsel in de cel zeef achterblijven en de celsuspensie wordt doorheen.
  12. Was de dissociated weefsels in de cel zeef 2-3 maal met 20 ml 1 x PBS oplossing wordt met een transferpipet.
  13. Spoel de lege 2 ml conische buizen met 1x PBS-oplossing (1 ml) en giet de inhoud door de cel zeven.
  14. Verwijder de cel zeven van de 50 ml conische buizen en vervang de deksels. Centrifugeer de buisjes bij 1250 xg gedurende 10 minuten bij 4 ° C.
  15. Voorzichtig het supernatans aspireren zonder de celpellet. De celpellet bevat de geïsoleerde leukocyten en stromale cellen.
  16. Resuspendeer de celpellet in 1 ml RPMI cultuurmedium zonder foetaal runderserum (FBS). Meng voorzichtig. Gebruik geen vortex.
  17. Voeg 500 ul van nette FBS aan een 5 ml polystyreen buis en langzaam overlay de celsuspensie.
  18. Centrifugeer gedurende 10 minuten bij 1100 xg zonder rem bij kamertemperatuur levensvatbare cellen te pelletiseren terwijl celresten wordt vastgehouden op de PBS / FBS-interface.
  19. Zuig het supernatans zonder het aanraken van de cel pellet. De CELl pellet bevat voornamelijk levensvatbare cellen.
  20. Optioneel: De mononucleaire cellen te concentreren, gebruikt een verzadigde polysaccharideoplossing 20%, zoals hieronder beschreven.
    1. Resuspendeer de celpellet in 1000 pl RPMI cultuurmedium zonder FBS.
    2. Voeg 1 ml 20% verzadigde polysacharideoplossing een 5 ml polystyreen buis en langzaam overlay de celsuspensie top van deze oplossing volgens de instructies van de fabrikant. Terwijl de gelaagdheid van het monster, vermijd het mengen van de 20% verzadigde oplossing polysaccharide met de celsuspensie.
    3. Centrifugeren met een swing-out rotor bij 500 xg gedurende 30 min bij kamertemperatuur zonder rem. Het is belangrijk de rem uit te schakelen om te voorkomen dat het mengen van de cellen en verlies van de gradiënt. Mononucleaire cellen wordt in het grensvlak tussen de 20% verzadigde oplossing van polysaccharide en 1x PBS-oplossing.
    4. Zuig en gooi het supernatant. De celpellet bevat voornamelijk mononucleaire cellen.
      Neete: Voor levensvatbaarheid kleuring en intracellulaire kleuring uit te voeren, zie stap 3. immunofenotypering voeren, zie stap 4. Voor levensvatbaarheid kleuring en alleen extracellulaire vlekken uit te voeren, zie stap 5. Om een ​​celcultuur van geïsoleerde leukocyten uit te voeren, zie stap 6. Om te voeren magnetische celsortering, zie stap 7.

3. levensvatbaarheid kleuring voor fixable Cells

  1. Resuspendeer de celpellet in 1100 pl 1x PBS oplossing. Meng zachtjes met een micropipet.
  2. Breng 100 pi van de celsuspensie in een 5 ml polystyreen buis. Voeg 400 ul van 1 x PBS oplossing van het 5 ml polystyreen buis. Deze buis is een controle voor weefsel auto-fluorescentie. Bewaren bij 4 ºC tot stap 3,5.
  3. Breng de resterende 1.000 ul van de celsuspensie in nieuw 5 ml polystyreen buis. Voeg 1 ul van de levensvatbaarheid kleurstof en voorzichtig gehomogeniseerd. Incubeer gedurende 30 minuten in het donker bij 4 ºC.
  4. Na incubatie voeg 1000 & #181; l 1x PBS-oplossing. Meng voorzichtig met de hand.
  5. Centrifuge zowel 5 ml polystyreen buizen (stap 3,2 en 3,3) bij 1250 xg gedurende 10 minuten bij 4 ° C. Zuig en gooi het supernatant.
    Opmerking: De cel pellet (stap 3,3) gebruikt in stap 4. De cel pellet (stap 3,2) dient als controle voor tissue auto-fluorescentie.

4. Immuunfenotypering

  1. Resuspendeer de cel pellet in 50 ul anti-muis CD16 / CD32 (verdund 1: 100 in FACS buffer [0,1% BSA, 0,05% natriumazide, 1x PBS, pH 7,4]). Meng de celsuspensie voorzichtig. Gebruik niet de vortex.
  2. Incubeer de celsuspensie in 5 ml polystyreen buis in het donker bij 4 ° C gedurende 10 min.
  3. Na incubatie, voeg 50 ul van elk anti-leukocyten monoklonale antilichamen reageren met extracellulaire celoppervlak markers of isotype-gematchte controle-antilichaam (antilichaam verdunningen worden gevalideerd). Om bijvoorbeeld leukocyten subpopulaties analyse, gebruik anti-moGebruik antilichamen die reageren met de volgende leukocyt-celoppervlak markers: CD45, Ly6G, F4 / 80, CD 11 c, CD49b, B220, CD3, CD4 en CD8 (Tabel 1).
  4. Wanneer antilichamen tegen extracellulaire markers zijn toegevoegd aan de 5 ml polystyreen buis meng voorzichtig. Incubeer in het donker gedurende 30 minuten bij 4 ° C.
  5. Tijdens deze incubatie, bereiden en pre-warm de fixatie bufferoplossing (verdund met gedeïoniseerd water, 1: 5) tot 37 ° C, indien nodig. Houd de buffer bij 37 ° C in de duisternis tot het gebruik ervan noodzakelijk is.
  6. Na 30 min incubatie, voeg 500 ul FACS buffer in de 5 ml polystyreen buis en meng. Deze stap is noodzakelijk om de cellen te wassen en verwijderen van eventuele overmaat aan ongebonden antilichaam.
  7. Centrifugeer de monsters bij 1250 xg bij 4 ° C gedurende 10 min. Zuig en gooi het supernatant.
    Opmerking: Als intracellulaire kleuring niet nodig is, zie stap 5. Indien intracellulaire kleuring nodig is, permeabilisatie presteren en intracelular vlekken hier, en ga dan verder met de fixatie (stap 4.8).
  8. Voeg 500 ul van voorverwarmde fixatie bufferoplossing om de celpellet en incubeer in het donker gedurende 10 minuten bij 37 ° C.
  9. Breng 500 pi FACS-buffer in de 5 ml polystyreen buis. Meng voorzichtig.
  10. Centrifugeer de monsters bij 1250 xg bij 4 ° C gedurende 10 min. Zuig en gooi het supernatant.
  11. Voeg 500 ui FACS buffer aan elk monster. Deze monsters kunnen nu worden geanalyseerd door flow cytometrie. Het verwerven van de monsters direct voor de beste resultaten.

5. levensvatbaarheid kleuring voor unfixable Cells

  1. Na extracellulaire immunofenotypering, resuspendeer de celpellet in 500 ui FACS-buffer.
  2. Voeg 1 ul van 4 ', 6-diamidino-2-fenylindool dihydrochloride (DAPI, 200 gg / ml) net voor het verkrijgen van het monster.
  3. Visualiseren monsters binnen 1-2 minuten na toevoeging DAPI met een flow cytometer.

6. Cell Culture

  1. Bereid een werkstation onder een steriele zuurkast. Pre-warm de RPMI cultuurmedium tot 37 ° C met een waterbad.
  2. Resuspendeer de celpellet in 1000 pi FACS buffer celtelling.
  3. Tel het aantal levensvatbare cellen met behulp van een automatische celgetalmeter of hemocytometer en 0,4% trypan blauwe oplossing, volgens de instructies van de fabrikant. Noteer het totaal levend celgetal.
  4. Centrifugeer de cellen bij 1250 xg bij 4 ° C gedurende 10 min om de FACS buffer te verwijderen.
  5. Resuspendeer de celpellet in 500 ul voorverwarmde RPMI cultuurmedium door voorzichtig pipetteren 2-3 keer.
  6. Plate het gewenste aantal cellen in een steriele 24-well plaat en incubeer bij 37 ° C. De incubatietijd zal worden bepaald door de vraagstelling.

7. Magnetic Cell Sorting

  1. Stel een schone werkstation met de volgende materialen: MS kolommen, magnetische celscheider, 15ml conisch 30 urn pre-scheiding filters, en een multi-stand.
  2. Resuspendeer de celpellet in 500 ui MACS buffer (0,5% BSA, 2 mM EDTA, 1 x PBS, pH 7,2).
  3. Met behulp van een automatische celgetalmeter of hemocytometer en 0,4% trypan blauwe oplossing, tellen en noteer de totale levend celgetal.
  4. Centrifugeer de cellen bij 1250 xg bij 4 ° C gedurende 10 min. Zuig en gooi het supernatant. Voeg nog eens 500 ul van MACS buffer.
  5. Ga naar de magnetische scheiding de aanbevelingen van de fabrikant uitgevoerd.
  6. Bepaal de zuiverheid door middel van flowcytometrie of microscopie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

De dissectie van muizen weefsels van de maternale-foetale interface is weergegeven in figuur 1; Deze procedure omvat het openen van de peritoneale holte (Figuur 1A, B), baarmoederhoorns (figuur 1C) met de implantatieplaatsen (figuur 1D), en het verzamelen van de baarmoederweefsels (Figuur 1E), placenta (Figuur 1F), en decidua weefsels (figuur 1G) en 16,5 dpc. Figuur 2 toont de morfologi...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Het verzamelen van consistente gegevens die de overvloed en fenotypische kenmerken van het infiltreren leukocyten registreert bij de moeder-foetale interface is van essentieel belang voor het begrijpen van de pathogenese van de zwangerschap gerelateerde complicaties. Verschillende technieken beschreven dat de isolatie van infiltrerende leukocyten uit de muizen weefsels bij maternale-foetale-interface gedurende de zwangerschap 31,38,39,43-46 vergemakkelijken. Echter, elke techniek verschilt, gebruikt verschill...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs openbaren geen belangenconflicten.

Dankbetuigingen

NGL werd gesteund door de Wayne State University Perinatale Initiative in Maternal, Perinatale en Child Health. We dankbaar erkennen Maureen McGerty en Amy E. Comfort Suites Comfort Suites (Wayne State University) voor hun kritische lezing van het manuscript.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Magentic Cell Separation
MS ColumnsMilitenyi Biotec130-042-201
Cell SeparatorMilitenyi Biotec130-042-102
30 μm pre-separation filtersMilitenyi Biotec130-041-407
MultistandMilitenyi Biotec130-042-303
15 ml conical tubesThermo Fisher339650
MACS BufferMilitenyi BiotecLaboratory preparation(0.5% bovine serum albumin, 2mM EDTA en 1x PBS, pH 7.2)
Reagents
Accutase enzymatische oplossingLife TechnologiesA11105-01
Anti-muis CD16/CD32BD Biosciences533142
Anti-muis extracellulaire antilichamenBD Bioscences/eBiosciencesTabel 1
NatriumazietFisherS227-500
Bovine serum albumine (BSA)Sigma-AldrichA7906-100G
LIVE/DEAD viabiliteitskleurLife TechnologiesL23105
FixatiebufferoplossingBD Biosciences558049
FACS BufferBD BiosciencesLaboratory preparation0.1% BSA, 0.05% natriumaziet, 1x PBS, pH 7.4
Trypanblauw oplossing 0.4%BIO-RAD145-0013
Foetaal bovien serum (FBS)Life Technologies16000-044
Aanvullende instrumenten
Incubator met shakerThermo ScientificMaxQ 4450
Flow cytometerBD LSRFortessa
CentrifugeThermo ScientificLegend LXTR
Vacuumsysteemlaboratorium geconstrueerd
IncubatorThermo ScientificIncubator 3307
WaterbadPrecision51221035
CeltellerBIO-RADTC20 Automated Cell Counter
Optische en fluorescentiemicroscopenZeiss en OlympusZeiss LSM780 en Olympus CKX41

Referenties

  1. Trowsdale, J., Betz, A. G. Mother's little helpers: mechanisms of maternal-fetal tolerance. Nat Immunol. 7 (3), 241-246 (2006).
  2. King, A., et al. Evidence for the expression of HLAA-C class I mRNA and protein by human first trimester trophoblast. J Immunol. 156 (6), 2068-2076 (1996).
  3. Bonney, E. A., Matzinger, P. The maternal immune system's interaction with circulating fetal cells. J Immunol. 158 (1), 40-47 (1997).
  4. Tafuri, A., Alferink, J., Moller, P., Hammerling, G. J., Arnold, B. T cell awareness of paternal alloantigens during pregnancy. Science. 270 (5236), 630-633 (1995).
  5. Chaouat, G., Petitbarat, M., Dubanchet, S., Rahmati, M., Ledee, N. Tolerance to the foetal allograft. Am J Reprod Immunol. 63 (6), 624-636 (2010).
  6. Robertson, S. A., et al. Seminal fluid drives expansion of the CD4+CD25+ T regulatory cell pool and induces tolerance to paternal alloantigens in mice. Biol Reprod. 80 (5), 1036-1045 (2009).
  7. Robertson, S. A., Moldenhauer, L. M. Immunological determinants of implantation success. Int J Dev Biol. 58 (2-4), 205-217 (2014).
  8. Aluvihare, V. R., Kallikourdis, M., Betz, A. G. Regulatory T cells mediate maternal tolerance to the fetus. Nat Immunol. 5 (3), 266-271 (2004).
  9. Rowe, J. H., Ertelt, J. M., Xin, L., Way, S. S. Pregnancy imprints regulatory memory that sustains anergy to fetal antigen. Nature. 490 (7418), 102-106 (2012).
  10. Samstein, R. M., Josefowicz, S. Z., Arvey, A., Treuting, P. M., Rudensky, A. Y. Extrathymic generation of regulatory T cells in placental mammals mitigates maternal-fetal conflict. Cell. 150 (1), 29-38 (2012).
  11. Saito, S., Sakai, M., Sasaki, Y., Nakashima, A., Shiozaki, A. Inadequate tolerance induction may induce pre-eclampsia. J Reprod Immunol. 76 (1-2), 30-39 (2007).
  12. Lee, J., et al. A signature of maternal anti-fetal rejection in spontaneous preterm birth: chronic chorioamnionitis, anti-human leukocyte antigen antibodies, and C4d. PLoS One. 6 (2), 0016806(2011).
  13. Steinborn, A., et al. Pregnancy-associated diseases are characterized by the composition of the systemic regulatory T cell (Treg) pool with distinct subsets of Tregs. Clin Exp Immunol. 167 (1), 84-98 (2012).
  14. Gomez-Lopez, N., Laresgoiti-Servitje, E. T regulatory cells: regulating both term and preterm labor. Immunol Cell Biol. 90 (10), 919-920 (2012).
  15. Gomez-Lopez, N., StLouis, D., Lehr, M. A., Sanchez-Rodriguez, E. N., Arenas-Hernandez, M. Immune cells in term and preterm labor. Cell Mol Immunol. 23 (10), 46(2014).
  16. Romero, R., Dey, S. K., Fisher, S. J. Preterm labor: one syndrome, many causes. Science. 345 (6198), 760-765 (2014).
  17. Gomez-Lopez, N., Guilbert, L. J., Olson, D. M. Invasion of the leukocytes into the fetal-maternal interface during pregnancy. J Leukoc Biol. 88 (4), 625-633 (2010).
  18. Timmons, B., Akins, M., Mahendroo, M. Cervical remodeling during pregnancy and parturition. Trends Endocrinol Metab. 21 (6), 353-361 (2010).
  19. Arck, P. C., Hecher, K. Fetomaternal immune cross-talk and its consequences for maternal and offspring's health. Nat Med. 19 (5), 548-556 (2013).
  20. Erlebacher, A. Immunology of the maternal-fetal interface. Annu Rev Immunol. 31, 387-411 (2013).
  21. Wambach, C. M., Patel, S. N., Kahn, D. A. Maternal and fetal factors that contribute to the localization of T regulatory cells during pregnancy. Am J Reprod Immunol. 71 (5), 391-400 (2014).
  22. Cross, J. C., Werb, Z., Fisher, S. J. Implantation and the placenta: key pieces of the development puzzle. Science. 266 (5190), 1508-1518 (1994).
  23. Georgiades, P., Ferguson-Smith, A. C., Burton, G. J. Comparative developmental anatomy of the murine and human definitive placentae. Placenta. 23 (1), 3-19 (2002).
  24. Croy, B. A., et al. Imaging of vascular development in early mouse decidua and its association with leukocytes and trophoblasts. Biol Reprod. 87 (5), (2012).
  25. Hofmann, A. P., Gerber, S. A., Croy, B. A. Uterine natural killer cells pace early development of mouse decidua basalis. Mol Hum Reprod. 20 (1), 66-76 (2014).
  26. Lima, P. D., Zhang, J., Dunk, C., Lye, S. J., Anne Croy, B. Leukocyte driven-decidual angiogenesis in early pregnancy. Cell Mol Immunol. , (2014).
  27. Robson, A., et al. Uterine natural killer cells initiate spiral artery remodeling in human pregnancy. FASEB J. 26 (12), 4876-4885 (2012).
  28. Lash, G. E., et al. Regulation of extravillous trophoblast invasion by uterine natural killer cells is dependent on gestational age. Hum Reprod. 25 (5), 1137-1145 (2010).
  29. Kruse, A., Merchant, M. J., Hallmann, R., Butcher, E. C. Evidence of specialized leukocyte-vascular homing interactions at the maternal/fetal interface. Eur J Immunol. 29 (4), 1116-1126 (1999).
  30. Degaki, K. Y., Chen, Z., Yamada, A. T., Croy, B. A. Delta-like ligand (DLL)1 expression in early mouse decidua and its localization to uterine natural killer cells. PLoS One. 7 (12), 28(2012).
  31. Habbeddine, M., Verbeke, P., Karaz, S., Bobe, P., Kanellopoulos-Langevin, C. Leukocyte Population Dynamics and Detection of IL-9 as a Major Cytokine at the Mouse Fetal-Maternal Interface. PLoS One. 9 (9), (2014).
  32. Blaisdell, A., Erlbacher, E. Ch. 53. The Guide to Investigation of Mouse Pregnancy. Yamada, A. T., Croy, B. A., DeMayo, F. J., Adamson, S. L. , Elsevier Academic Press. 619-635 (2014).
  33. Rinaldi, S. F., Catalano, R. D., Wade, J., Rossi, A. G., Norman, J. E. Decidual neutrophil infiltration is not required for preterm birth in a mouse model of infection-induced preterm labor. J Immunol. 192 (5), 2315-2325 (2014).
  34. Plaks, V., et al. Uterine DCs are crucial for decidua formation during embryo implantation in mice. J Clin Invest. 118 (12), 3954-3965 (2008).
  35. Parr, E. L., Szary, A., Parr, M. B. Measurement of natural killer activity and target cell binding by mouse metrial gland cells isolated by enzymic or mechanical methods. J Reprod Fertil. 88 (1), 283-294 (1990).
  36. Arck, P. C., et al. Murine T cell determination of pregnancy outcome. Cell Immunol. 196 (2), 71-79 (1999).
  37. Male, V., Gardner, L., Moffett, A. Isolation of cells from the feto-maternal interface. Curr Protoc Immunol. 7 (7), 1-11 (2012).
  38. Li, L. P., Fang, Y. C., Dong, G. F., Lin, Y., Saito, S. Depletion of invariant NKT cells reduces inflammation-induced preterm delivery in mice. J Immunol. 188 (9), 4681-4689 (2012).
  39. Collins, M. K., Tay, C. S., Erlebacher, A. Dendritic cell entrapment within the pregnant uterus inhibits immune surveillance of the maternal/fetal interface in mice. J Clin Invest. 119 (7), 2062-2073 (2009).
  40. Bajpai, R., Lesperance, J., Kim, M., Terskikh, A. V. Efficient propagation of single cells Accutase-dissociated human embryonic stem cells. Mol Reprod Dev. 75 (5), 818-827 (2008).
  41. Zhang, P., Wu, X., Hu, C., Wang, P., Li, X. Rho kinase inhibitor Y-27632 and Accutase dramatically increase mouse embryonic stem cell derivation. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 48 (1), 30-36 (2012).
  42. Pang, S. C., Janzen-Pang, J., Tse, Y., Croy, B. A. Ch. 2. The Guide to Investigation of Mouse Pregnancy. Yamada, A. T., Croy, B. A., DeMayo, F. J., Adamson, S. L. , Elsevier Academic Press. 21-42 (2014).
  43. Zenclussen, A. C., et al. Murine abortion is associated with enhanced interleukin-6 levels at the feto-maternal interface. Cytokine. 24 (4), 150-160 (2003).
  44. Mallidi, T. V., Craig, L. E., Schloemann, S. R., Riley, J. K. Murine endometrial and decidual NK1.1+ natural killer cells display a B220+CD11c+ cell surface phenotype. Biol Reprod. 81 (2), 310-318 (2009).
  45. Addio, F., et al. The link between the PDL1 costimulatory pathway and Th17 in fetomaternal tolerance. J Immunol. 187 (9), 4530-4541 (2011).
  46. Shynlova, O., et al. Infiltration of myeloid cells into decidua is a critical early event in the labour cascade and post-partum uterine remodelling. J Cell Mol Med. 17 (2), 311-324 (2013).
  47. Panchision, D. M., et al. Optimized flow cytometric analysis of central nervous system tissue reveals novel functional relationships among cells expressing CD133, CD15, and CD24. Stem Cells. 25 (6), 1560-1570 (2007).
  48. Gartner, S. The macrophage and HIV: basic concepts and methodologies. Methods Mol Biol. , 670-672 (2014).
  49. Quan, Y., et al. Impact of cell dissociation on identification of breast cancer stem cells. Cancer Biomark. 12 (3), 125-133 (2012).
  50. Gordon, K. M., Duckett, L., Daul, B., Petrie, H. T. A simple method for detecting up to five immunofluorescent parameters together with DNA staining for cell cycle or viability on a benchtop flow cytometer. J Immunol Methods. 275 (1-2), 113-121 (2003).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Isolatie van leukocytenenzymatische digestiemechanische dissociatiegradi nt van foetaal runderserumimmunofenotyperingcel sorterencelkweekflowcytometrie
Isolatie van leukocyten uit de Murine Tissues de Maternal-Fetal Interface
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.