Atomic Force Microscopy Imaging en Force Spectroscopie van Ondersteunde lipidendubbellagen

Summary

We beschrijven een protocol voor de bereiding van ondersteunde lipide-dubbellagen en de karakterisering ervan met behulp van atoomkrachtmicroscopie en krachtspectroscopie.

Abstract

Atomaire krachtmicroscopie (AFM) is een veelzijdige, hoogwaardige beeldvormingstechniek die de visualisatie van biologische membranen mogelijk maakt. Het heeft voldoende vergroting om membraansubstructuren en zelfs individuele moleculen te onderzoeken. AFM kan fungeren als een krachtsonde om interacties en mechanische eigenschappen van membranen te meten. Ondersteunde lipide dubbellagen worden conventioneel gebruikt als membraanmodellen in AFM-studies. In dit protocol laten we zien hoe ondersteunde dubbellagen worden bereid en hoe hun structuur en mechanische eigenschappen met behulp van AFM worden gekarakteriseerd. Dit omvat de dikte van de dubbellaag en de doorbraakkracht.

De informatie die wordt geleverd door AFM-beeldvorming en krachtspectroscopie helpt bij het definiëren van de mechanische en chemische eigenschappen van membranen. Deze eigenschappen spelen een belangrijke rol in cellulaire processen zoals het handhaven van celhomeostase tegen omgevingsstress, het samenbrengen van membraaneiwitten en het stabiliseren van eiwitcomplexen.

Introduction

Atomic Force Microscopy (AFM) genereert een beeld van een oppervlak door het scannen van een gebied van het monster met een vrijdragende ligger met een zeer scherpe punt ^1. De beweging van de cantilever sondes het oppervlak topologie van het monster. AFM is op grote schaal toegepast om biologische moleculen - zoals eiwitten, DNA en membranen vanwege zijn veelzijdigheid analyseren gefixeerde monsters in lucht of bijna-natieve toestand in vloeibare ^2-5.

Afgezien van de hoge-resolutie beeldvorming vermogen in het nanobereik, de AFM cantilever werkt als een veer interactiekrachten (adhesie en afstoting) en mechanische eigenschappen van het monster ^5,6 sonde. Dit staat bekend als kracht spectroscopie. In deze modus wordt de eerste probe nadert het monster en een kracht uitoefent op, dan wordt teruggetrokken totdat het contact verliest met het monster (Figuur 1A). De gegenereerde curven kracht als functie van de afstand van de cantilever voor zowel appvoorn en intrekken. Verschillende eigenschappen inclusief de elasticiteitsmodulus de stijfheid van een materiaal te meten, en adhesie krachten kunnen worden afgeleid.

Ondersteunde lipide bilagen zijn biologische modelmembranen liggen boven op een vaste drager - gewoonlijk mica, borosilicaatglas, kwartsglas of geoxideerd silicium ^7. Ze worden bereid met behulp van verschillende technieken zoals blaasje depositie, Langmuir-Blodgett methode en de spin-coating ^8,9. AFM beeldvorming wordt gebruikt om de vorming van deze ondersteunde dubbellagen ¹⁰ volgen en sonde verschillende structuren gevormd door membranen met verschillende samenstellingen ^11-15.

Het uitvoeren van kracht spectroscopie op ondersteunde bilayers resulteert in een piek in de aanpak curve. Deze piek geeft de kracht nodig om de bilaag doorboren, en heet doorbraak kracht. De dubbellaag dikte kan ook worden gemeten met de krachtcurve ^6. De typische doorbraak kracht van dubbellagenrange tussen 1-50 nN ^6. Deze eigenschappen zijn afhankelijk van lipiden verpakking (vloeibare of gelfase) en structuur (acyl ketenlengte en mate van onverzadiging) en veranderd door membraan-actieve middelen ^16. De theorie achter de breuk is uitgelegd ¹⁷ en andere experimentele parameters zoals cantilever zachtheid, tip radius en aanpak van de snelheid ook van invloed op de doorbraak kracht ^15,16,18. Force spectroscopie werd gebruikt om de eigenschappen van verschillende lipide fasen ^11,19, preparaat-afhankelijke veranderingen ^12,20, en effecten van andere biomoleculen, zoals peptiden analyseren op de stabiliteit van het membraan ^21.

De vlakke oriëntatie ondersteunde bilagen voordelig te combineren AFM met andere methoden zoals oppervlakte plasmon resonantie ²² en fluorescentiemicroscopie ^11,19 beter te karakteriseren structuur en eigenschappen van de membranen.

Deze gedetailleerde video protocol is bedoeld om ondersteund lipidendubbellagen bereiden met behulp van blaasje afzetting en analyseren ze met de AFM en de kracht spectroscopie. Hoewel vesicles met verschillende grootte worden gebruikt om dubbellagen bereiden dit protocol is gericht op kleine en grote unilamellaire vesicles. Ondersteunde dubbellagen die fase scheiden in vloeibare besteld (L _o) en vloeibare ongeordende (L _d) fasen werden gekenmerkt ^11,15. Het membraan bestaat uit di-oleoyl-fosfatidylcholine (DOPC), sfingomyeline (SM), en cholesterol (Chol) en 2: 2: 1 ratio. Deze samenstelling modellen de lipide vlotten, die worden voorgesteld om zich te gedragen als platforms van belang voor eiwit mensenhandel en sorteren, cell signaling en andere cellulaire processen ^23,24.

Protocol

1. Voorbereiding van ondersteunde lipidendubbellagen (SLB) ^11,12,21

1. Voorbereiding van de lipidemengsel en Multilamellaire Vesicle Schorsingen
   1. Bereid de volgende buffers vooraf.
      1. Bereid PBS-buffer bij concentraties van 2,7 mM KCI, 1,5 mM KH _{2PO 4,} 8 mM Na ₂ HPO ₄ en 137 mM NaCl, pH 7,2.
      2. Bereid SLB (ondersteunde lipide dubbellaag) buffer bij concentraties van 150 mM NaCl, 10 mM HEPES, pH 7,4.
      3. Bereid een oplossing van 1 M _CaCl2.
   2. Los de volgende lipiden in chloroform in een gewenste concentratie: bijvoorbeeld di-oleoyl-fosfatidylcholine (DOPC) en 25 mg / ml, sfingomyeline (SM) en 25 mg / ml en cholesterol (Chol) en 10 mg / ml.
   3. Neem 18.38 ui DOPC, 17,10 pl SM en 11,30 pl Chol om een ​​oplossing met 1 mg totale lipiden in een 2 te: 2: 1 DOPC: SM: Chol molverhouding. Varieer de volumes dienovereenkomstig op basis van de concentrations van de bereide in 1.1.2 lipiden. Toch behouden de molaire verhouding van 2: 2: 1 DOPC: SM: Chol, het veranderen van de molaire verhouding van de fasekenmerken van het membraan ²⁵ te veranderen.
   4. Meng de oplossing volledig door vortexen. Voeg een fluorescerende kleurstof lipide 0.05 mol% wanneer men wenst de bilaag te visualiseren door een fluorescentiemicroscoop.
      Opmerking: De familie van lange-keten dialkylcarbocyanines, zoals deed, DII en DIO bestrijken een breed scala van golflengten en kan ideaal gebruikt worden om lipide membranen te labelen. Alternatief kan fluorescerend gemerkte lipiden, zoals rhodamine-fosfatidylethanolamine of BODIPY-cholesterol gebruikt. In ieder geval moet de concentratie van de kleurstof worden geoptimaliseerd afhankelijk van de instelling microscopie, rekening houdend dat hoge concentraties van de fluorofoor gebonden aan het lipide de lipide gedrag ¹⁹ kan veranderen.
   5. Droog het chloroform onder toepassing van N ₂ gas (of eventueel beschikbare inert gas zoals Ar en He).
   6. Verdere droog tHij lipide mengsel onder vacuum gedurende ten minste 1 uur.
      Opmerking: Als het opslaan van deze lipidemengsel, zuiveren lucht met inert gas _(N2, Ar of He) en bewaar bij -20 ° C. Aliquot overtollige lipiden-in-chloroform in kleine bruine flesjes. Droog ze op soortgelijke wijze als de lipide mengsel verplaatsen lucht met inert gas _(N2, Ar of He) en bewaar bij -20 ° C.
   7. Los de gedroogde lipiden in PBS buffer tot een concentratie van 10 mg / ml.
   8. Vortex het mengsel krachtig gedurende ongeveer 20 sec tot 1 min tot een troebele suspensie te krijgen, met multilamellaire blaasjes. Zorg ervoor dat de er geen lipidefilms vastzitten aan de wand van het flesje.
   9. Verdeel deze suspensie in 10 ul porties (1 mg lipide maakt 10 porties).
   10. Bewaar bij -20 ° C tot verder gebruik.
2. Bereiding van Unilamellaire Vesicles
   Opmerking: Verschillende maten van unilamellaire vesicles kunnen worden bereid met sonicatie werkwijze of extrusiewerkwijze. Sonicatie gebruikt sound energie aan het mengsel roeren en scheid de lagen van de multilamellaire suspensie. Dit wordt aangegeven door het opruimen van de wazige schorsing. Extrusie dwingt de multilamellaire blaasjes door een membraan filter te passeren met een bepaalde poriegrootte.
   1. Sonicatie Method
      1. Neem de 10 ul van multilamellaire lipide schorsingen en voeg 150 ul van SLB buffer.
      2. Breng het mengsel in kleine (2 ml) afgesloten glazen flesjes en afdichting met Parafilm.
      3. Ultrasone trillingen het mengsel bij kamertemperatuur in een badsonicator gedurende 10 minuten of totdat het duidelijk wordt op kleine unilamellaire vesicles (SUVs, dan 50 nm in diameter).
   2. Extrusie Method
      1. Neem de 10 ul van multilamellaire lipide schorsingen en voeg 150 ul van SLB buffer.
      2. Breng de suspensie in een cryogene buis.
      3. Bevries de lipidesuspensie door onderdompeling het cryogene buis gedurende een paar seconden in vloeibare stikstof.
      4. Ontdooi delipidesuspensie door onderdompeling het cryogene buis in een waterbad bij kamertemperatuur of 37 ° C gedurende enkele minuten. Herhaal de vries-dooi treden minstens 10 keer.
      5. Om de lipidesuspensie extruderen gebruik een polycarbonaat membraan met 200 nm poriegrootte (met poriegrootten zijn beschikbaar, zoals, 100 nm of 400 nm) en een commercieel extrudeerinrichting ^26.
         Opmerking: Momenteel zijn er twee extrusie apparaten in de handel verkrijgbaar: handmatig extruder is beschikbaar voor kleine volumes (200 pl tot enkele ml). In dit geval wordt het monster geëxtrudeerd door het membraan door handmatig indrukken van de suspensie heen en weer tussen twee spuiten. Afhankelijk van de fabrikant, zou lipide fracties moeten worden gecombineerd om minimum volume van de set-up te bereiken. Voor grotere volumes (tot 50 ml) meer geavanceerde apparaten worden gebruikt, waarin de suspensie wordt gedwongen door het polycarbonaatmembraan met gecomprimeerd gas. Set-up en de extrusie-omstandigheden kan volgens de mod te veranderenel. Raadpleeg de instructies van de fabrikant voor gebruik. Dit protocol betreft de handleiding extruder voor kleine volumes.
      6. Equilibreren de extruder in het water door het passeren van water door de extruder. Dompel het membraan in water.
      7. Plaats het membraan tussen de beide zuigers, assembleren het apparaat en equilibreren buffer door het passeren van de buffer door de extruder, van de ene spuit naar de andere. Deze stap maakt bovendien het testen van de leakiness van het systeem. Als het lekt, demonteren en weer opnieuw het veranderen van de membraan.
      8. Neem de lipidesuspensie via een spuit van de extruder ('vuile kant').
      9. Bevestig de spuit met de lipidesuspensie op een kamer en de lege injectiespuit op de tegenoverliggende kamer.
      10. Duw de spuit op een einde. Laat de oplossing door het membraan en in de tegenoverliggende injectiespuit. Dit is de 1 ^ste pass.
      11. Geef het door het membraan voor een totaal van 31 keer een dergelijkedat de oplossing terecht in de vijandelijke spuit ("clean side").
          Opmerking: Controleer het membraan na extruderen. Wanneer het was gebroken, vervolgens extrusiewerkwijze niet succesvol en moet worden herhaald.
      12. Leeg de spuit in een kleine buis. Grote unilamellaire vesikels (LUV's) zijn houdbaar 1-2 dagen als bij 4 ° C bewaard.
3. Voorbereiding van Mica en Coverslips
   1. Wash coverslips eerst in water en vervolgens in ethanol. Luchtdroog.
   2. Neem mica schijven en loslaten van de buitenste laag met plakband.
   3. Bevestig de mica schijf op het dekglaasje. Transparante optische lijmen zijn optimaal, zodat men de dubbellagen kunnen controleren met een fluorescentiemicroscoop.
   4. Bevestig plastic cylinders (2,5 cm buitendiameter, 2 cm binnendiameter en 0,5 cm hoogte) met optische lijm / vet. Zorg ervoor dat alles is afgesloten en dat er geen lekken zijn. Gebruik vet wanneer willen hergebruiken de cilinders omdat ze gemakkelijk kunnen worden losgemaakt van the dekglaasje en gewassen. De afmetingen van de plastic cilinder afhankelijk van de grootte van de AFM cantilever houder en moeten dienovereenkomstig worden aangepast.
4. Afzetting van Unilamellaire blaasjes op Solid Ondersteuning
   1. Pipet geheel liposoomoplossing direct op het mica. Voeg meer SLB buffer tot een volume van 300 pi te bereiken.
   2. Voeg 0,9 gl 1 M calciumchloride-oplossing tot een uiteindelijke concentratie van 3 mM Ca2 ⁺ bereiken.
   3. Incubeer bij 37 ° C gedurende 2 minuten en vervolgens bij 65 ° C gedurende ten minste 10 min. Bedek altijd de dubbellagen met buffer. Contact met bubbels lucht en lucht zal vernietigen. Tijdens incubatie voeg meer buffer eventueel name als incuberen bij hogere temperaturen.
      Opmerking: Incubatie temperatuur varieert afhankelijk van de lipidemengsels en fasen vereist. Incubatie van ten minste 10 minuten is nodig ondersteund bilagen vormen, maar kan langer zijn, afhankelijk van de temperatuur en samenstelling.
   4. Wassende bilaag met warm (65 ° C) SLB buffer 15-20 maal calcium en gefuseerde vesicles te verwijderen. Neem extra zorg tijdens de wasstappen om de bilaag onder buffer te houden en voorzichtig pipet de was- oplossing om te voorkomen dat het vernietigen van de bilaag.
   5. Cool ondersteund bilayers op kamertemperatuur voordat AFM metingen. Dit is nodig om de verschillende fasen van het membraan en minimaliseren thermische drift in het apparaat.

2. Atomic Force Microscopy Metingen ^11,12

1. Imaging
   Opmerking: Voer atoomkrachtmicroscopie beeldvorming in contact modus of tikken mode. Beeldondersteund bilagen in oplossing; niet mogelijk oplossing verdampen omdat dit de dubbellagen zal vernietigen. Zoals men zou werken met buffer, in acht nemen veiligheidsmaatregelen om ervoor te zorgen dat elke AFM deel is beschermd tegen gemorste vloeistoffen.
   1. Selecteer een zachte cantilever (onder 0,2 N / m veerconstante wordt geadviseerd) en monteer het aan tHij AFM. De keuze van de cantilever stijfheid is van cruciaal belang voor kracht spectroscopie (en dit zal later worden besproken).
   2. Monteer het monster op de AFM podium en ervoor te zorgen dat alle vibratie-isolatie modules zijn ingeschakeld. Wacht tenminste 15 min equilibreren en verminderen thermische drift van het systeem. Afhankelijk van de AFM set-up, kan tuning en imaging specificaties verschillen. Raadpleeg de handleiding van de fabrikant.
   3. Benader het monster met de AFM tip tot contact.
   4. Omdat lipide bilagen gewoonlijk 4 nm in lengte, met de Z-bereik van het instrument dat de hoogste z-resolutie (bijvoorbeeld 1,5 pm) zal geven.
   5. Selecteer een regio om de afbeelding. Om een ​​overzicht van de lipide bilaag, een 50 um x 50 urn of 25 urn x 25 urn regio zal een goed uitgangspunt om de afbeelding te krijgen. Als kleinere functies verschijnen, kan men het in kleinere gebieden (10 micrometer x 10 micrometer, of 2 micrometer x 2 pm). De keuze van het opnamegebied ook afhankelijk van de werkende range van de piëzo-elektrische scanner. Raadpleeg de handleiding voor dit instrument.
   6. Zoals dubbellagen zijn erg kwetsbaar, passen het setpoint van de AFM tip tijdens de beeldvorming om de kracht op minimum en correct voor thermische drift te houden, terwijl het contact met het monster. In contact modus, het minimaliseren van het setpoint. In de tapping mode, het maximaliseren van de setpoint.
   7. Proces beelden door het aanbrengen van elke scan lijn naar polynoom nivellering functies. Voer lijn verwijdering voor scans dat contact met het membraan met behulp van de eigen software van de AFM productiebedrijf verliezen.
2. Force Spectroscopie
   1. Kalibreren van de cantilever de instructies volgens het protocol van de fabrikant. Kalibratie kan de omzetting van het elektrische signaal van de fotodiodes kracht (Figuur 1B).
      1. Kalibreren de gevoeligheid van de tip om afbuiging als z-piëzo-beweging (in eenheden van lengte) te meten in plaats van het elektrisch signaal in Volt.
         Opmerking: AFM detecteert veranderingen in de vervorming van de cantilever met een laser gereflecteerd aan de achterkant van de cantilever. De laser bereikt een fotodiode die ruimtelijk de positie van de laserspot kan detecteren. Een verandering van de doorbuiging van de cantilever als het na contact met het monster buigt wordt gemeten door deze fotodiode als "verticale afbuiging", en dit in de eenheden van spanning. Aangezien de cantilever wordt verplaatst door de z-piëzo, wordt de vertikale afbuiging in verband met de beweging in de z-piëzo. De verhouding tussen de verticale doorbuiging en z-beweging gevoeligheid genoemd en zet spanning op afstand.
      2. Bereken de cantilever veerconstante met behulp van de thermische ruis frequentie methode, meestal opgenomen in het AFM software. In deze werkwijze plot de trillingsamplitude van lawaai wat betreft oscillatiefrequentie, waardoor een spectrale vermogensdichtheid plot. Dit perceel zal een piek rond de resonantiefrequentie te tonen. De frequentie waar de amplitude is de grootste is de resonantiefrequentie. Breng een Lorentziaanse functie rond de piek automatisch berekenen van de veerconstante van de software. Enkele nuttige middelen voor de theorie van de thermische ruis methode worden gegeven in de referenties ^27-30.
   2. Na het afbeelden van een gebied van de bilaag, selecteer een 5 urn x 5 urn gebied in de bilaag te dwingen spectroscopie.
   3. Stel de AFM, zodat het duurt kracht bochten in een 16 x 16 raster van die regio. Dit resulteert in 256 van kracht curves per regio. De ruimte tussen twee aangrenzende punten moet genoeg om te voorkomen dat het membraanoppervlak wordt gesondeerd met een punt samenvalt met het volgende punt. Dit is afhankelijk van de tip radius. Een 100 nm afstand tussen twee punten zou ideaal zijn. Verdeel de 5 micrometer x 5 micrometer regio in 16 x 16-raster. Afhankelijk van de grootte van de fase, kan men een kleiner of een groter gebied te selecteren en aan te passen de rastergrootte.
   4. Stel z-piëzo verplaatsing naar400 nm. Dit bepaalt het maximale bereik van de beweging van de z-piëzo. Het moet groot genoeg zijn om ervoor te zorgen dat de cantilever volledig verwijderd is teruggetrokken uit het monster tussen metingen.
   5. Stel aanpak snelheid tot 800 nm / sec en trek snelheid tot 200 nm / sec. Gebruik naderingssnelheid tussen 400 tot 6000 nm / sec afhankelijk van de bilaag samenstelling en lipidefase te bestuderen ^6,16.
   6. Na het instellen van alle parameters, te verwerven kracht bochten, door op de "run" knop van de AFM software.
   7. Sla kracht curves als kracht versus hoogte curves (een maat voor de z-piëzo-beweging). Dit houdt geen rekening met het buigen van de cantilever bij contact met het monster. Tijdens de verwerking van gegevens stap, de AFM software maakt correctie voor cantilever buigen tot kracht vs. tip-sample scheiding curves (figuur 1C), die de juiste waarden voor tweelaags dikte zal geven te krijgen. De correctiewaarden gebruikelijke wijze gedispergeerd in de kalibratie, die wordt opgeslagen met elke kracht curve. Bereken tip-sample scheiding door het aftrekken van de vertikale afbuiging van de piëzo beweging op een bepaald moment.
      Opmerking: De piek in de benadering krachtcurve (de krachtwaarde ondergaat zelfs als de cantilever beweging nog op de aanpak cyclus) is de doorbraak kracht van het membraan, terwijl het verschil tussen de positie van deze piek en de positie van het punt indien de kracht begint te stijgen weer geeft de dikte van het membraan.
   8. Verwerven van minstens 500 kracht curves voor elke voorwaarde om goede statistieken te krijgen. Maak een histogram van de waarden met behulp van programma's zoals Origin of MatLab, en passen de histogrammen een Gaussische verdeling naar de top en de breedte van de distributie te krijgen.

Results

Ondersteunde lipide bilagen samengesteld DOPC: SM: Chol (2: 2: 1) werden afgebeeld in AFM (figuur 2 AC). Door de lipidensamenstelling SM / Chol-rich _Lo en DOPC-rijke _Ld fasen waargenomen. De hoogte van het profiel van de AFM beeldvorming kan belangrijke informatie over het membraan structuur. Door naar het hoogteprofiel kan de dubbellaag dikte gemeten in aanwezigheid van defecten in het membraan (Figuur 2B) of het hoogteverschil tussen de L _o / _Ld

Discussion

SLBs samengesteld DOPC: SM: Chol (2: 2: 1) gevormd op mica na vesicle adsorptie en scheuren geïnduceerd door calciumchloride. Deze lipidepreparaat gescheiden in _Ld en L _o fasen. De _Lo fase verrijkt met cholesterol en sfingomyeline en is minder vloeibaar / viskeus (figuur 1A) dan _Ld fase ^11. De scheiding van _Lo van _Ld fase manifesteert als cirkelvormige structuren boven de omringende (Figuur 1B, C) ​​verhoogd. D...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine	Avanti Polar Lipids, Inc.	850375P	Komt als lyofilisaatpoeder in verzegelde flesjes. Los al het poeder op in chloroform bij opening. Bewaar extra als gedroogde lipidefilms, onder inert atmosfeer, bij -20 °C. Bezoek hier voor meer informatie over opslag en hantering.
Sphingomyeline (Brain, Porcine)	Avanti Polar Lipids, Inc.	860062P	Komt als lyofilisaatpoeder in grote verzegelde kunststof containers. Los een punt van de spatel van het poeder op in chloroform bij opening. Bewaar extra als gedroogde lipidefilms, onder inert atmosfeer, bij -20 °C. Bezoek hier voor meer informatie over opslag en hantering.
Cholesterol	Avanti Polar Lipids, Inc.	700000P	Komt als lyofilisaatpoeder in grote verzegelde kunststof containers. Los een punt van de spatel van het poeder op in chloroform bij opening. Bewaar extra als gedroogde lipidefilms, onder inert atmosfeer, bij -20 °C. Bezoek hier voor meer informatie over opslag en hantering.
Natriumchloride (NaCl), 99,8%	Carl Roth GmbH + Co. KG	9265.1
Kaliumchloride (KCl), 88%	Sigma	P9541
Natriumwaterstoffosfaat (Na2HPO4), >99%	AppliChem GmbH	A1046
Kaliumdiwaterstoffosfaat (KH2PO4), 99%	Carl Roth GmbH + Co. KG	3904.1
Calciumchloridedihydraat (CaCl2), moleculaire biologie kwaliteit	AppliChem GmbH	A4689
HEPES, moleculaire biologie kwaliteit	AppliChem GmbH	A3724
Glazen deksel, 24 x 60 mm, 1 mm dikte	Duran Group	2355036
Punch and Die Set	Precision Brand Products, Inc	40105
Optische lijm	Norland Products, Inc.	NOA 88	Vloeibare lijm die hard wordt wanneer uitgehard onder langgolf UV-licht.
[header]
Mica blokken	NSC Mica Exports Ltd.		Dit zijn mica stukken met minstens 1 vierkante inch oppervlakte en een dikte variërend van 0,006 inch tot 0,016 inch. Ze worden door het bedrijf op een specifieke maat gesneden voor verzending. Kleine mica schijven kunnen uit de mica blokken worden geponst met behulp van de punch and die set.  Behandel mica altijd met handschoenen of pincetten.
Laboratoriumapparatuurvet	Borer Chemie AG	Glisseal N
Liposomenextruder	Avestin	LiposoFast-Basic	Als alternatief kunt u ook kijken naar aanbiedingen van Northern Lipids, Inc.
Zelfklevende tape	3M	Scotch(R) Magic (TM) Tape 810 (1-inch)
Bath Sonicator	Bandelin Sonorex Digitec	DT-31	Geen verwarming, Frequentie: 35 kHz, Ultrasone piekuitgang: 160 W, HF-vermogen: 40 W. (Gegevensblad)
Silicionitride AFM Cantilever	Bruker AFM Probes	DNP-10	Elke cantilever heeft vier tips en hun nominale tipradius is 20 nm (met mogelijk maximum bij 60 nm). Op basis van de specificaties, gebruiken we tip D met een resonantiefrequentie van 18 kHz, en een nominale veerconstante van 0,06 N/m.
AFM	JPK	JPK Nanowizard II gemonteerd op Zeiss Axiovert 200