Spot de juiste Tissue Every Time in Multi-weefsel Blocks

Samenvatting

Het doel van het Specimen Orientation Tag (spot) is gefunctioneerd als leidraad ter te helpen bij individuele identificatie weefsel in meerdere weefsels paraffineblokken. Deze protocollen laten zien hoe dit is opgebouwd uit zachte, low-cost histologie materiaal en dient als een betrouwbare visuele marker in paraffineblokken en secties.

Samenvatting

Multi-tissue paraffineblokken een hoge doorvoer analyse van doelmatigheid experimentele uniformiteit en verminderde tijd en kosten. Weefsel microarrays vormen de meerderheid van de multi-weefsel paraffine blokken, maar in toenemende mate, zijn de onderzoekers met behulp van niet-array blokken met grotere weefsels uit meerdere personen, die veel van de voordelen van het weefsel microarrays kan verschaffen zonder aanzienlijke investeringen in de planning en uitrusting. Een essentieel onderdeel van een multi-weefsel analyse is de oriëntatie methode voor elke afzonderlijke weefsel identificeren. Hoewel methoden bestaan ​​om de juiste oriëntatie en het identificeren van weefsels in multi-weefselblokken handhaven meeste zijn niet goed geschikt voor niet-array blokken, kan waardevolle ruimte consumeren in een matrix en / of moeilijk te produceren in de standaard histologische laboratoria. Het Specimen Orientation Tag (spot) is een eenvoudige, goedkope oriëntatie instrument dat is duidelijk zichtbaar in paraffine blokken en alle weefselcoupes for betrouwbaar specimen identificatie in arrayed en non-array layouts. De spot verschaft voordelen boven bestaande oriëntatiemethoden voor niet array blokken als er geen directe wijziging van het weefsel vereisen en maakt flexibiliteit in de regeling van stukken weefsel.

Inleiding

De mogelijkheid om weefselmonsters van verschillende individuen te bedden in een paraffineblok het eenvoudig side-by-side vergelijking tussen behandelingen en individuen, elimineert variabiliteit tussen dia en vermindert de kosten en de werkbelasting van snijden en vlekken specimens. Deze multi-weefselblokken worden typisch bereid als hetzij tissue microarray (TMA) of paraffineblokken die weefsel van meerdere personen in een niet array layout. Onderhoud monster identiteit is cruciaal voor het succes van een multi-weefselanalyse. De onderzoekers zijn met behulp van TMA's, omdat hun ontwikkeling om de efficiëntie van de analyse te verbeteren, variatie te verminderen tussen dia's, sparen waardevolle middelen weefsel, en het verminderen van de tijd en de kosten van de experimenten ^1. Correcte oriëntatie van TMA kan worden uitgevoerd met verschillende methoden, zoals spaties, rijen of kolommen tussen weefselkernen ^2-4, asymmetrische opstelling van kerngroepen ^{3, 5} (bijvoorbeeld control versus behandeling), "baken" kernen ⁶ en aangewezen oriëntatie kernen buiten de TMA matrix ³ gevestigd. Hoewel deze methoden goed werken voor TMA's, de meeste verbruikt waardevolle TMA kern ruimte en TMA's met lacunes en ruimten als identifiers verwarrend kan worden als weefsel kernen zijn uitgeput na verloop van tijd. Bovendien zijn deze werkwijzen niet geschikt voor gebruik in multi-weefselblokken zonder matrix format omdat ze vertrouwen op afwijkingen in de strak gelast patroon van uniforme microarray kernen als id. De meeste niet-array multi-weefsel blokken moeten geschikt niet-uniforme weefsels en, per definitie, niet de gestructureerde matrix raster dat maakt deze afwijkingen opvallen als oriëntatiepunten niet weergegeven.

Hoewel er vele voordelen aan het gebruik van een TMA, een van de grootste nadelen is de geringe omvang van de kernen die niet altijd representatief mate heterogeen weefsel ^1. Non-array multi-weefsel blokken bieden veel van tHij profiteert van een TMA, maar bevatten grotere weefselmonsters, of hele organen uit dierproeven. Tissue microarrays gebruikt enkele kernen variëren overeenstemming met hele weefselsecties basis van het eiwit van interesse en vele vereisen meerdere kernen voor extra concordantie ^7-11. Vanwege de complexiteit en heterogeniteit van enkele biomarker fenotypes, TMA gebruikt zelfs grote aantallen geleiders (> 10) nog onvoldoende zijn en kunnen andere dan microarrays for analysis ⁸ vereisen. Bovendien, TMA constructie is tijdrovend, technisch veeleisende en vereist de initiële kosten en investeringen in of toegang tot een tissue Arrayer. Non-array meerdere weefselblokken kan geschieden in basisch laboratorium met aanzienlijk minder tijd en moeite en is een alternatief voor studies die meer weefsel vereisen dan arrays toestaan ​​of als middel om kosten te besparen en te vereenvoudigen analyse.

Non-array multi-weefsel blokken op dezelfde vereisen een betrouwbaar ofientation marker voor monsteridentificatie sporen echter de ontwikkeling van deze merkers is beperkt. In de literatuur beschreven weefseloriëntatiedetectoren gericht op juiste fysiologische richting voor het inbedden afzonderlijke stukken weefsel, zoals het weefsel tatoeage inkt ^12, pre-inbedding weefsels in agar-gelatine voorafgaand aan de verwerking ¹³ en markering bepaalde weefsels van inkepingen ¹⁴ of ¹⁵ hechtingen . Hoewel functioneel zijn deze werkwijzen niet geschikt als markers in multi-weefselblokken vanwege hun beperkingen. Een hechting zal snel worden gesegmenteerd door en mogelijk niet zichtbaar in elk deel zijn. Pre-inbedding technieken met behulp agar-gelatine kan het weefsel in de juiste oriëntatie tijdens de verwerking inbedden houden, maar biedt geen visuele aanwijzing om onderscheid te maken tussen meerdere monsters in paraffine blokken en glijbanen. Inkepingen of kleurstof op het weefsel kan analyse bemoeilijken of af te sluiten belangrijke morfologische details. Als alternatief weefsel identiteitin een niet-array meerdere weefselblokje kan worden gehandhaafd door middel van het inbedden van weefselstukken in een asymmetrische rangschikking, maar dit vereist 3 of meer weefselstukken en wellicht niet toelaat optimale plaatsing van weefsels voor analyse.

Het Specimen Orientation Tag (spot) is ontwikkeld als een gemakkelijke en goedkope methode om weefsels in multi-weefsel blokken duidelijk te identificeren en biedt vele voordelen ten opzichte van bestaande oriëntatie methoden. De plek is een kleine, kleurrijke, kern bestaat uit Hydroxyethyl agarose verwerking gel en weefsel markering kleurstof, en geïnfiltreerd met paraffine (figuur 2C). De plek kern is ingesloten op het einde naast een enkele weefsel in een multi-tissue paraffineblok en verschijnt als een helder gekleurde stip in het blok en in elke sectie (Figuur 1A - D), duidelijke vermelding van de juiste oriëntatie van het blok en secties voor eenvoudige weefsel identificatie.

Protocol

1. De bouw van The Spot

1. Voeg 50 mg van runderserumalbumine (BSA) tot 1 ml weefsel markeerinrichting kleurstof in een 15 ml conische buis of 2 ml microcentrifugebuis en vortex gedurende 1 minuut of totdat het volledig opgelost.
   Opmerking: Voor dit protocol, gebruiken biochemische Grade BSA. Terwijl andere kwaliteiten en zuiverheid zijn niet getest, wordt verwacht dat de kwaliteit en zuiverheid van een significante invloed op het succes van de locatie, niet zou hebben.
2. Verwarm 9 ml hydroxyethyl agarose gel verwerking in een 15 ml conische buis in een magnetron bij 30% vermogen gedurende 10 seconden stappen totdat de gel volledig gesmolten.
3. Combineer de gesmolten verwerking gel en dye-BSA-oplossing in een enkele 15 ml conische buis en meng met een pipet. Vortex de oplossing.
4. Plaats de conische buis in een koelkast gedurende enkele uren of tot vaste stof.
5. Gebruik een lange, dunne, metalen spatel of een sonde naar de gekleurde gel stekker voorzichtig los te maken van de conische buis.
6. Gebruik een scalpel of scheermesje om cut de gel stekker dwars in 5 mm dikke secties. Verwijder de afgeronde uiteinden en afvoeren als afval (Figuur 2A).
7. Plaats de gel plug secties flat in histologie cassettes en houdt in 70% ethanol gedurende 1 uur. Wijzig de 70% ethanoloplossing elke 2-4 uur gedurende ten minste 3 verandert gedurende een 24 uurs periode.
8. Handmatig verwerken gel doorsneden door een ethanol reeks (1 hr st: 70% ethanol, 80% ethanol, 95% ethanol, 100% ethanol (3x verandert), dan duidelijk clearingoplossing 3x gedurende 1 uur elk (bijvoorbeeld alifatische koolwaterstoffen ( xylenen plaatsvervanger)) werden gebruikt in dit protocol, xylenen zijn ook aanvaardbaar) en infiltreren met gesmolten paraffine (3x gedurende 1 uur elk), handmatig of in een weefsel verwerker.
   Opmerking: Alvorens volledige dehydratie in 100% ethanol, kan de kleurstof lekken uit de gel plug die invloed kunnen andere weefsels en vloeibare reagentia in een geautomatiseerd weefselprocessor. Als zodanig handmatige rehydratie sterk wordt echter aangeraden geautomatiseerde verwerking equbondgenoot effectief.
9. Insluiten meerdere verwerkte gel secties met behulp van standaard paraffine inbedding methodiek (Figuur 2B). Laat blokken afkoelen en uitharden en vervolgens op kamertemperatuur komen.
10. Gebruik een dermal punch naald van de gewenste grootte te spotten kernen van de ingesloten gel secties te verwijderen totdat het blok is uitgeput (figuur 2C). Een enkel blok kan voorzien in tot 20 x 2 mm ² cores. Bewaar de kernen in een koele omgeving. Gebruik dermal punch in dit protocol zie figuren, een 1,5 mm (figuren 1D en 2D) of een 2 mm (figuren 1B, 1C en 2C).

2. Met behulp van plekken om Orient Non-gekleed Blocks

1. Een weefseloriëntatiedetectoren schema om de gewenste locaties en identiteiten van alle afzonderlijke stukken weefsel samen worden ingebed, en de locatie van de lokaties aan te geven.
   OPMERKING: Het weefsel oriëntatie diagram is een geïllustreerde kaart die de p omvathysical locaties van alle weefselstukken gelabeld met identifiers en de locatie van de plek. Het kan elektronisch worden gemaakt of kan met de hand getekend zijn. Het diagram moet worden gecreëerd met behulp van welke methode het beste past bij de technicus en onderzoeker die het eindproduct. Deze kaart zal als de gids voor de onderzoeker te dienen, zodat de monsters gemakkelijk geïdentificeerd kunnen worden tijdens de microscopische analyse. De kaart gebruikt in dit protocol werd met de hand getekend. Het schildert een tissue blok en glas microscoop dia met elk stukje weefsel en The Spot getrokken en geëtiketteerd in dezelfde positie als de werkelijke weefsel blok en glijbaan.
2. Verwerk de stukjes weefsel normaal, ervoor te zorgen dat ze goed blijven geïdentificeerd gedurende de brutowinst en verwerking stappen. Voor dit protocol verwerkt de weefsels gedurende 1 uur elk in: 70% ethanol, 80% ethanol, 95% ethanol, 100% ethanol (x3 verandert), alifatische koolwaterstoffen (xylenen plaatsvervanger) (x3 verandert) en gesmolten weefselinfiltratie paraffine bij 60 ° C (x3 wijzigingen).
   LET OP: All weefsels moeten worden verwerkt volgende standaard histologie laboratorium procedures. Dit kan variabele te wijten zijn aan de individuele laboratorium procedure, tissue grootte en type, maar dit zal niet van invloed op de mogelijkheid om ter plaatse te gebruiken als oriëntatie tool.
3. Regelen weefsel stukken op de inbedding station in de juiste locaties toegewezen volgens weefseloriëntatiedetectoren diagram. Gebruik het weefsel oriëntatie diagram als een verwijzing naar de technicus over hoe naar de plek en weefsel stukken in elk blok regelen begeleiden.
   Opmerking: In dit protocol zet de inbedding technicus de hand getekende oriëntatie map naast de inbedding station en regelde de stukken weefsel op de inbedding station in precies dezelfde opstelling zoals getekend in het schema. Alleen in dat geval blijven weefselstukken correct geïdentificeerd in het eindproduct. Dit is van cruciaal belang voor het succesvol gebruik van multi-weefselblokken.
4. Zorg ervoor dat de SPOT-kern is groter dan alle stukken weefsel worden ingebed in het blok.
5. Insluiten het weefsel stukken en vervolgens de plaats op einde (dwars) op de juiste locaties volgens het weefsel oriëntatie diagram met behulp van standaard inbedding methodologie. Als dat nodig is, houdt u de Spot (s) rechtop met een tang totdat de paraffine genoeg dat de plek (s) niet zullen omvallen (1-2 min) is gestold.
6. Sectie en vlek paraffinecoupes met ter plaatse met behulp van standaard methodologie.
   1. Laat de secties te drijven op een waterbad bij 40 ° C en gehecht aan een positief geladen glasplaatje (geladen objectglaasjes niet getest). Droog de objectglaasjes in een droogoven bij 60 ° C gedurende ten minste 20 min.
   2. Plaats de objectglaasjes in een automatische stainer en verwerkt via de volgende reagentia: xyleen (xylenen 1-5 min, xylenen 2 en 3-2 min elk), 100% ethanol (2 min), 95% ethanol (1 min), 80 % ethanol (30 sec), 70% ethanol (30 sec), stromend water (2 min), hematoxyline (1,5 min), stromend water (3 min), zuur alcohol (1 min), stromend water (2 min ), bluing reagens (1 min), stromend water (2 min), 80% ethanol (30 sec), eosine (1 min), stromend water (10 sec), 80% ethanol (1 min), 100% ethanol (3 verandert, 2 min elk), xyleen (3 veranderingen, 30 seconden elk).
   3. Bedek de dia's met dekglaasjes, gemonteerd met montage medium.
      NB: In dit protocol, de histotechnician doorsnede de paraffine blokken op een microtoom in 5 micrometer secties. Hiervoor protocol gebruikten we een automatische stainer echter gelijke resultaten kunnen worden verkregen via handmatige kleuring.

3. plek in TMA's (Manual TMA Kit)

1. Maak een tissue oriëntatie schema, zoals beschreven in 2.1 en wijs de gewenste locatie (s) van The Spot.
2. Vul het TMA mal met gesmolten paraffine op een inbedding station. Omdat de mal is koeling, insluiten ter plaatse (s) op het einde in de marge van de TMA mal op de gewenste locaties aangegeven door het weefsel oriëntatie diagram. Als dat nodig is, houdt u de Spot (s) rechtop met een tang totdat de paraffine has gestold genoeg dat de plek (s) niet zullen omvallen (1-2 min).
3. Monteer de TMA kernen volgens de aanwijzingen van de fabrikant en met betrekking tot de locatie van de spot (en) in de matrix marges (figuur 2D) en de standaardprocedures snijden en kleuringsprotocollen.
   OPMERKING: Zie stap 2.6 op het snijden en vlekken methoden die worden gebruikt in dit protocol te zien.

Resultaten

De plek verschijnt als een ronde, helder gekleurde stip in het paraffine blok (figuur 1A en 2D), in alle paraffine secties, en blijft op het glaasje door de H & E en IHC kleuring procedure (figuren 1B - 1D en 2D). Deze duidelijke visuele hint hulpmiddelen zowel histotechnician en onderzoeker om elke afzonderlijke stuk weefsel en vergemakkelijkt de communicatie histotechnician kan deze visueel waarschuwingssignaal de opstelling van d...

Discussie

Succesvolle voorbereiding en het gebruik van de vlekken vereist een zorgvuldige naleving van enkele technische stappen. Het smelten van de hydroxyethyl agarose moet langzaam en op een laag vuur worden gedaan. Snel smelten bij hoge temperatuur kan leiden tot enige afbraak van de agarose minder dan optimale resultaten. Bij het snijden van de kleurstof beladen pluggen in stukken verwerkt, opdat de dikte van elk stuk groter is dan 4,5 mm en niet meer dan 7 mm. De afgeronde einden verwijderd als afval zij niet uniform 5 mm d...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Histogel Specimen Processing Gel	Thermo Scientific	HG-4000-012	http://www.thermoscientific.com/en/product/richard-allan-scientific-histogel-specimen-processing-gel.html
Tissue Marking Dye	Triangle Biomedical Sciences, Inc.	TMD-5	Elke weefselmarkeerverf zou waarschijnlijk voldoende zijn.
Arraymold Kit A 2 mm (60 core)	Arraymold	20015A	Elke handmatige weefselarrayer zou op dezelfde manier werken.