Een model van heterotope ossificatie voor Achilles-tenotomie en brandwonden maakt betrouwbaar onderzoek mogelijk naar door trauma geïnduceerde ectopische botvorming zonder de toepassing van exogene factoren.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Direct Mouse Trauma / Burn Model van heterotope botvorming
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Heterotope ossificatie (HO) is de vorming van bot buiten het skelet die ontstaat na ernstig trauma, brandwonden en orthopedische chirurgische ingrepen. De meeste diermodellen die worden gebruikt om HO te bestuderen zijn afhankelijk van de toepassing van exogene substanties, zoals botmorfogenetisch eiwit (BMP), exogene celconstructies of genetische mutaties in BMP-signalering. Hoewel deze modellen nuttig zijn, reproduceren ze niet nauwkeurig de inflammatoire toestanden die de meeste gevallen van HO veroorzaken. Hier beschrijven we een brandwond/tenotomie-model bij muizen dat betrouwbaar gefocuste HO produceert. Dit protocol omvat het creëren van een 30% contactbrandwond met gedeeltelijke dikte op de dorsale huid en het verdelen van de achillespees op het middelpunt. Het vertrouwen op traumatische verwondingen alleen om HO op een voorspelbare locatie te induceren, maakt een tijdsverloopstudie mogelijk van endochondrale heterotope botvorming door alleen intrinsieke fysiologische processen en omgeving. Deze methode kan instrumenteel zijn in het begrijpen van de inflammatoire en osteogene paden die betrokken zijn bij trauma-geïnduceerde HO. Bovendien, omdat HO zich op een voorspelbare locatie en in een tijdsverloop in dit model ontwikkelt, maakt het onderzoek mogelijk om vroege beeldvormingsstrategieën en behandelingsmodaliteiten te verbeteren om HO-vorming te voorkomen.
Inleiding
Heterotope ossificatie (HO) is de vorming van ectoop bot waarbij osteopotente cellen abnormaal worden geïnduceerd om endochondraal bot buiten het skelet te vormen. Hoewel de details van de HO-vormingsroute nog grotendeels onbekend zijn, omvat een geaccepteerd paradigma drie sleutelfactoren: een ontstekingsveroorzakend incident, een permissieve omgeving en mesenchymale stamcellen die bot kunnen vormen.1-3 HO is een veelvoorkomende comorbiditeit die meer dan 60% van de ernstige brandwonden, 65% van oorlogsgerelateerde verwondingen en 10% van invasieve orthopedische chirurgische gevallen compliceert.4,5 Het is echter vaak moeilijk te voorspellen waar HO zal ontstaan omdat het kan optreden op plaatsen van lokale verwondingen of op afstand gelegen plaatsen die anders ongedeerd zouden kunnen zijn. Deze variabiliteit in locatie maakt het moeilijk om profylactisch in te grijpen om reactieve botvorming op een lokaal gericht manier te voorkomen. Er zijn ook aangeboren vormen van HO zoals fibrodysplasia ossificans progressiva (FOP) waarbij patiënten vatbaar zijn voor de ontwikkeling van robuuste HO als reactie op lichte trauma of een ontstekingsstoot. Krachtige diermodellen met behulp van transgene muizen hebben dit fenotype gereproduceerd en inzicht gegeven in de moleculaire routes die ook belangrijk kunnen zijn bij trauma-geïnduceerde HO.6-9 Translationeel onderzoek naar de pathogenese van niet-aangeboren HO heeft een breed scala aan constructies gebruikt, variërend van verwondingen alleen tot de implantatie van exogene bot-inducerende materialen en/of cellen.10-13
In ons eerdere werk hebben we een eenvoudig en betrouwbaar model van HO-vorming bij muizen gevalideerd dat geen toediening van exogeen materiaal vereist.14-17 Dit model creëerde twee belangrijke omstandigheden om HO te initiëren: lokaal trauma en wereldwijde ontsteking. Dit werd bereikt door het gebruik van een Achillespeesdoorsnede (lokaal trauma) gecombineerd met een verre brandwond (wereldwijde ontsteking). Muizen ontvingen beide behandelingen gelijktijdig en het bleek dat ze een robuuste hoeveelheid HO ontwikkelden die kon worden geanalyseerd door histologische, radiologische en moleculaire middelen. Interessant genoeg verhoogde een gelijktijdige brandwond aanzienlijk de hoeveelheid HO die werd gevormd en versnelde het ontwikkelingsverloop.14-16 HO ontwikkelde zich op voorspelbare plaatsen rond het calcaneus, de enkelgewricht en de tibia/fibula van de ledemaat die de peesdoorsnede onderging. De betrouwbaarheid van HO-ontwikkeling op een bekende locatie maakte een gefocuste onderzoeking van moleculaire en histologische kenmerken in de vroege stadia van ectopische ossificatie mogelijk.14,17 Tot nu toe heeft 100% van de muizen (meer dan 50 dieren) met een peesdoorsnede en een gelijktijdige brandwond HO ontwikkeld. Bovendien werden longitudinale 2D en 3D beeldvorming en spectroscopische analyses uitgevoerd om het groeipatroon en de biochemische samenstelling van HO te onderzoeken.15,16
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Ethics statement: Achtste editie van het Instituut voor Laboratory Animal Research (ILAR, 2011) en waren: Alle dierlijke procedures werden uitgevoerd in strikte overeenstemming met de goede praktijken dier, zoals gedefinieerd in de richtlijnen in de Gids voor het gebruik en onderhoud van proefdieren uitgevoerd goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite van de Universiteit van Michigan (PRO0001553).
1. Mouse Surgical Procedures
OPMERKING: Gebruik 8-10 week oud C57BL / 6 muizen. Andere leeftijden, achtergronden en muizenstammen kunnen worden gebruikt om verschillende aandoeningen of genetische make-up testen. Voor de tenotomie deel van de procedure, onderhouden steriele omstandigheden met behulp van een gezichtsmasker, haar motorkap, en steriele toga, handschoenen en instrumenten. Chirurgische sites moeten steriel worden bereid met povidonjood en steriel draperen. Vermijd hypothermie met een veterinair verwarmingselement en opwarming reanimatie tot 37 ° C vóór Toedieningtie.
- Verdoven van de muis met behulp van 2,5% geïnhaleerde isofluraan. Gebruik een neuskegel op het dorsale gedeelte en de achterste ledematen gemakkelijk toegankelijk te verlaten. Pas de snelheid van isofluraan toediening aan de juiste ademhaling en de verkleuring van de slijmvliezen te handhaven en anesthesie te verzekeren door het controleren van de spierspanning, teen knijpen en cornea reflex. Breng saai oogzalf voor de ogen van de muis om droge oogletsel tijdens de procedure te voorkomen. Handhaaf adequate lichaamstemperatuur met behulp van een veterinaire verwarming pad of warm water circulatiepomp onder het chirurgische veld.
- Dien buprenorfine, 0,1 mg / kg, subcutaan onmiddellijk voorafgaand aan chirurgie voor analgesie.
- Nauw scheren de chirurgische site op de linker achterpoot met clippers van de hiel tot de knie.
- Nauw scheren het dorsum van de muis, beginnend op de wervelkolom en het geschoren gebied op links van de dorsale middellijn, clearing een ten minste 2 cm x 3 cm aan de brandwond tegemoet.
- Bereid de operatieplaats, waaronder de achterpoot om de knie met behulp 3 alternerende povidonjood scrubs.
- Voer een longitudinale incisie langs de mediale zijde van de linker achillespees. Verleng de incisie, zodat de achillespees gemakkelijk kan worden gevisualiseerd; ongeveer 0,5 cm.
- Voer een Achilles tenotomie met scherpe dissectie van de pees op het middelpunt met scherpe weefsel schaar. Steek een mes van het weefsel schaar in het weefsel vlak onder de pees en ontleden langs het vlak tot het mes is op de pees middelpunt. Sluit de schaarbladen de pees scherp verbreken.
OPMERKING: Zorg ervoor dat integratie van alle posterieure pezen waaronder Gastrocnemius, Soleus en plantaris pezen. - Bereiken hemostase door het toepassen van druk met een steriel gaasje (er moet minimaal bloeden zijn) en sluit de huid incisie met een 5-0 vicryl steek.
- Voer de dorsale gedeeltelijke dikte brandwonden met een aluminium blok met een gewicht van 35 g met geschatte measurements 2 cm x 2 cm x 3 cm verhit tot 60 ° C in een waterbad aangebracht op het geschoren dorsum van muis voor 17 sec.
OPMERKING: Bereik de juiste brandwond diepte door te rusten blok bovenop de verdoofde muis, zodat het gehele oppervlak van het blok in contact met de muis echter voorkomen dat er enige extra druk aan het blok, dat wil zeggen, laat de zwaartekracht te de enige kracht die het blok op zijn plaats. Een dunne plastic handvat bevestigd aan één kant van het blok is geschikt voor het manipuleren, stabilisatie en het ophalen van warm waterbad. Dit zal leiden tot een ongeveer 30% totale lichaamsoppervlak verbrand in een 8-10 weken oude C57BL / 6 muis. Dit contact brandwond is verkozen boven andere methoden (vlam en brand branden) vanwege de uniformiteit van brandwond diepte over de wond en de reproduceerbaarheid tussen dieren. - Droog de brandwond site met gaas en een Tegaderm dressing toepassen.
- Dien opgewarmd reanimatie vloeistoffen: Ringerlactaat's oplossing 1 mlintraperitoneale injectie en 0,5 ml subcutane injectie. Deze eenmalige toediening van reanimatie is geschikt voor het herstel van de brandwond en tenotomie.
OPMERKING: niet verdoofde muizen individueel terug naar huis kooien met andere muizen, huis in schone kooien onder controle totdat muizen volledig hersteld. Typische herstel optreedt binnen 1-6 uur. Burn-sites meestal genezen binnen 2-4 weken en worden zelden gecompliceerd door wondinfectie indien bewaard in schone woonmilieus. - Dien Buprenorfine 0,1 mg / kg subcutaan elke 12 uur gedurende 3 dagen na de procedure. Monitor HO groei met seriële μCT scans op geschikte tijdstippen. Buitenbaarmoederlijke botgroei is eerst duidelijk ongeveer 3 weken na de operatie door μCT.
OPMERKING: De meeste HO ontwikkeling voltooid door 9 weken na de operatie. We hebben niet een verschil in HO volume of locatie met herhaalde μCT waargenomen scans tweewekelijkse voor 15 weken in vergelijking met een enkel eindpunt μCT scan bij 15 weken.Aan het eind van de experimenten euthanize alle muizen met CO 2 inhalatie volgens de institutionele richtlijnen en controleren dood met cervicale dislocatie na 10 min.
2. μCT Verwerving en Analyse
- Bevestig de verdoofde muis op de scanner bed in buikligging. Tape de achterste ledematen stevig aan het bed om te voorkomen dat de ademhaling beweging artefact. Neem de lucht, water en hydroxyapatiet met fantoom onder de muis voor het kalibreren.
- Open Bone Analysis software en definieert een gebied van belang (ROI) beide achterpoten van het heupgewricht omvat proximaal tot het uiteinde van de achterpoot distaal. Het verkrijgen van een afbeelding met behulp van de volgende parameters:. 80 kV, 500 uA en 1300 msec blootstelling, 48 micrometer voxelgrootte 14,15
- Kalibreer het beeld aan Hounsfield eenheden (HU) uit door een ROI in elk van de drie kamers fantoom en het invoeren van de gemiddelde dichtheid in de juiste velden inde software.
- Met behulp van de "grabber" tool in de software, re-oriënteren het beeld, zodat het scheenbeen van de linker achterpoot is parallel langs de Z-as naar de duidelijkste anatomische weergave voor de afbakening van orthotope corticale botstructuren en HO mogelijk te maken.
- Beginnend bij de knie, bladert distaal door het beeld plakken totdat HO wordt aangetroffen. Met behulp van de handleiding spline tool, maak een ROI rond de buitenbaarmoederlijke bot op elke 5e slice voortzetting distaal door de poot of totdat HO is overtroffen. Gebruik het extrapoleren tool om uit te breiden en steek de ROI samen in een ROI dat alle HO bevat.
- Maak een 3D ROI en kies de analyse menu. Bereken het volume bot door het instellen van de onderste en bovenste drempelwaarden die het beste laten zien het bot venster. Met dezelfde vaste drempelwaarden voor alle scans.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
In deze studie wordt het protocol beschreven voor de eerder gepubliceerde muismodel van trauma / branden veroorzaakte HO. 14-17 Dit omvat de oprichting van gelijktijdige gelokaliseerde bewegingsapparaat letsel met een Achilles tenotomie en wereldwijde inflammatoire belediging met een gedeeltelijke dikte brandwonden. Dit leidt tot een betrouwbare vorming van reactieve bot op de tenotomie site die kan worden gevolgd door seriële imaging. Tot op heden zijn alle muizen (meer dan 50) die beide Achilles tenotomie h...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Heterotope ossificatie vertegenwoordigt een ernstige functionele beperking voor patiënten die trauma, brandwonden en invasieve musculoskeletale procedures hebben overleefd. De meest risicovolle populatie bestaat uit soldaten in moderne conflicten met ernstige explosiewonden door mechanismen zoals geïmproviseerde explosieve apparaten (IED).18 Verbeterde beschermende kleding en vooruitgeschoven medische eenheden zorgen voor een betere overleving bij ernstige ledemaatletsel. Na de initiële stabilisatie en reparat...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen
Dankbetuigingen
We danken Amanda Fair, de CMI, en Kathy Sweet en de ORL bij UM voor hun hulp met µCT beeldvorming en analyse. Financiering: BL Gefinancierd door 1K08GM109105-01 en Plastic Surgery Foundation National Endowment Award.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| C57BL/6 muizen | Jackson Laboratory | 664 | 8-10 weken oud |
| Isofluraan – Fluriso | VET een, Boise, ID | V1 501017 | |
| Buprenorfine – Buprenex | Reckitt Benckiser Healthcare | NDC 12496-0757-1 | 0,3 mg/ml oplossing |
| Betadine | Owens en Minor, Mechanicsville, VA | 2047PVP202 | |
| 5-0 Vicryl hechtdraden | Ethicon, Summerville, NJ | J493 | |
| Tegaderm Film, 6 cm x 7 cm | 3M | 1624W | Doorgesneden om brandwond goed te bedekken |
| µCT - GE eXplore Locus SP | GE Healthcare Pre-Clinical Imaging, London, ON, Canada | ||
| Microview 2.2 Geavanceerde Botenanalyse Toepassing | GE Healthcare Pre-Clinical Imaging, London, ON, Canada |
Referenties
- Leblanc, E., et al. BMP-9-induced muscle heterotopic ossification requires changes to the skeletal muscle microenvironment. J Bone Miner Res. 26 (6), 1166-1177 (2011).
- Shore, E. M. Osteoinductive signals and heterotopic ossification. J Bone Miner Res. 26 (6), 1163-1165 (2011).
- Wosczyna, M. N., Biswas, A. A., Cogswell, C. A., Goldhamer, D. J. Multipotent progenitors resident in the skeletal muscle interstitium exhibit robust BMP-dependent osteogenic activity and mediate heterotopic ossification. J Bone Miner Res. 27 (5), 1004-1017 (2012).
- Potter, B. K., et al. Heterotopic ossification following combat-related trauma. J Bone Joint Surg Am. 92, Suppl 2. 74-89 (2010).
- Van den Bossche, L., Vanderstraeten, G. Heterotopic ossification: a review. J Rehabil Med. 37 (3), 129-136 (2005).
- Chakkalakal, S. A., et al. An Acvr1 R206H knock-in mouse has fibrodysplasia ossificans progressiva. J Bone Miner Res. 27 (8), 1746-1756 (2012).
- Yu, P. B., et al. BMP type I receptor inhibition reduces heterotopic [corrected] ossification. Nat Med. 14 (12), 1363-1369 (2008).
- Culbert, A. L., et al. Alk2 regulates early chondrogenic fate in fibrodysplasia ossificans progressiva heterotopic endochondral ossification. Stem Cells. 32 (5), 1289-1300 (2014).
- Dinther, M., et al. ALK2 R206H mutation linked to fibrodysplasia ossificans progressiva confers constitutive activity to the BMP type I receptor and sensitizes mesenchymal cells to BMP-induced osteoblast differentiation and bone formation. J Bone Miner Res. 25 (6), 1208-1215 (1359).
- Peterson, J. R., et al. Burn injury enhances bone formation in heterotopic ossification model. Ann Surg. 259 (5), 993-998 (2014).
- Scott, M. A., et al. Brief review of models of ectopic bone formation. Stem Cells Dev. 21 (5), 655-667 (2012).
- Tannous, O., Griffith, C., O'Toole, R. V., Pellegrini, V. D. Heterotopic ossification after extremity blast amputation in a Sprague-Dawley rat animal model. J Orthop Trauma. 25 (8), 506-510 (2011).
- Tannous, O., et al. Heterotopic bone formation about the hip undergoes endochondral ossification: a rabbit model. Clin Orthop Relat Res. 471 (5), 1584-1592 (2013).
- Peterson, J. R., et al. Treatment of heterotopic ossification through remote ATP hydrolysis. Sci Transl Med. 6 (255), 255ra132(2014).
- Peterson, J. R., et al. Early detection of burn induced heterotopic ossification using transcutaneous Raman spectroscopy. Bone. 54 (1), 28-34 (2013).
- Perosky, J. E., et al. Early detection of heterotopic ossification using near-infrared optical imaging reveals dynamic turnover and progression of mineralization following Achilles tenotomy and burn injury. J Orthop Res. 32 (11), 1416-1423 (2014).
- Peterson, J. R., et al. Effects of Aging on Osteogenic Response and Heterotopic Ossification Following Burn Injury in Mice. Stem Cells Dev. , (2014).
- Alfieri, K. A., Forsberg, J. A., Potter, B. K. Blast injuries and heterotopic ossification. Bone and Joint Research. 1 (8), 174-179 (2012).
- Hunt, J. L., Arnoldo, B. D., Kowalske, K., Helm, P., Purdue, G. F. Heterotopic ossification revisited: a 21-year surgical experience. J Burn Care Res. 27 (4), 535-540 (2006).
- Ring, D., Jupiter, J. B. Operative release of ankylosis of the elbow due to heterotopic ossification. Surgical technique. J Bone Joint Surg Am. 86-A, Suppl 1. 2-10 (2004).
- Crane, N. J., Polfer, E., Elster, E. A., Potter, B. K., Forsberg, J. A. Raman spectroscopic analysis of combat-related heterotopic ossification. Bone. 57 (2), 335-342 (2013).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
