Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Visualisatie van miniSOG Tagged DNA reparatie-eiwitten in combinatie met Electron spectroscopische beeldvorming (ESI)

9.7K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/52893

⸱

24 september 2015

 ,  , 
1Department of Oncology, Faculty of Dentistry and Medicine, University of Alberta

In dit artikel

Samenvatting

Elektronenspectroscopisch beeldvorming kan nucleïnezuur en eiwitten onderscheiden met een resolutie van nanometer. Het kan worden gecombineerd met het miniSOG-systeem, dat gelabelde eiwitten specifiek kan markeren in transmissie-elektronenmicroscopie-monsters. We illustreren het gebruik van deze technologieën met dubbelstrengsbreukreparatiefoci als voorbeeld.

Samenvatting

De grenzen van optische resolutie en de uitdaging van het identificeren van specifieke eiwit bevolkingsgroepen in transmissie elektronenmicroscopie zijn obstakels in de celbiologie geweest. Veel verschijnselen kunnen niet verklaard worden door in vitro analyse in vereenvoudigde systemen en aanvullende structurele informatie nodig in situ, in het bijzonder in het traject tussen 1 nm en 0,1 urn, teneinde te worden begrepen. Hier, elektronen spectroscopische beeldvorming, een transmissie elektronenmicroscopie techniek die gelijktijdig in kaart brengen van de verdeling van eiwitten en nucleïnezuren mogelijk maakt, en een uitdrukking tag, miniSOG, worden gecombineerd om de structuur en organisatie van DNA double-strand break repair foci bestuderen.

Inleiding

Ondanks de aanzienlijke vooruitgang in het licht microscopie afgelopen jaren 1, cel-biologen nog steeds last van een hiaat in de resolutie. Dit beperkt begrip van de structuur-functie relaties in de fundamentele cellulaire processen die de gecoördineerde wisselwerking tussen macromoleculaire complexen omvatten (bijvoorbeeld in chromatine remodeling, reparatie van DNA, RNA transcriptie en DNA-replicatie). Hoewel transmissie elektronenmicroscopen (TEM) s de vereiste resolutie, het moeilijk is geweest om deze processen structureel vanwege het onvermogen definiëren eiwitten te labelen terwijl ook in staat om de biochemische samenstelling van de gevisualiseerde structuren te bepalen. Aangezien interne membranen te differentiëren nucleaire structuren, is de kern bijzonder uitdagend. Electron spectroscopische beeldvorming (ESI) lost sommige beperkingen doordat de gelijktijdige detectie en differentiatie van DNA, RNA en protein-gebaseerde nucleaire structuren 2-5.

Elektron spectroscopische beeldvorming:

Om elementaire verdeling met hoge gevoeligheid en resolutie van de elektronenmicroscoop kaart, kan men een beeldspectrometer dat elektronen die inelastisch verstrooid door interactie met binnenschaal elektronen van een element in het monster 6 selecteert gebruiken. Omdat element-specifieke hoeveelheden energie verloren als gevolg van ionisatie van atomen in het monster, kunnen deze elektronen worden gescheiden en gevisualiseerd met behulp van een spectrometer die de elektronenmicroscoop is bevestigd. Aldus analyse van het spectrum van de electronen die interactie met het monster laat kwalitatieve en kwantitatieve informatie over de elementaire samenstelling van het monster 7. Elektronen die geen energie verliezen bij het passeren van het monster zijn te vinden in de "nul-verlies piek" van het elektron energieverliesspectrum. De overvloed van deze elektronen is gerelateerd aan de massa, de dichtheid en dikte van het monster en bestaat uit elektronen die door het monster zonder te botsen met het monster of verlies van energie tijdens passage door het monster. Deze informatie kan nuttig zijn voor absolute kwantificering van het aantal atomen van een bepaald element aanwezig in het monster 8 zijn.

Omdat biologische monsters voornamelijk uit lichte elementen die slecht afbuigen de elektronen in de invallende bundel van de TEM, kleuringen die zware metaalzouten hebben om contrast in het monster te genereren worden toegepast. Het gebrek aan specificiteit van de meeste van deze contrastmiddelen en het onvermogen om meer dan één vlek indien specificiteit mogelijk zichtbaar is de waarde van conventionele elektronenmicroscopie beperkt in de studie van de kern. ESI heeft belangrijke voordelen ten opzichte van conventionele TEM, met name voor de studie van structuur van de celkern.Het is mogelijk om de fosfor-rijke natuur van DNA- en RNA-bevattende macromoleculaire complexen benutten nucleoproteïne complexen eiwitcomplexen onderscheiden en verschillende nucleoproteïne complexen op basis van hun dichtheid van nucleïnezuren lossen. Het resterende biologisch materiaal kan worden afgebeeld op basis van de overvloed aan stikstof. Mapping alleen deze twee elementen en de analyse van hun verspreiding en relatieve rijkdom binnen de verschillende anatomische structuren geeft ons veel informatie over de kern. Zo is het gemakkelijk om chromatine en de ribosomen in de kaart die fosfor overvloed identificeren. De interchromatin ruimte, porie complexen nucleaire en nucleaire organen, daarentegen, kan gemakkelijk worden gedetecteerd in beeld stikstof map.

Mini singlet zuurstof generator systeem (miniSOG)

Terwijl ESI is een krachtige techniek voor een studie in situ chromatinestructuur omdat nemens voordeel van de kenmerkende verhoudingen in elementaire samenstelling tussen fosfor en stikstof, de elementaire samenstelling kan normaliter worden gebruikt om te discrimineren tussen verschillende populaties van eiwitcomplexen. Antilichamen gelabeld met kleine gouddeeltjes in het nanobereik zijn op grote schaal gebruikt om de locatie van individuele moleculen in kaart. Aangezien de gouddeeltje gewoonlijk verbonden is aan een secundair antilichaam, verschijnt binnen een omtrek van ongeveer 20 nm rond gedetecteerd door het primaire antilichaam epitoop. Bij post-inbedding samples kunnen antilichamen alleen de epitopen die zijn blootgesteld aan het oppervlak van de secties detecteren. Hoewel het mogelijk is de aanwezigheid van een antigeen te bewijzen en relateren aan een bepaalde anatomische structuur van de cel, de informatie die wordt verkregen onvolledig is, aangezien de meeste epitopen worden verduisterd door hars. Pre-inbedding technieken die vergelijkbaar protocollen die voor fluorescentiemicroscopie gebruiken, toegang tot antigenen toestaan ​​gedurendede gehele diepte van het monster maar de permeabilisatie stappen die nodig zijn om het antilichaam aan de cel penetreren vereisen typisch verwijderd lipidemembranen en componenten die niet aldehyden kunnen worden vastgesteld verwijderen. Bovendien is de voorkeur aldehyde fixeermiddel voor ultrastructuur behoud, glutaaraldehyde, gewoonlijk vernietigt epitopen en dientengevolge is paraformaldehyde typisch vereist. Dit is minder effectief bij eiwit-eiwit crosslinking. Een ander nadeel van antilichamen die zijn gemerkt met een gouden nanodeeltjes is dat goud een elektronen-dicht materiaal dat een sterk contrast interessante structurele details van het monster, die zwakker contrast heeft kunnen verhullen ontstaat.

De opkomst van het groen fluorescerend eiwit (GFP) als een expressie gebracht eiwit tag heeft getransformeerd het gebruik van fluorescentiemicroscopie om vragen te beantwoorden in de celbiologie. Tagging een eiwit met een kleine fluorescerende domein maakt mapping van de verdeling ervan in vivo zonder dat permeabilisatie procedures die de structuur kan veranderen. Om het elegante principe van het gebruik eiwitlabels eiwit distributies kaart in een cel elektronenmicroscopie vertalen, is een systeem nodig dat in staat is een signaal dichtbij de structuur van belang te produceren en het genereren contrast in de TEM. Gepolymeriseerde diaminobenzidine is een vlek die vaak wordt gebruikt in de histologie voor de opsporing van antilichamen binden. Deze vlek wordt gewoonlijk neergeslagen terwijl mierikswortelperoxidase (HRP) geconjugeerd aan een secundair antilichaam. Hoewel de reactie produceert een betrouwbaar resultaat, HRP is katalytisch actief op het cytosol van cellen 9. De reactieproducten van HRP kan diffunderen weg van de plaats van productie zodat de resolutie is slechter dan nanogold methode 10. Om deze problemen te omzeilen, werd de flitser / ReAsH ontwikkeld 11. Het bestaat uit recombinante fusie-eiwitten die een tetracysteine ​​motief bezitten. Dit motief maakt de binding vaneen biarsenic fluorofoor. Bij opwinding, het gebonden Flash of ReAsH staat is de zeer reactieve singlet zuurstof en dus photoconvert diaminobenzidine (DAB) in een polymeer dat direct op de plaats van de gemerkte eiwitten precipiteert genereren. De DAB polymeer kan worden gekleurd met osmiumtetroxide, wat electron dichtheid en dus kunnen worden gebruikt om de verdeling van het recombinante fusie-eiwit in de TEM in kaart.

In 2011, Shu et al. 10 heeft de miniSOG systeem, dat bestaat uit een kleine 106 aminozuren fusion tag afgeleid van een flavoproteïne van Arabidopsis die fluorescent en kan vele singlet zuurstofradicalen te maken bij excitatie met 448 nm blauw licht. Deze singlet zuurstof radicalen kan worden gebruikt voor foto-oxideren diaminobenzidine polymeren aan en nabij het ​​oppervlak van de gelabelde eiwitten, die aanzienlijk dichter dan immunogoud gemerkte antilichamen 11 te vormen. Terwijl de flitser / ReAsH systeem vereist waardoor de fluorchroom en diaminobenzidine in de cellen voordat u de photoconversion het miniSOG vereist alleen diaminobenzidine en licht en bovendien is ongeveer tweemaal zo doeltreffend polymeriseren diaminobenzidine. Hier miniSOG wordt toegepast in combinatie met ESI om de ultrastructuur van DNA herstel foci in kaart.

DNA-herstel foci (DRF)

Ongerepareerde DNA dubbele breuken vormen een ernstige bedreiging voor de cel omdat ze kunnen leiden tot translocaties en verlies van genetische informatie. Op zijn beurt kan leiden tot veroudering, kanker, en celdood. Veel eiwitten die betrokken zijn bij DNA dubbele breuken reparatie ophopen in brandpunten die monteren rond een DNA dubbele streng te breken 12-14. Hoewel hun functie niet bekend is, vertegenwoordigen zij de plaats in de kern die de DNA dubbele streng breuk bevat en de plaats van DNA dubbele streng breuk reparatie.

DNA-reparatie foci (DRF) zijn gekarakteriseerd door fluorescentiemicroscopie en zij dienen als biomarkers voor DNA schade 12,15. Ze zijn enorm ten opzichte van de grootte van het dubbelstrengs breuken en waren betrekkelijk homogeen beschouwd zolang Language superresolutietechnieken studies toonden aanwijzingen van sub-compartimentering van moleculen binnen iedere 16 gericht. Om te begrijpen hoe deze plaatsen zijn georganiseerd, dient te visualiseren alle onderliggende biologische structuren ten opzichte van elkaar. Dit kan niet worden bereikt door fluorescentiemicroscopie maar kan door elektronenmicroscopie 17,18. Hier wordt een methode beschreven die elektronen spectroscopische beeldvorming combineert met de miniSOG methode om het potentieel van deze gecombineerde aanpak illustreren aan de ultrastructuur van DNA double-strand break repair verkennen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Generatie van miniSOG Cell-lijnen

  1. Groei U2OS (humane osteosarcoom) -cellen in een 35 mm schotel met 2 ml van laag glucose Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium (DMEM) dat is aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) bij 37 ° C in een bevochtigde incubator met 5% CO 2 atmosfeer.
  2. Transfecteren de cellen wanneer ze 80% samenvloeiing door lipofectie met gezuiverd transfectie kwaliteit (A269 / 280-verhouding 1,8-2,0) plasmide constructen die de sequenties voor miniSOG en mCherry gelabeld reparatie-eiwitten volgens het protocol van de fabrikant van de transfectiereagens 19. De miniSOG expressieplasmiden kunnen uit de Tsien-Lab worden besteld: http://www.tsienlab.ucsd.edu/Samples.htm
  3. Sorteer de cellen die het recombinant eiwit met de miniSOG en mCherry tag door fluorescentie geactiveerde celsortering twee dagen na de transfectie. Verzamelen cellenmet tussenliggende fluorescentie-intensiteit om cellen die overexpressie 20 voorkomen.
  4. Kweek de positieve cellen op een 10 cm schaal in 10 ml DMEM-medium dat is aangevuld met 10% FBS en 0,6 ug / ml van het selectiemiddel G418 (Geneticine).
  5. Nadat zichtbare kolonies ontstaan ​​op de platen, scherm mCherry positieve kolonies onder gebruikmaking van een omgekeerde fluorescentiemicroscoop en teken cirkels eromheen (op de bodem van de plaat) met een permanente marker. Gebruik een lage vergroting lucht objectief (bijvoorbeeld 10x) en pick-klonen met steriele techniek voorzichtig krassen de kolonies af en langzaam zuigen ze in een steriele 1000 ul pipetpunt.
  6. Vouw de geselecteerde kolonies en delen van hen bevriezen beneden met behulp van het groeimedium in stap 1.1, aangevuld met 10% dimethylsulfoxide beschreven. Test de cellen voor DRF vorming door de groeiende ze op steriele 18 x 18 mm 2 dekglaasjes en hen blootstellen aan2 Gy straling. De bestraalde cellen die stabiel uitdrukken van een miniSOG mCherry gelabeld reparatie eiwit moet de typische brandpunt patroon kenmerk van DSB's tonen wanneer gevisualiseerd met een fluorescentie microscoop met behulp van een filter-set voor de beeldvorming mCherry.

2. Cell Culture

  1. Cultuur U2OS cellen die stabiel de uiting van de miniSOG en mCherry gelabeld reparatie-eiwitten onder de in stap 1.1 omstandigheden. Kweek cellen 80% confluentie in een 35 mm diameter glazen bodem schaaltje met 2 ml DMEM. Zorg ervoor dat de lijm die het dekglas hecht aan de kunststof en de gebruikte kunststof is bestand tegen waterige en alcoholische oplossingen en bestand tegen de gebruikte hars!
  2. Alvorens tot het experiment schetsen een klein gebied van ongeveer 1 mm 2 dat cellen die het ectopische eiwitten door krassen met een steriele diamant pen met behulp van een fluorescentie microscoop op het gebied van belang te identificeren bevat. U kunt ook gebruik maken van een glazen bodem schaal that bevat een dekglaasje met een vooraf geëtste raster ingebouwd in het dekglaasje.
    OPMERKING: Als met behulp van hoge kwaliteit correlatieve microscopie combineren ESI en fluorescentie microscopische foto's 21, zorg ervoor dat de dikte van het dekglaasje is compatibel met olie-immersie doelstellingen. Het moet de dikte No. 1,5 (0,16-0,18 mm) heeft. Kies een gebied dicht bij het centrum van de schotel voor de regio in de TEM te onderzoeken om problemen met de polymerisatie van de hars die zich kunnen voordoen in de buurt van de randen te voorkomen (zie punt 4,10-4,13).

3. DNA-schade Inductie

  1. Bestralen van de cellen met gammastraling, gebruikt een radionabootsende geneesmiddel of induceren schade door micro laser bestraling op een confocale microscoop (bijvoorbeeld zoals beschreven in 18,22 of 23).
  2. In dit voorbeeld, bestralen van de cellen met 2 en 6 Gy van gammastraling in een cesium-137 stralingsbron of laser microirradiate met de 405 nm solid state laser van een confocale microscoop na sensibiliseren de cellen gedurende 20 min met 0,5 ug / ml Hoechst.

4. Monstervoorbereiding

  1. Fixeer de cellen met 1 ml 4% paraformaldehyde in 0,1 M LET natriumcacodylaat buffer of 0,1 M fosfaatbuffer pH 7,4 gedurende 30 min bij kamertemperatuur in het donker.
    LET OP: Paraformaldehyde en natriumcacodylaat zijn giftig! Draag handschoenen en gooi de giftige stoffen adequaat.
  2. Was de cellen tweemaal met 4 ml 0,1 M natriumcacodylaat pH 7,4 of pH 7,4 fosfaatbuffer.
  3. Behandel de gefixeerde cellen met 2 ml 50 mM glycine, 5 mM aminotriazool en 10 mM kalium- cyanide VOORZICHTIG in 0,1 M natriumcacodylaat buffer en 0,1 M fosfaatbuffer (pH 7,4) (controleer de pH!) Gedurende 30 min teneinde te blokkeren gereageerde aldehydegroepen en de reactieve zuurstof species gegenereerd door heem groepen te onderdrukken, waarbij de achtergrond kan verhogen.
    LET OP: Kaliumcyanide is uiterst giftig! Woor handschoenen, werken onder een kap en afvoeren van de giftige stoffen adequaat. De reactie is erg gevoelig voor pH dus is het belangrijk dat de pH gecontroleerd en nauwkeurig.
  4. Noteer het gebied dat werd geselecteerd in stap 2.2 in 2D of 3D op een geïnverteerde fluorescentiemicroscoop, indien correlatieve microscopie gewenst.
  5. Maak een 1 mg / ml diaminobenzidine hydrochloride VOORZICHTIG oplossing door een 10 mg diaminobenzidine hydrochloride tablet in een 2 ml microcentrifugebuis. Voeg 980 ul gedestilleerd H2O en 20 pl geconcentreerd zoutzuur (11,65 M) en meng totdat de oplossing licht bruin en doorschijnend. Verdun deze oplossing in 0,1 M fosfaat of 0,1 M natriumcacodylaat buffer tot een eindconcentratie van 1 mg / ml, terwijl de pH met natriumhydroxide op een pH tussen 7,0 en 7,6 (pH 7,4 wordt aanbevolen).
    LET OP: Diaminobenzidine is giftig! Draag handschoenen en gooi de giftige stoffen adequaat.
  6. Voor foto-oxidatie, replace de buffer met 2 ml van een 1 mg / ml diaminobenzidine hydrochloride-oplossing in 0,1 M natriumcacodylaat buffer of fosfaatbuffer. Bescherm tegen licht oplossing en koel het af op ijs tot 4 ° C teneinde de oplosbaarheid van zuurstof te verhogen. Verzadigen oplossing met zuurstof door doorleiden van zuurstof door de oplossing (gebruik een slang die in de oplossing is ingebracht en verbonden met een zuurstoffles). Controleer de pH opnieuw en aanpassen als dat nodig is.
    NB: Het is van cruciaal belang voor de oxidatie reactie die de pH tussen pH 7,0 en pH 7,6.
  7. Monteer de schotel met de vaste cellen voorzichtig op een omgekeerde fluorescentiemicroscoop uitgerust met een 40x olie-immersie objectief en verplaatsen naar het gebied van de rente. Prikkelen de miniSOG tag met blauw licht door het gebruik van filter kubussen voor GFP of GVB. MiniSOG heeft een excitatie maximum bij 448 nm met een schouder bij 473 nm 10.
  8. Ga verder met de verlichting, zelfs nadat de groene miniSOG fluorescentie hais volledig verdwenen en tot de bruine foto-oxidatie product van de gepolymeriseerde diaminobenzidine komt in het doorgelaten licht kanaal. Wanneer het oxidatieproduct zichtbaar in de meeste cellen, zet de fluorescentieverlichting om de foto-oxidatie te stoppen.
    OPMERKING: Foto-oxidatie kan tot enkele minuten, afhankelijk van het objectief, filter transmissie golflengten en efficiëntie, en de verlichting bron.
  9. Postfix de cellen met 1 ml van 2% glutaaraldehyde in 0,1 M natriumcacodylaat pH 7,4 buffer of fosfaatbuffer pH 7,4 gedurende 30 min.
  10. Bevestig de membranen van de cellen met 0,1% -0,5% osmiumtetroxide gedurende 20 min in 0,1 M natriumcacodylaat pH 7,4 of 0,1 M fosfaatbuffer pH 7,4.
    NB: Het is aanbevolen om de laagst mogelijke concentratie van osmiumtetroxide nodig om de membranen te stabiliseren gebruiken. Aangezien de gepolymeriseerde DAB precipitaten een hoge dichtheid van stikstof die direct door ESI een sterk kan worden gedetecteerdosmium kleuring is niet nodig om de miniSOG-gelabeld eiwit te identificeren en schadelijk voor de ESI kunnen zijn. Osmiumtetroxide is zeer giftig! Werk in een zuurkast en gooi het giftige afval adequaat.
  11. Gedehydreerd, de cellen door een ethanol serie gebruikt 30%, 50%, 70%, 90%, 98% 100% ethanol stappen (ieder 5 min). Vervolgens incuberen van de cellen in een 1: 1 mengsel van 100% ethanol en acrylhars (LR White) en zet de schaal op een schudder gedurende 4 uur tot infiltratie in de cellen vergemakkelijken voordat de cellen te incuberen gedurende ten minste 4 uur bij 100 % acrylhars (LR White).
  12. Om de hars te polymeriseren, afgesneden van de deksel van een label 2 ml microcentrifugebuis met een scheermesje en vacht van de velg acrylhars accelerator. Zorg ervoor dat het gaspedaal alleen betrekking heeft op de velg en stroomt niet in de buis. Vervolgens zorgvuldig vul de buis ongeveer tweederde met LR White hars met behulp van een Pasteur pipet. Zorg ervoor dat de hars niet in contact with het gaspedaal op de rand!
  13. Verwijder het hars dat de cellen geïnfiltreerd in de schaal en zet de schaal ondersteboven op de rechtopstaande microcentrifugebuis zodat de breedte van de buis bijna volledig het glas bedekt kijkvenster van de schotel vult.
  14. Wacht 1 tot 2 min van het gaspedaal aan de buis en het dekglaasje af te dichten, dan keren de buis zodanig dat de hars in de buis omvat nu cellen.
  15. Plaats de schaal met de buis in een oven bij 60 ° C en genezen gedurende 12 uur.
  16. Wanneer het blok wordt uitgehard, verwijdert de schaal met de bijgevoegde hars gevulde microcentrifugebuis uit de oven en scheiden de microcentrifugebuis van de schotel. Faciliteren scheiding door vries-dooi cycli in vloeibare stikstof en warm water.
  17. Gooi de glazen onderste schaal voorzichtig opengesneden de microcentrifugebuis met een scheermesje om het blok te verwijderen.
  18. Het etiket van het blok met een permanent marker.
  19. Gebruik een scheermesje om trim het blok zodat niets maar 1 mm 2 gebied dat het gebied eerder gemarkeerde de diamant of wolfraam pen bevat (of bevat het gebied met de cellen van belang) blijft.
  20. Monteer het blok in een ultramicrotoom, trim het blok met een Stanleymes en snijd ultra-dunne secties van ongeveer 50 nm met behulp van een diamant mes.
  21. Pick-up van de secties op high-transmissie 300 mesh netten. Deze roosters zeer kleine spijlen en dus omvatten minder cellen in het interessegebied.
  22. De vacht van de hoofdstukken over de roosters met ongeveer 0,2-0,4 nm koolstof met een koolstofbedamper te helpen stabiliseren ze onder de elektronenbundel van de TEM.

5. Electron Microscopy

  1. Laad de roosters in een TEM die is uitgerust met een energiefilter. Na het afstemmen van de microscoop en de energie-filter volgens de instructies van de fabrikant, inspecteren de cellen op de secties in de lage vergroting mode (normale transmissie) en vergelijkze data fluorescentie wanneer nodig (verkregen bij stap 4,4).
  2. Zodra een kern met interessante eigenschappen (DNA schade track of DNA-reparatie brandpunten) wordt gevonden, schakelt de energie filtering modus en neem een ​​dikte kaart.
    OPMERKING: Deze procedure omvat de opname van een zero-verlies en een ongefilterd beeld. Dikten tot 0,3 vrije weglengte (30% van de elektronen van de invallende bundel wordt verstrooid door het monster) zijn dun genoeg om goede elementaire kaarten genereren.
  3. Neem verhouding kaarten van de elementen fosfor en stikstof met de software die het energiefilter van de gebruikte microscoop bestuurt. Noteer de fosfor kaart na rand beelden bij 175 eV energieverlies met een spleetbreedte van 20 eV en pre-edge beelden bij 120 eV energieverlies, ook met een spleetbreedte van 20 eV. Voor de stikstof kaarten opnemen na de rand beelden bij 447 eV met een spleetbreedte van 35 eV en pre-edge beelden bij 358 eV, ook met een spleetbreedte van 35 eV.
    OPMERKING: Aangezien de inhoud van de afgebeelde elementen (phosphOrus en stikstof) is relatief laag (ong. 1%), kies "Ratio Afbeelding" (kwalitatieve elementaire kaart) over de "3-venster-methode" (te kwantificeren elementaire kaart) om beelden met een betere signaal-ruisverhouding te genereren.

6. Beeldverwerking

  1. Open de elementaire verhouding kaarten in een beeld processing software die de bestandsindeling van de verworven beelden (bijv Digital Micrograph) aankan. Kopieer de stikstof kaart in het rode kanaal en de fosfor kaart in het groene kanaal van een RGB-afbeelding, dan over elkaar en lijn de kaarten.
  2. Exporteer de samengestelde beeld als een Tagged Image File Format-bestand (TIFF). Open de afbeelding in een beeld processing software die lagen kunnen gebruiken (bijvoorbeeld Photoshop).
  3. Pas het dynamische bereik van ieder kanaal herschalen de minimum en maximum waarden in het beeld van een 8-bit data set (0 tot 255).
  4. Trek het fosforgehalte van het stikstofatoom kaart (deWindow "Layers") om een ​​kwalitatieve kaart die de verdeling van eiwit wordt afgebeeld.
  5. Omzetten van de kaarten van het nucleïnezuur (fosfor) en het eiwit (stikstof) in de vorige stap in "geïndexeerde kleur" en maak een gele opzoektabel in de CMYK-kleurruimte voor de kaart met de nucleïnezuur distributie en een cyaan opzoektabel de niet-nucleoproteïne map tonen. De kleuren zijn gekozen maximum contrast tussen de twee elementaire maps genereren.
  6. Maak een nieuwe afbeelding en importeer de kaarten met de verdelingen van fosfor en eiwit als verschillende lagen. Gebruik de "screen" transparantie mode om zowel lagen bovenop elkaar te zien.
  7. Open de zero-loss afbeelding verworven in stap 5.2. Dit beeld vertegenwoordigt een beeld van het opgenomen gebied dat lijkt het conventionele TEM als maar bevat alleen de elektronen die zijn gepasseerd door het preparaat zonder te botsen met het monster. Exportdit beeld van een TIFF zo.
  8. Open de geëxporteerde afbeelding nul verlies in een foto-editor en kopieer het in de bovenste laag van het plaatje van de elementaire kaart. Lijn de afbeelding met behulp van de "screen" transparantie mode.
  9. Eventueel drempel van de nul-verlies afbeelding om segment het signaal dat afkomstig is van de miniSOG. Naar het resulterende beeld als een aparte laag zoals hierboven beschreven.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

ESI

Vergelijking van de ESI beelden van de nucleus (figuur 1) van de conventionele TEM beelden (bijvoorbeeld figuur 7-1) toont een dramatische toename van anatomische structuren die gemakkelijk onderscheiden kan worden. De chromatine richels verschijnen in het geel en het is heel gemakkelijk om de chromocenters in muizen cellen te identificeren. Nucleoli gemakkelijk te onderscheiden van hun door chromatine structuur en verschillende...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

ESI kan dienen als een uitstekend hulpmiddel voor de behandeling van verschillende staten van chromatine en ribonucleoproteins in de kern, omdat het in staat is om specifiek in kaart gebieden die rijk zijn aan fosfor zijn. Het verhoogt diep de hoeveelheid detail die kan worden verkregen met een elektronenmicroscoop en is niet afhankelijk van aspecifieke zeer uiteenlopende methoden. Een nadeel van ESI is dat het vereist dunnere dan conventionele TEM tegelijk versnellingsspanning. Dit kan worden ondervangen door met serie...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

We danken Dr. Roger Tsien voor het verstrekken van de miniSOG constructies. Dr. Xuejun Sun voor de hulp met de TEM. Lisa Lem en Peter Shipple van het Cross Cancer Institute voor het leveren van zuurstof. Hilmar Strickfaden heeft een postdoctorale beurs van de Alberta Cancer Foundation en werd ondersteund door de Bayrische Forschungsallianz. Dit werk werd ondersteund door subsidies van de Canadian Institutes of Health Research en de Alberta Cancer Foundation.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
35 mm glazen bodem schalenMatTekP35G-1.5-14-C
Geribbelde 35 mm glazen bodem schalenMatTekP35G-2-14-CGRD niet gemaakt voor immersieobjectieven
LR White: acrylharsemsdiasum14381
LR White versnelleremsdiasum14385
3,3'-Diaminobenzidine tetrahydrochloride 10 mg tablettenSigmaD5905
Slim Bar Grids 300 MeshSPI1161123
Wolfraam-Point Lab Penemsdiasum41148
Osmium Tetroxideemsdiasum19100
Carbon Coater 208 carbonCressington
Ultra microtome Leica EM UC6Leica
Photoshop CS5Adobewerkt misschien zelfs met oudere versies
Digital Micrograph V.2.30Gatanwerkt misschien zelfs met oudere versies
Hoechst 33342SigmaH-1399
EffecteneQuiagen
MiniSOG-ConstructsTsien-Labtsienlab@yahoo.com
MDC1 miniSOG mCherry
53BP1 miniSOG mCherry
Rad52 miniSOG mCherry
cesium 137 stralingsbron "MARK 1" (J.L. Shepherd & Associated)
ImageJ/FiJiopen sourcehttp://fiji.sc/Fiji
2 ml Eppendorf buisjesFisherbrand05-408-146
Diamond Knife ultra 35°Diatome
Trim Knife ultratrimDiatome
Natriumcacodylate trihydraatemsdiasum12300Let op: giftig!
Glutaraldehyde EM Grade 8%emsdiasum16020Let op: giftig!
Natriumfosfaat dibasischemsdiasum21180
Natriumfosfaat monobasischemsdiasum21190
Paraformaldehydeemsdiasum19202
Osmium tetroxide 4% oplossingemsdiasum19150
Inverted Fluorescerende Microscoop Axiovert 200MZeiss
ZoutzuurFisherbrandA142-212
Natriumhydroxide oplossing 10MFluka72068
ZuurstofMedigas
3-Amino-1,2,4-triazoolSigmaA8056
KaliumcyanideSigma207810Let op: giftig!
Ethanolemsdiasum15058Let op: giftig!
Houdschaafje Single Edge Koolstofstaalemsdiasum71960Let op: scherp!
DMEMSigmaD 5546
FBSLife Technologies16000-044
G418Life Technologies11811-023
DMSOSigmaD2650
Transmissie Elektronen Microscoop 200 kVJEOL2100
GIF Tridiem 863 Energie filterGatan

Referenties

  1. Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. A guide to super-resolution fluorescence microscopy. The Journal of Cell Biology. 190, 165-175 (2010).
  2. Bazett-Jones, D. P., Hendzel, M. J., Kruhlak, M. J. Stoichiometric analysis of protein- and nucleic acid-based structures in the cell nucleus. Micron (Oxford, England: 1993). 30, 151-157 (1999).
  3. Michael J Hendzel, F. M. B., Bazett-Jones, D. P. Direct Visualization of a Protein Nuclear Architecture. Molecular biology of the cell. 10, 2051(1999).
  4. Ottensmeyer, F. P., Andrew, J. W. High-resolution microanalysis of biological specimens by electron energy loss spectroscopy and by electron spectroscopic imaging. Journal of ultrastructure research. 72, 336-348 (1980).
  5. Leapman, R. D., Ornberg, R. L. Quantitative electron energy loss spectroscopy in biology. Ultramicroscopy. 24, 251-268 (1988).
  6. Simon, G. T. Electron spectroscopic imaging. Ultrastructural pathology. 11, 705-710 (1987).
  7. Egerton, R. Electron Energy-Loss Spectroscopy in the Electron Microscope. , Springer. (2011).
  8. Aronova, M. A., Kim, Y. C., Zhang, G., Leapman, R. D. Quantification and thickness correction of EFTEM phosphorus maps. Ultramicroscopy. 107, 232-244 (2007).
  9. Hopkins, C., Gibson, A., Stinchcombe, J., Futter, C. Chimeric molecules employing horseradish peroxidase as reporter enzyme for protein localization in the electron microscope. Methods in enzymology. 327, 35-45 (2000).
  10. Shu, X., et al. A Genetically Encoded Tag for Correlated Light and Electron Microscopy of Intact Cells, Tissues, and Organisms. PLoS biology. 9, e1001041(2011).
  11. Gaietta, G., et al. Multicolor and electron microscopic imaging of connexin trafficking. Science (New York, NY). 296, 503-507 (2002).
  12. Fernandez-Capetillo, O., Celeste, A., Nussenzweig, A. Focusing on foci: H2AX and the recruitment of DNA-damage response factors. Cell cycle (Georgetown, Tex). 2, 426-427 (2003).
  13. Haaf, T., Golub, E. I., Reddy, G., Radding, C. M., Ward, D. C. Nuclear foci of mammalian Rad51 recombination protein in somatic cells after DNA damage and its localization in synaptonemal complexes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92, 2298-2302 (1995).
  14. Maser, R. S., Monsen, K. J., Nelms, B. E., Petrini, J. H. hMre11 and hRad50 nuclear foci are induced during the normal cellular response to DNA double-strand breaks. Molecular and Cellular Biology. 17, 6087-6096 (1997).
  15. Bekker-Jensen, S., Mailand, N. Assembly and function of DNA double-strand break repair foci in mammalian cells. DNA repair. 9, 1219-1228 (2010).
  16. Chapman, J. R., Sossick, A. J., Boulton, S. J., Jackson, S. P. BRCA1-associated exclusion of 53BP1 from DNA damage sites underlies temporal control of DNA repair. Journal of cell science. 125, 3529-3534 (2012).
  17. Dellaire, G., Kepkay, R., Bazett-Jones, D. P. High resolution imaging of changes in the structure and spatial organization of chromatin, gamma-H2A.X and the MRN complex within etoposide-induced DNA repair foci. Cell cycle (Georgetown, Tex). 8, 3750-3769 (2009).
  18. Kruhlak, M. J., et al. Changes in chromatin structure and mobility in living cells at sites of DNA double-strand breaks. The Journal of Cell Biology. 172, 823-834 (2006).
  19. Goodson, H. V., Dzurisin, J. S., Wadsworth, P. Generation of stable cell lines expressing GFP-tubulin and photoactivatable-GFP-tubulin and characterization of clones. Cold Spring Harbor protocols. 2010, (2010).
  20. Zeyda, M., Borth, N., Kunert, R., Katinger, H. Optimization of sorting conditions for the selection of stable, high-producing mammalian cell lines. Biotechnology progress. 15, 953-957 (1999).
  21. Dellaire, G., Nisman, R., Bazett-Jones, D. P. Correlative light and electron spectroscopic imaging of chromatin in situ. Methods in enzymology. , 375-456 (2004).
  22. Campbell, S., Ismail, I. H., Young, L. C., Poirier, G. G., Hendzel, M. J. Polycomb repressive complex 2 contributes to DNA double-strand break repair. Cell cycle. 12, 2675-2683 (2013).
  23. Mortusewicz, O., et al. Recruitment of RNA polymerase II cofactor PC4 to DNA damage sites. J Cell Biol. 183, 769-776 (2008).
  24. Bekker-Jensen, S., et al. Spatial organization of the mammalian genome surveillance machinery in response to DNA strand breaks. The Journal of Cell Biology. 173, 195-206 (2006).
  25. Ferrando-May, E., et al. Highlighting the DNA damage response with ultrashort laser pulses in the near infrared and kinetic modeling. Frontiers in genetics. 4, 135(2013).
  26. Lukas, C., et al. 53BP1 nuclear bodies form around DNA lesions generated by mitotic transmission of chromosomes under replication stress. Nature. 13, 243-253 (2011).
  27. Harrigan, J. A., et al. Replication stress induces 53BP1-containing OPT domains in G1 cells. The Journal of Cell Biology. 193, 97-108 (2011).
  28. Aronova, M. A., et al. Reprint of 'Three-dimensional elemental mapping of phosphorus by quantitative electron spectroscopic tomography (QuEST). J. Struct. Biol. 161, 322-335 (2007).
  29. Fussner, E., et al. Constitutive heterochromatin reorganization during somatic cell reprogramming. The EMBO journal. 30, 1778-1789 (2011).
  30. Kepkay, R., Attwood, K. M., Ziv, Y., Shiloh, Y., Dellaire, G. KAP1 depletion increases PML nuclear body number in concert with ultrastructural changes in chromatin. Cell cycle. 10, Georgetown, Tex. 308-322 (2011).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

miniSOG tagtransmissie elektronenmicroscopiefluorescentiemicroscopielaser microbestralingfosfor mappingstikstof mappingchromatinestructuurDNA dubbelstrengsbreuk
Visualisatie van miniSOG Tagged DNA reparatie-eiwitten in combinatie met Electron spectroscopische beeldvorming (ESI)
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.