Het toepassen van een induceerbare Expression Systeem om interferentie van bacteriële virulentiefactoren met intracellulaire signalering Studie

Summary

The method described here is used to induce the apoptotic signaling cascade at defined steps in order to dissect the activity of an anti-apoptotic bacterial effector protein. This method can also be used for inducible expression of pro-apoptotic or toxic proteins, or for dissecting interference with other signaling pathways.

Abstract

De hier gepresenteerde techniek maakt het mogelijk om te analyseren welke stap een doeleiwit, of als alternatief een klein molecuul, een interactie aangaat met de componenten van een signaleringsroute. De werkwijze berust enerzijds op de induceerbare expressie van een specifiek eiwit aan een signalering gebeurtenis op een bepaalde en vooraf bepaalde stap in het geselecteerde signaalcascade te initiëren. Gelijktijdige expressie, anderzijds, van het gen van belang dan kan de onderzoeker om te beoordelen of de activiteit van het doeleiwit tot expressie stroomopwaarts of stroomafwaarts ligt van de signalering geïnitieerde gebeurtenis, afhankelijk van het uitlezen van de signaalroute die wordt verkregen. Hier werd de apoptotische cascade geselecteerd als een gedefinieerde signaleringsroute protocol functionaliteit te demonstreren. Pathogenen, zoals Coxiella burnetii, transloceren effector eiwitten die interfereren met menselijke celdood inductie in de gastheercel om bacteriële overleven in de cel en het bevorderen van hunverspreiding in het organisme. De C. burnetii effector eiwit CAEB effectief remt gastheercel dood na inductie van apoptose met UV-licht of met staurosporine. Om een ​​beperking van op welke stap CAEB interfereert met de verspreiding van het apoptotische signaal, werden geselecteerd eiwitten met een goed gekarakteriseerde pro-apoptotische activiteit tijdelijk in een doxycycline-induceerbare manier uitgedrukt. Als CAEB handelingen stroomopwaarts van deze eiwitten apoptose hinder ondervinden. Als CAEB handelt downstream, zal celdood worden geremd. De testeiwitten geselecteerd waren Bax, die optreedt ter hoogte van de mitochondria en caspase 3, dat het belangrijkste uitvoerder protease. CAEB verstoort celdood geïnduceerd door Bax expressie, maar niet caspase 3 expressie. CAEB dus samenwerkt met de apoptotische cascade tussen deze twee eiwitten.

Introduction

De virulentie van vele Gram-negatieve bacteriële pathogenen is afhankelijk van gespecialiseerde secretie systemen om eukaryotische gastheercellen kapen. Bacteriën gebruiken dit secretiesystemen bacteriële virulentie eiwitten (effectoren) in de gastheercel injecteren van verschillende cellulaire en biochemische activiteiten te moduleren. De studie van effector eiwitten heeft niet alleen verstrekt opmerkelijk inzicht in de fundamentele aspecten van gastheer / pathogeen interacties, maar ook in de fundamentele biologie van eukaryote cellen ^1. Modulatie van gastheercel apoptose is aangetoond dat een belangrijke virulentie mechanisme voor vele intracellulaire p....

Protocol

1. Het genereren van stabiele cellijnen die het beoogde eiwit

1. Bereid media door het toevoegen van warmte geïnactiveerd FCS en 1% penicilline / streptomycine commercieel verkrijgbaar Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) aangevuld met GlutaMAX-I, pyruvaat, en 4,5 g / l D-glucose.
2. Ontwikkel HEK293 cellen in medium bij 37 ° C in 5% CO _2. Sub-kweken cellen elke derde dag. Verwijder het medium en resuspendeer de cellen in 15 ml vers medium. Pipetteer 1 ml in een nieuwe 75 cm ² celkweek kolf en voeg 14 ml media.
3. Analyseer het aantal cellen met een hemocytometer.
4. Seed HEK293 cellen in een 6-wells plaat met....

Results

Ten eerste, HEK293-cellijnen die stabiel het eiwit van belang (CAEB) als GFP-fusie-eiwit werden vastgesteld. Als controle werden HEK293-cellijnen die stabiel GFP ook gegenereerd. Expressie van GFP en GFP-CAEB werd gecontroleerd door immunoblot analyse. De representatieve immunoblot (Figuur 4A) toont stabiele en duidelijk detecteerbare expressie van GFP en GFP-CAEB. Echter, deze test niet bepalen of alle cellen tot expressie GFP of GFP-CAEB. Daarom werden de stabiel getransfecteerde HEK293 cellijnen gean.......

Discussion

Vele pathogene bacteriën herbergen secretiesystemen afscheiden of translocatie van bacteriële effector eiwitten in de gastheercel. Deze effector eiwitten hebben het vermogen om processen en cascades in de gastheercel, waardoor de bacteriën om te overleven en repliceren hun intracellulaire niche. Inzicht in de biochemische activiteiten en de moleculaire mechanismen van de effector eiwitten zal helpen naar een beter begrip van de pathogeniteit en kunnen helpen om nieuwe therapeutische instrumenten voor de bestrijding van .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	life technologies	31966-021
FCS	Biochrom	S0115
Pen/Strep	life technologies	15140-122
OptiMEM	life technologies	51985
X-tremeGENE 9	Roche	6365752001
Geneticin	Roth	CP11.3
Polyethylenimine	Polyscienes	23966
Doxycycline	Sigma Aldrich	D9891
Mini-PROTEAN Tetra Cell	Bio-Rad	165-8000EDU
Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell	Bio-Rad	170-3940
PageRuler Prestained Protein Ladder	Thermo Scientific	26616
PVDF membrane	Millipore	IPVH00010
anti-GFP	life technologies	A6455
anti-cleaved PARP	BD Bioscience	611038
anti-actin	Sigma Aldrich	A2066
Mouse IgG (H+L)-HRPO	Dianova	111-035-062
Rabbit IgG (H+L)-HRPO	Dianova	111-035-045
ECL Western Blotting Substrate	Thermo Scientific	32106
Restore Plus Western Blot Stripping Buffer	Thermo Scientific	46428