Method Article

Het toepassen van een induceerbare Expression Systeem om interferentie van bacteriële virulentiefactoren met intracellulaire signalering Studie

DOI:

10.3791/52903

⸱

June 25th, 2015

 ,  ,  , 
1Department Biologie, Friedrich-Alexander-Universität, 2Institut für Molekulare Pathogenese, Friedrich-Loeffler-Institut, 3Mikrobiologisches Institut - Klinische Mikrobiologie, Immunologie und Hygiene, Universitätsklinikum Erlangen

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De hier beschreven methode wordt gebruikt om de apoptotische signaleringskaskade te induceren in gedefinieerde stappen om de activiteit van een anti-apoptotisch bacterieel effector-eiwit te onderzoeken. Deze methode kan ook worden gebruikt voor inductieve expressie van pro-apoptotische of toxische eiwitten, of voor het onderzoeken van interferentie met andere signaalwegen.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De hier gepresenteerde techniek maakt het mogelijk om te analyseren welke stap een doeleiwit, of als alternatief een klein molecuul, een interactie aangaat met de componenten van een signaleringsroute. De werkwijze berust enerzijds op de induceerbare expressie van een specifiek eiwit aan een signalering gebeurtenis op een bepaalde en vooraf bepaalde stap in het geselecteerde signaalcascade te initiëren. Gelijktijdige expressie, anderzijds, van het gen van belang dan kan de onderzoeker om te beoordelen of de activiteit van het doeleiwit tot expressie stroomopwaarts of stroomafwaarts ligt van de signalering geïnitieerde gebeurtenis, afhankelijk van het uitlezen van de signaalroute die wordt verkregen. Hier werd de apoptotische cascade geselecteerd als een gedefinieerde signaleringsroute protocol functionaliteit te demonstreren. Pathogenen, zoals Coxiella burnetii, transloceren effector eiwitten die interfereren met menselijke celdood inductie in de gastheercel om bacteriële overleven in de cel en het bevorderen van hunverspreiding in het organisme. De C. burnetii effector eiwit CAEB effectief remt gastheercel dood na inductie van apoptose met UV-licht of met staurosporine. Om een ​​beperking van op welke stap CAEB interfereert met de verspreiding van het apoptotische signaal, werden geselecteerd eiwitten met een goed gekarakteriseerde pro-apoptotische activiteit tijdelijk in een doxycycline-induceerbare manier uitgedrukt. Als CAEB handelingen stroomopwaarts van deze eiwitten apoptose hinder ondervinden. Als CAEB handelt downstream, zal celdood worden geremd. De testeiwitten geselecteerd waren Bax, die optreedt ter hoogte van de mitochondria en caspase 3, dat het belangrijkste uitvoerder protease. CAEB verstoort celdood geïnduceerd door Bax expressie, maar niet caspase 3 expressie. CAEB dus samenwerkt met de apoptotische cascade tussen deze twee eiwitten.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De virulentie van vele Gram-negatieve bacteriële pathogenen is afhankelijk van gespecialiseerde secretie systemen om eukaryotische gastheercellen kapen. Bacteriën gebruiken dit secretiesystemen bacteriële virulentie eiwitten (effectoren) in de gastheercel injecteren van verschillende cellulaire en biochemische activiteiten te moduleren. De studie van effector eiwitten heeft niet alleen verstrekt opmerkelijk inzicht in de fundamentele aspecten van gastheer / pathogeen interacties, maar ook in de fundamentele biologie van eukaryote cellen 1. Modulatie van gastheercel apoptose is aangetoond dat een belangrijke virulentie mechanisme voor vele intracellulaire pathogenen en een aantal effector eiwitten moduleren van apoptose geïdentificeerd 2-9. Echter, de precieze moleculaire mechanisme ter blijven ongrijpbaar in veel gevallen.

Apoptose is een vorm van geprogrammeerde celdood, speelt een belangrijke rol bij de immuunrespons op infectie 10. Twee belangrijke routes die leiden tot apoptosegeïdentificeerd: gericht op de mitochondria (intrinsieke apoptose) of directe transductie van het signaal via celdood receptoren in het plasmamembraan (extrinsieke apoptose). De intrinsieke of mitochondriën gemedieerde celdood wordt veroorzaakt door intracellulaire signalen en omvat de activering van Bax en Bak, twee pro-apoptotische leden van de Bcl-2 familie. Deze familie is samengesteld uit pro- en anti-apoptotische regulator eiwitten die celdood 11-14 regelen. Activering van apoptose leidt tot oligomerisatie van Bax en Bak gevolgd door achtereenvolgende permeabilisatie van het mitochondriale buitenste membraan, waardoor cytochroom C introductie in het cytoplasma. Cytochroom C afgifte initieert activering van de effector caspasen 3 en 7 tot activatie van caspase 9 in de apoptosoom 15. Dit leidt tot proteolyse van geselecteerde substraten die onder andere resulteert in de blootstelling van fosfatidylserine aan het celoppervlak 16 en maakt een speciaal DNase die ch fragmentenromatin 17,18.

Om te bepalen waar in de apoptotische cascade individuele effector eiwit interfereert, een induceerbaar expressiesysteem werd toegepast 19. Regulerende systemen voor voorwaardelijke expressie van transgenen hebben een waardevol hulpmiddel bij het ​​analyseren van de functie van een eiwit in de cel of het belang ervan voor weefsel, orgaan en organisme ontwikkeling, evenals tijdens initiatie, progressie en het onderhoud van de ziekte 20-23 geweest. Gewoonlijk induceerbare systemen, zoals het Tet-systeem 24 hier toegepast, vormen een kunstmatige transcriptie-eenheid (zie figuur 1). Eén component is een kunstmatig ontwikkelde transcriptiefactor genaamd tTA (tetracycline-afhankelijke transcriptie activator), gevormd door fusie van de bacteriële transcriptie-repressor TetR 25 aan een zoogdierpatiënt eiwitdomein die transcriptionele activatie of silencing 24,26 bemiddelt. De tweede component is een hybridepromoter, aangeduid als TRE (tetracycline-responsief element), bestaande uit een eukaryotische minimale promoter, die ten minste een TATA-box en een transcriptie-initiatieplaats, verbonden met meerdere herhalingen van de cognate-DNA bindingsplaats voor TetR, tetO 24,25. De derde component is het natuurlijke ligand van TetR, tetracycline of een van zijn derivaten, zoals anhydrotetracycline en doxycycline 25. Na ligand toevoeging aan het kweekmedium, TetR verliest zijn affiniteit voor tetO en dissocieert van het TRE. Daardoor wordt transcriptie van het doelgen opgeheven. Transgene expressie kan derhalve worden strak gecontroleerd in een tijds- en dosisafhankelijke manier in zowel celkweek als bij dieren 20,23,24. Met tTA, transgenexpressie treedt constitutief, behalve bij aanwezigheid van een tetracycline. Dit kan een nadeel in de studie van cytotoxische of oncogene eiwitten omdat tetracycline moet eerst uit het systeem worden verwijderd, voordat transgene expression optreedt en het doeleiwit effecten op de cel kan worden gecontroleerd. Dit kan tijdrovend en niet altijd volledig, vooral in transgene dieren 27. Om deze beperking te pakken, een TetR mutant met een inverse reactie op de aanwezigheid van doxycycline werd gebruikt om een nieuwe transcriptiefactor genereren rtTA (reverse tTA) 28. Het bindt alleen aan de TRE en, tegelijkertijd, transcriptie activeert in aanwezigheid van doxycycline. Residuele lekkages van het systeem, dwz., Transgene expressie in de afwezigheid van TRE-gebonden transcriptiefactor, van hetzij (i) van positie-effecten op genomische integratieplaats, (ii) vanaf het TRE 29 zelf, of (iii) uit niet -specifieke binding van tTA / rtTA 28, werd door de opneming van een extra transcriptiesilencerdomein, genaamd TTS (tetracycline-afhankelijke transcriptionele geluiddemper) 30 aan het systeem. Het vormt een dubbele regulator vergeaeld rtTA (zie figuur 1).Bij afwezigheid van doxycycline, tts bindt aan TRE en actief wordt uitgeschakeld resterende transcriptie. In de aanwezigheid van doxycycline, tts dissocieert van TRE en rtTA bindt gelijktijdig induceren van expressie van het doelwitgen. Deze extra laag stringentie moet vaak zeer actieve cytotoxische eiwitten 31-34 expressie.

Met deze strak dual-regulator systeem kan de apoptotische cascade bij een bepaalde stap waarbij wordt onderzocht of de gegeven effector eiwit kunnen interfereren met apoptose-inductie worden gestart. Deze werkwijze kan niet alleen worden gebruikt om de anti-apoptotische activiteit van bacteriële effector eiwitten te bestuderen, maar ook voor de induceerbare expressie van pro-apoptotische of toxische eiwitten of ontleden interferentie met andere signaalwegen.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Het genereren van stabiele cellijnen die het beoogde eiwit

  1. Bereid media door het toevoegen van warmte geïnactiveerd FCS en 1% penicilline / streptomycine commercieel verkrijgbaar Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) aangevuld met GlutaMAX-I, pyruvaat, en 4,5 g / l D-glucose.
  2. Ontwikkel HEK293 cellen in medium bij 37 ° C in 5% CO 2. Sub-kweken cellen elke derde dag. Verwijder het medium en resuspendeer de cellen in 15 ml vers medium. Pipetteer 1 ml in een nieuwe 75 cm 2 celkweek kolf en voeg 14 ml media.
  3. Analyseer het aantal cellen met een hemocytometer.
  4. Seed HEK293 cellen in een 6-wells plaat met een dichtheid van 2 x 10 5 cellen per putje en incubeer 24 uur.
  5. Voor transfectie gebruiken protocol van de fabrikant van het transfectie reagens. Transfecteren van cellen met pEGFP-C2 of pEGFP-C2-CAEB met de transfectie-reagens. Voor gebruik warmen de transfectie Reagent en de vereiste RT media. Met een 3: 1 verhouding van transfectiereagens tot DNA.
    1. In detail Pipetteer 1,5 ui transfectie reagens direct in 50 gl serumvrij DMEM medium. Bij complexvorming, pipet 0,5 ug DNA dat codeert GFP of GFP-CAEB de transfectie-reagens dat mengsel en incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
    2. Transfecteren cellen door toevoeging van het reactiemengsel in een druppelsgewijze wijze en incubeer bij 37 ° C in 5% CO2 gedurende 24 uur.
  6. Voeg 1 mg / ml geneticine voor selectie van GFP-positieve klonen bij 37 ° C in 5% CO 2.
  7. Na 6 dagen isoleren enkele cellen door flow cytometrie sorteren in een 96-putjesplaat herbergen medium en HEK293 supernatant in een 1: 1 ratio. Genereer HEK293 supernatant uit gekweekte confluente HEK293 cellen die gedurende 15 minuten bij 4966 x g gecentrifugeerd.
  8. Op de volgende dag vervangen door kweekmedium met medium dat 1,50; mg / ml geneticine. Verander een keer per week media. Indien de cellen vormen confluente monolaag, overbrengen naar een 24-wells plaat. Sub-kweken cellen tweemaal per week in een verhouding van 1: 5 in medium dat 1,5 mg / ml geneticine. Tenslotte analyseert het percentage GFP-positieve cellen door immunoblot-analyse en flowcytometrie.

2. Analyse van stabiele cellijnen door immunoblotanalyse

  1. Verwijder de supernatant en was de aangehechte cellen eenmaal met warm PBS. Resuspendeer de cellen in 100 gl 2 x Laemmli-monsterbuffer, verwarm gedurende 5 minuten bij 95 ° C en bewaar bij -20 ° C.
  2. Laad ca. 4 x 10 4 cellen per monster op een 12% SDS-PAGE gel. Bovendien load 6 pi van een commercieel proteïneladder als molecuulgewichtsmerker. Run gels een gelelektroforese systeem onder een constante spanning van 180 V gedurende 45-60 min met 1 x Laemmli loopbuffer.
  3. Blot eiwitten op PVDF-membranen (poriëngrootte van 0.45 pm) bij een constante spanning van 16 V gedurende 60 min onder toepassing van een Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell.
  4. Block membranen in 10 ml van 5% niet vette droge melk in PBS / 0,05% Tween 20 (MPT) gedurende 1 uur bij KT.
  5. Verdun 4 ui van anti-GFP antilichaam in 4 ml van MPT en membranen geïncubeerd O / N bij 4 ° C.
  6. Voer drie wasstappen 10 minuten met 10 ml PBS / 0,05% Tween 20.
  7. Incubeer membranen met 0,8 ul horseradish peroxidase-geconjugeerde secundaire antilichamen in 4 ml van MPT.
  8. Na 1 uur incubatie bij KT, membranen driemaal wassen met PBS / 0,05% Tween 20 (zoals beschreven in 2.6) en detecteren mierikswortel peroxidase activiteit met een commerciële kit volgens het protocol van de fabrikant. Solliciteer standaard apparatuur voor film ontwikkeling eiwitbanden te visualiseren.

3. Analyseer de cellen met behulp van een flowcytometer.

  1. Resuspendeer cellen in PBS. Gebruik HEK293 cellen als negatieve controle naar voren te passen scatter (FSC) en zijwaartse verstrooiing (SSC), zodat de cellen op schaal. Teken een hek op levende cellen door exclusief cel wambuizen, aggregaten en celresten.
  2. Pas de fotomultiplicatorbuis (PMT) winst, zodat de ongekleurde cellen aan de linkerkant van het histogram voor de FL1-kanaal (488 nm argon laser).
  3. Om de fluorescentie-intensiteit van HEK293-GFP en HEK293-GFP-CAEB cellen te analyseren openen het histogram van de FL1-kanaal en het verwerven van 10.000 gebeurtenissen op de gated bevolking.
  4. Analyseer de gegevens met behulp van FACS-analyse software.

4. Transfectie van de stabiele cellijn met de induceerbare expressie vectorsysteem

  1. Seed HEK293 cellen die stabiel tot expressie GFP of GFP-CAEB in een 12-wells plaat met een dichtheid van 1 x 10 5 cellen / putje.
  2. 19 uur na het zaaien, co-transfecteren van de cellen met regulator plasmide en respons plasmide ofwel coderen Bax of geactiveerd caspase 3.
    1. Co-transfecteren van de stabiele HEK293 cellenmet 100 ng pWHE125-P regulator plasmide (figuur 2) en 100 ng van de plasmiden response pWHE655-hBax of pWHE655-revCasp3 (Figuur 3) en 0,4 pl polyethyleenimine.
    2. Bereid de DNA en polyethyleenimine transfectiereagens elk in 75 pl Opti-MEM medium en incubeer gedurende precies 5 minuten bij kamertemperatuur. Bij complexvorming Incubeer beide mengsels samen 15 minuten bij kamertemperatuur.
  3. Voeg het polyethyleenimine / DNA-oplossing druppelsgewijs aan de cellen en incubeer bij 37 ° C in 5% CO 2.

5. Inductie van apoptose

  1. 5 uur na transfectie, induceren de expressie van pro-apoptotische eiwitten door toevoeging van 1 ug / ml doxycycline aan het cultuurmedium. Incubeer cellen gedurende 18 uur bij 37 ° C in 5% CO 2.

6. Analyse van de als gastheer gebruikte cel apoptose door immunoblotanalyse

  1. Inspecteer cellen voorafgaand aan harvesting onder de lichtmicroscoop te controleren op celdood inductie. Apoptotische cellen zijn detecteerbaar door de aanwezigheid van apoptotische lichamen rondom de stervende cel.
  2. Verwijder de supernatant en was de aangehechte cellen eenmaal met warm PBS. Resuspendeer de cellen in 100 gl 2 x Laemmli-monsterbuffer, verwarm gedurende 5 minuten bij 95 ° C en bewaar bij -20 ° C.
  3. Laad ca. 4 x 10 4 cellen per monster op een 12% SDS-PAGE gel. Bovendien load 6 pi van een commercieel proteïneladder als molecuulgewichtsmerker. Run gels een gelelektroforese systeem onder een constante spanning van 180 V gedurende 45-60 min met 1 x Laemmli loopbuffer.
  4. Blot eiwitten op PVDF-membranen (poriegrootte 0,45 um) bij een constante spanning van 16 V gedurende 60 min onder toepassing van een Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell.
  5. Block membranen in 10 ml van 5% niet vette droge melk in PBS / 0,05% Tween 20 (MPT) gedurende 1 uur bij KT.
  6. Verdunnen 4 μl anti-gesplitste poly ADP-ribose polymerase (PARP) antilichaam in 4 ml van MPT en geïncubeerd O / N bij 4 ° C.
  7. Voer drie wasstappen 10 minuten met 10 ml PBS / 0,05% Tween 20.
  8. Incubeer membranen met 0,8 ul horseradish peroxidase-geconjugeerde secundaire antilichamen verdund in 4 ml MPT.
  9. Na 1 uur incubatie bij KT, membranen driemaal wassen met PBS / 0,05% Tween 20 (zoals beschreven in 6.7) en detecteren mierikswortel peroxidase activiteit met een commerciële kit volgens het protocol van de fabrikant. Solliciteer standaard apparatuur voor film ontwikkeling eiwitbanden te visualiseren.
  10. Verwijder gebonden antilichamen door 30 minuten incubatie bij kamertemperatuur met 7 ml Western Blot Stripping Buffer.
  11. Na drie wasbehandelingen met PBS / 0,05% Tween 20 (zoals beschreven in 6.7), probe de membranen met 4 pl anti-actine antilichaam in 4 ml MPT O / N bij 4 ° C.
  12. Na drie wasstappen met MPT (zoals in 6,7), incubeer de membranen met 0,8 gl horseradish peroxidase-geconjugeerde secundaire antilichamen verdund in 4 ml van MPT.
  13. Na 1 uur incubatie bij KT, membranen driemaal wassen met PBS / 0,05% Tween 20 (zoals is beschreven in 6,7 en detecteren mierikswortel peroxidase activiteit met een commerciële kit volgens het protocol van de fabrikant. Toepassen standaarduitrusting film ontwikkeling eiwitbanden zichtbaar.
    Opmerking: alle incubatiestappen werden uitgevoerd op een plaat schudder gedurende de aangegeven tijd en temperatuur.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten eerste, HEK293-cellijnen die stabiel het eiwit van belang (CAEB) als GFP-fusie-eiwit werden vastgesteld. Als controle werden HEK293-cellijnen die stabiel GFP ook gegenereerd. Expressie van GFP en GFP-CAEB werd gecontroleerd door immunoblot analyse. De representatieve immunoblot (Figuur 4A) toont stabiele en duidelijk detecteerbare expressie van GFP en GFP-CAEB. Echter, deze test niet bepalen of alle cellen tot expressie GFP of GFP-CAEB. Daarom werden de stabiel getransfecteerde HEK293 cellijnen gean...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Vele pathogene bacteriën herbergen secretiesystemen afscheiden of translocatie van bacteriële effector eiwitten in de gastheercel. Deze effector eiwitten hebben het vermogen om processen en cascades in de gastheercel, waardoor de bacteriën om te overleven en repliceren hun intracellulaire niche. Inzicht in de biochemische activiteiten en de moleculaire mechanismen van de effector eiwitten zal helpen naar een beter begrip van de pathogeniteit en kunnen helpen om nieuwe therapeutische instrumenten voor de bestrijding van ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) via de Collaborative Research Initiative 796 (SFB796) aan A.L. en C.B., en via de ERA-NET PathoGenoMics 3de oproep aan A.L.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
DMEMlife technologies31966-021
FCSBiochromS0115
Pen/Streplife technologies15140-122
OptiMEMlife technologies51985
X-tremeGENE 9Roche6365752001
GeneticinRothCP11.3
PolyethyleniminePolyscienes23966
DoxycyclineSigma AldrichD9891
Mini-PROTEAN Tetra CellBio-Rad165-8000EDU
Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer CellBio-Rad170-3940
PageRuler Prestained Protein LadderThermo Scientific26616
PVDF membraneMilliporeIPVH00010
anti-GFP life technologiesA6455
anti-cleaved PARPBD Bioscience611038
anti-actinSigma AldrichA2066
Mouse IgG (H+L)-HRPODianova111-035-062
Rabbit IgG (H+L)-HRPODianova111-035-045
ECL Western Blotting SubstrateThermo Scientific32106
Restore Plus Western Blot Stripping BufferThermo Scientific46428

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Galán, J. E. Common themes in the design and function of bacterial effectors. Cell Host Microbe. 5 (6), 571-579 (2009).
  2. Banga, S., et al. Legionella pneumophila inhibits macrophage apoptosis by targeting pro-death members of the Bcl2 protein family. Proc Natl Acad Sci USA. 104 (12), 5121-5126 (2007).
  3. Laguna, R. K., Creasey, E. A., Li, Z., Valtz, N., Isberg, R. R. A Legionella pneumophila-translocated substrate that is required for growth within macrophages and protection from host cell death. Proc Natl Acad Sci USA. 103 (49), 18745-18750 (2006).
  4. Schmid, M. C., et al. A translocated bacterial protein protects vascular endothelial cells from apoptosis. PLoS Pathog. 2 (11), e115(2006).
  5. Nogueira, C. V., Carey, K. L., Roy, C. R. Inhibition of pathogen-induced apoptosis by a Coxiella burnetiitype IV effector protein. Proc Natl Acad Sci USA. 107 (44), 18997-19001 (2010).
  6. Rudel, T., Kepp, O., Kozjak-Pavlovic, V. Interactions between bacterial pathogens and mitochondrial cell death pathways. Nat Rev Microbiol. 8 (10), 693-705 (2010).
  7. Klingenbeck, L., Eckart, R. A., Berens, C., Lührmann, A. The Coxiella burnetii type IV secretion system substrate CaeB inhibits intrinsic apoptosis at the mitochondrial level. Cell Microbiol. 15 (4), 675-687 (2012).
  8. Raymond, B., et al. Subversion of trafficking, apoptosis, and innate immunity by type III secretion system effectors. Trends Microbiol. 21 (8), 430-441 (2013).
  9. Eckart, R. A., et al. Antiapoptotic activity of Coxiella burnetii effector protein AnkG is controlled by p32-dependent trafficking. Infect Immun. 82 (7), 2763-2771 (2014).
  10. Byrne, G. I., Ojcius, D. M. Chlamydia and apoptosis: life and death decisions of an intracellular pathogen. Nat Rev Microbiol. 2 (10), 802-808 (2004).
  11. Delft, M. F., Huang, D. C. S. How the Bcl-2 family of proteins interact to regulate apoptosis. Cell Res. 16 (2), 203-213 (2006).
  12. Willis, S. N., Adams, J. M. Life in the balance: how BH3-only proteins induce apoptosis. Curr Opin Cell Biol. 17 (6), 617-625 (2005).
  13. Shamas-Din, A., Kale, J., Leber, B., Andrews, D. W. Mechanisms of action of Bcl-2 family proteins. Cold Spring Harb Perspect Biol. 5 (4), a008714(2013).
  14. Cory, S., Adams, J. M. The Bcl2 family: regulators of the cellular life-or-death switch. Nat Rev Cancer. 2 (9), 647-656 (2002).
  15. Adams, J. M., Cory, S. Apoptosomes: engines for caspase activation. Curr Opin Cell Biol. 14 (6), 715-720 (2002).
  16. Suzuki, J., Denning, D. P., Imanishi, E., Horvitz, H. R., Nagata, S. Xk-related protein 8 and CED-8 promote phosphatidylserine exposure in apoptotic cells. Science. 341 (6144), 403-406 (2013).
  17. Cory, S. Cell death throes. Proc Natl Acad Sci USA. 95 (21), 12077-12079 (1998).
  18. Enari, M., et al. A caspase-activated DNase that degrades DNA during apoptosis, and its inhibitor ICAD. Nature. 391 (6662), 43-50 (1998).
  19. Fussenegger, M. The impact of mammalian gene regulation concepts on functional genomic research, metabolic engineering, and advanced gene therapies. Biotechnol Prog. 17 (1), 1-51 (2001).
  20. Felsher, D. W. Reversibility of oncogene-induced cancer. Curr Opin Genet Dev. 14 (1), 37-42 (2004).
  21. Maherali, N., et al. A high-efficiency system for the generation and study of human induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 3 (3), 340-345 (2008).
  22. Kozlova, E. N., Berens, C. Guiding differentiation of stem cells in vivo by tetracycline-controlled expression of key transcription factors. Cell Transplant. 21 (12), 2537-2554 (2012).
  23. Reijmers, L., Mayford, M. Genetic control of active neural circuits. Front Mol Neurosci. 2, 27(2009).
  24. Gossen, M., Bujard, H. Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters. Proc Natl Acad Sci USA. 89 (12), 5547-5551 (1992).
  25. Hillen, W., Berens, C. Mechanisms underlying expression of Tn10 .encoded tetracycline resistance. Annu Rev Microbiol. 48, 345-369 (1994).
  26. Deuschle, U., Meyer, W. K., Thiesen, H. J. Tetracycline-reversible silencing of eukaryotic promoters. Mol Cell Biol. 15 (4), 1907-1914 (1995).
  27. Robertson, A., Perea, J., Tolmachova, T., Thomas, P. K., Huxley, C. Effects of mouse strain, position of integration and tetracycline analogue on the tetracycline conditional system in transgenic mice. Gene. 282 (1-2), 65-74 (2002).
  28. Gossen, M., et al. Transcriptional activation by tetracyclines in mammalian cells. Science. 268 (5218), 1766-1769 (1995).
  29. Rang, A., Will, H. The tetracycline-responsive promoter contains functional interferon-inducible response elements. Nucleic Acids Res. 28 (5), 1120-1125 (2000).
  30. Freundlieb, S., Schirra-Müller, C., Bujard, H. A tetracycline controlled activation/repression system with increased potential for gene transfer into mammalian cells. J Gene Med. 1 (1), 4-12 (1999).
  31. Knott, A., et al. An optimized conditional suicide switch using doxycycline-dependent expression of human tBid. Cancer Biol Ther. 4 (5), 532-536 (2005).
  32. Danilchanka, O., et al. An outer membrane channel protein of Mycobacterium tuberculosis with exotoxin activity. Proc Natl Acad Sci USA. 111 (18), 6750-6755 (2014).
  33. Danke, C., et al. Adjusting transgene expression levels in lymphocytes with a set of inducible promoters. J Gene Med. 12 (6), 501-515 (2010).
  34. Maueröder, C., Chaurio, R. A., Platzer, S., Munoz, L. E., Berens, C. Model systems for rapid and slow induction of apoptosis obtained by inducible expression of pro-apoptotic proteins. Autoimmunity. 46 (5), 329-335 (2013).
  35. Srinivasula, S. M., et al. Generation of constitutively active recombinant caspases-3 and -6 by rearrangement of their subunits. J Biol Chem. 273 (17), 10107-10111 (1998).
  36. Baron, U., Freundlieb, S., Gossen, M., Bujard, H. Co-regulation of two gene activities by tetracycline via a bidirectional promoter. Nucleic Acids Res. 23 (17), 3605-3606 (1995).
  37. Anastassiadis, K., et al. A predictable ligand regulated expression strategy for stably integrated transgenes in mammalian cells in culture. Gene. 298 (2), 159-172 (2002).
  38. Qu, Z., et al. Homogeneity and long-term stability of tetracycline-regulated gene expression with low basal activity by using the rtTA2S-M2 transactivator and insulator-flanked reporter vectors. Gene. 327 (1), 61-73 (2004).
  39. Spencer, S. L., Gaudet, S., Albeck, J. G., Burke, J. M., Sorger, P. K. Non-genetic origins of cell-to-cell variability in TRAIL-induced apoptosis. Nature. 459 (7245), 428-432 (2009).
  40. Agha-Mohammadi, S., et al. Second-generation tetracycline-regulatable promoter: repositioned tet operator elements optimize transactivator synergy while shorter minimal promoter offers tight basal leakiness. J Gene Med. 6 (7), 817-828 (2004).
  41. Pluta, K., Luce, M. J., Bao, L., Agha-Mohammadi, S., Reiser, J. Tight control of transgene expression by lentivirus vectors containing second-generation tetracycline-responsive promoters. J Gene Med. 7 (6), 803-817 (2005).
  42. Hoffmann, A., Villalba, M., Journot, L., Spengler, D. A novel tetracycline-dependent expression vector with low basal expression and potent regulatory properties in various mammalian cell lines. Nucleic Acids Res. 25 (5), 1078-1079 (1997).
  43. Loew, R., Heinz, N., Hampf, M., Bujard, H., Gossen, M. Improved Tet-responsive promoters with minimized background expression. BMC Biotechnol. 10, 81(2010).
  44. Heinz, N., et al. Retroviral and transposon-based tet-regulated all-in-one vectors with reduced background expression and improved dynamic range. Hum Gene Ther. 22 (2), 166-176 (2011).
  45. Toniatti, C., Bujard, H., Cortese, R., Ciliberto, G. Gene therapy progress and prospects: transcription regulatory systems. Gene Ther. 11 (8), 649-657 (2004).
  46. Ye, H., Fussenegger, M. Synthetic therapeutic gene circuits in mammalian cells. FEBS Lett. 588 (15), 2537-2544 (2014).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Bacterial Virulence FactorsIntracellular SignalingInducible Expression SystemApoptotic CascadeWestern BlottingFlow CytometryDoxycycline InductionCaspase 3Bax ProteinPARP Cleavage

Related Articles