Isolatie en karakterisering van neutrofielen met Anti-Tumor Properties

Samenvatting

Neutrofielen spelen niet alleen een belangrijke rol bij de verdediging van het gastheerlichaam tegen binnendringende micro-organismen, maar zijn ook betrokken bij de immuunbewaking van tumorcellen. Hier beschrijven we technieken met betrekking tot de isolatie van neutrofielen met anti-tumoreigenschappen en methoden voor het monitoren van anti-tumor neutrofielen functie in vitro en in vivo.

Samenvatting

Neutrofielen, de meest voorkomende van witte bloedcellen in de menselijke circulatie, spelen een belangrijke rol bij de afweer tegen binnendringende micro-organismen. Bovendien neutrofielen spelen een centrale rol in de immuunbewaking van tumorcellen. Ze hebben het vermogen om tumorcellen te herkennen en te induceren tumorceldood hetzij door een cel contact-afhankelijke mechanisme met waterstofperoxide of door middel van antilichaam-afhankelijke celgemedieerde cytotoxiciteit (ADCC). Neutrofielen met anti-tumor activiteit kunnen worden geïsoleerd uit perifeer bloed van kankerpatiënten en tumordragende muizen. De neutrofielen worden genoemd tumor meegevoerde neutrofielen (TEN) het onderscheiden van neutrofielen van gezonde proefpersonen of naïeve muizen die geen significante tumor cytotoxische activiteit vertonen. Vergeleken met andere witte bloedcellen, neutrofielen tonen verschillende drijfvermogen waardoor het mogelijk is om een> 98% zuivere populatie neutrofielen te verkrijgen wanneer onderworpen aan een dichtheidsgradiënt. Maar naastde normale hoge dichtheid neutrofielen populatie (HDN) bij kankerpatiënten, in tumordragende muizen, evenals onder chronische ontstekingsaandoeningen, verschillende low-density neutrofielen populaties (LDN) zijn opgenomen in de circulatie. LDN co-zuivert met de mononucleaire fractie en kan worden gescheiden van mononucléaire cellen met behulp van positieve of negatieve selectie strategieën. Wanneer de zuiverheid van de geïsoleerde neutrofielen wordt bepaald door flow-cytometrie, kunnen ze worden toegepast voor in vitro en in vivo functionele assays. We beschrijven technieken voor het bewaken van de antitumoractiviteit van neutrofielen, hun vermogen om te migreren en reactieve zuurstofsoorten te produceren, alsmede toezicht op hun fagocytische capaciteit ex vivo. We technieken beschrijven verder de neutrofielen in vivo traceeretiket en hun anti-metastatisch vermogen in vivo te bepalen. Al deze technieken zijn essentieel voor het begrip van het verkrijgen en karakteriseren neutrofielen met anti-tumorfunctie.

Inleiding

Neutrofielen werden aanvankelijk gekarakteriseerd als het aangeboren immuunsysteem cellen die als eerste lijn verdediging tegen binnendringende micro-organismen. Vandaag de dag is het bekend dat neutrofielen hebben verdergaande functies, betrokken zijn bij de montage van adaptieve immuunreacties tegen vreemde antigenen ^1,2, het reguleren van hematopoiese ^3, angiogenese ⁴ en wondgenezing ^5. Daarbij mag neutrofielen tumorgroei en metastatische progressie beïnvloeden door hun pro- en anti-tumor activiteiten ^6,7. Neutrofielen worden gekenmerkt door een polymorfe gesegmenteerde kern (vandaar aangeduid polymorfonucleai....

Protocol

Dieren: 5-7 weken oude BALB / c muizen werden gekocht bij Harlan (Israel). Alle experimenten met dieren werden goedgekeurd door de Hebreeuwse Universiteit van de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC). Human monsters: Verzamelen van bloed van kankerpatiënten en gezonde vrijwilligers werd goedgekeurd door Hadassah Medical Center Institutional Review Board (IRB).

1. Inductie van neutrofielen met Anti-tumor Properties in vivo met behulp van een Breast Cancer Mouse Model.

LET OP: Alle stappen moeten worden uitgevoerd met behulp van steriele oplossingen in een laminaire luchtstroom (LAF) Bio-Saf....

Resultaten

In een recente studie van een anti-metastatische werking van neutrofielen ⁶ identificeerden we. Neutrofielen van tumordragende muizen verwerven van een cytotoxische fenotype en het vermogen om tumorcellen te doden ^6. Dit in tegenstelling tot neutrofielen uit naïeve muizen die geen significante anti-tumor effect ⁶ hebben. Enkele van de in de sectie protocol beschreven technieken gebruikt voor het bestuderen van anti-tumor neutrofielfunctie in vitro en in vivo ^6.

Discussie

Neutrofielen zijn de meest voorkomende van witte bloedcellen en de eerste responders bij infecties en ontstekingen. Als zodanig zijn ze zeer gevoelig voor externe stimuli en zijn allemaal toegewezen. Bovendien neutrofielen een zeer korte halfwaardetijd en een hoge omloopsnelheid. Samen vormen deze elementen voeren een aantal problemen bij het werken met neutrofielen, zodat unieke experimentele strategieën nodig. Zo zijn er verschillende neutrofielen zuiveringsstrategieën, elk met zijn eigen voor- en nadelen.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
CELL LINES
Mouse 4T1 breast carcinoma cells	ADCC	CRL-2539	Growth medium: DMEM + 10 % heat-inactivated FBS
PLASTIC WARES AND EQUIPMENTS
24-well Tissue Culture Plate	Falcon	353047	Steriele
100 mm Tissue Culture Plate	Corning	430167	Steriele
25 cm2 Tissue Culture Flask	Nunc	156340	Steriele
90 mm Bacterial Grade Culture Dish	Miniplast, Ein Shemer, Israel	20090-01-017	Steriele
15 ml Sterile Conical Centrifuge Tube	Miniplast, Ein Shemer, Israel	835015-40-111	Steriele
50 ml Sterile Conical Centrifuge Tube	Miniplast, Ein Shemer, Israel	835050-21-111	Steriele
Falcon 12 x 75 mm Round-Bottom Polystyrene Tube	Becton Dickinson	352058	Steriele
Millicell 24 Migration Plate with a pore size of 5μm	Merck Millipore	PSMT010R1	Steriele
White 96-Flat-Bottom Well Plate	Costar	3917	Steriele
Cell Strainer (40 mm)	BD Falcon	352340	Steriele
20G x 1.5" Needle	BD Microlance 3	301300	Steriele
23G x 1" Needle	BD Microlance 4	300800	Steriele
25G x 5/8" Needle	BD Microlance 5	300600	Steriele
0.3 ml Syringe with a 30G x 8mm Needle	BD Micro-Fine Plus Demi	320829	Steriele
9 mm Clips	BD, AutoClip	427631	Steriele
EasySep Magnet	STEMCELL Technologies	18000
MACS LS Separation Column	Miltenyi Biotech	130-042-201	Steriele
MidiMACS Separator Magnet	Miltenyi Biotech	130-042-302
MACS MultiStand	Miltenyi Biotech	130-042-303
Microscope Glass Slide	Menzel-Gläser Superfrost  Plus Thermo	J1800AMNZ
Orbital Shaker	Sky line, ELMI	S-3.02.10L
Plate Reader	TECAN	InfiniteF200Pro
POWDER
Bovine serum albumin (BSA), fraction V	Sigma	A7906
Bromodeoxyuridine (BrdU)	BD Pharmingen	550891	Steriele
CFSE (5-(and 6-)-Carboxyfluorescein diacetate, succinimidyl ester)	Molecular Probes	C1157
Dextran T500	Sigma	31392
Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa	Sigma	H3149
Sodium azide (NaN3)	Sigma	S8032	Highly toxic, handle with care
Thioglycollate powder	Difco	225650
Zymosan A	Sigma	Z4250
MEDIA AND SUPPLEMENTS
Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM)	Sigma	D5796	Steriele
Opti-MEM® I reduced serum medium	Life Technologies	31985062	Steriele
Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 medium	Sigma	R8758	Steriele
Foetal bovine serum (FBS), heat-inactivated	Sigma	F9665	Steriele
L-Glutamine	Biological Industries, Beth HaEmek, Israel	03-020-1A	Steriele
Sodium pyruvate	Biological Industries, Beth HaEmek, Israel	03-042-1B	Steriele
Penicillin Streptomycin x 1000 solution	Biological Industries, Beth HaEmek, Israel	03-031-5	Steriele
Phosphate buffered saline (PBS) without Mg2+ and Ca2+	Biological Industries, Beth HaEmek, Israel	02-023-1	Steriele
PBS x 10 without Ca2+ and Mg2+	Biological Industries, Beth HaEmek, Israel	02-023-5A	Steriele
HPLC grade water	J.T. Baker	4218-03	Autoclave
SOLUTIONS
ACK – Ammonium-Chloride-Potassium	Life Technologies	A10492-01
Bromodeoxyuridine (BrdU) solution (10 mg/ml) in PBS			Dissolve 10 mg of BrdU in 1 ml PBS and sterile filter.
CFSE, 5 mM in DMSO			Dissolve 2.8 mg of CFSE in 1 ml DMSO. Divide into 10 ml aliquots in sterile 200 ml tubes and store in the dark at -20oC.
Eosin Y solution	Sigma	HT110-2-32
Hanks' balanced salt solution	Biological Industries, Beth HaEmek, Israel	02-016-1A	Steriele
Heparin, 20 mg/ml in PBS			Dissolve 100 mg Heparin in 5 ml sterile PBS, and sterile filter through a 0.2 mm filter.
Histopaque-1119	Sigma	11191	Sterile filter through a 0.2 mm filter.
Histopaque-1077	Sigma	10771	Sterile filter through a 0.2 mm filter.
Luciferase cell culture lysis buffer x5	Promega	E153A	Dilute 1:5 in sterile water just before use.
Luciferase assay solution	Promega	E1501	Contains luciferase assay substrate powder (E151A) and luciferase assay buffer (E152A)