Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Isolatie en karakterisering van neutrofielen met Anti-Tumor Properties

24.7K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/52933

⸱

19 juni 2015

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Developmental Biology and Cancer Research, Institute for Medical Research Israel-Canada, Hebrew University Medical School, 2Institute of Pulmonary Medicine, Hadassah-Hebrew University Medical Center

In dit artikel

Samenvatting

Neutrofielen spelen niet alleen een belangrijke rol bij de verdediging van het gastheerlichaam tegen binnendringende micro-organismen, maar zijn ook betrokken bij de immuunbewaking van tumorcellen. Hier beschrijven we technieken met betrekking tot de isolatie van neutrofielen met anti-tumoreigenschappen en methoden voor het monitoren van anti-tumor neutrofielen functie in vitro en in vivo.

Samenvatting

Neutrofielen, de meest voorkomende van witte bloedcellen in de menselijke circulatie, spelen een belangrijke rol bij de afweer tegen binnendringende micro-organismen. Bovendien neutrofielen spelen een centrale rol in de immuunbewaking van tumorcellen. Ze hebben het vermogen om tumorcellen te herkennen en te induceren tumorceldood hetzij door een cel contact-afhankelijke mechanisme met waterstofperoxide of door middel van antilichaam-afhankelijke celgemedieerde cytotoxiciteit (ADCC). Neutrofielen met anti-tumor activiteit kunnen worden geïsoleerd uit perifeer bloed van kankerpatiënten en tumordragende muizen. De neutrofielen worden genoemd tumor meegevoerde neutrofielen (TEN) het onderscheiden van neutrofielen van gezonde proefpersonen of naïeve muizen die geen significante tumor cytotoxische activiteit vertonen. Vergeleken met andere witte bloedcellen, neutrofielen tonen verschillende drijfvermogen waardoor het mogelijk is om een> 98% zuivere populatie neutrofielen te verkrijgen wanneer onderworpen aan een dichtheidsgradiënt. Maar naastde normale hoge dichtheid neutrofielen populatie (HDN) bij kankerpatiënten, in tumordragende muizen, evenals onder chronische ontstekingsaandoeningen, verschillende low-density neutrofielen populaties (LDN) zijn opgenomen in de circulatie. LDN co-zuivert met de mononucleaire fractie en kan worden gescheiden van mononucléaire cellen met behulp van positieve of negatieve selectie strategieën. Wanneer de zuiverheid van de geïsoleerde neutrofielen wordt bepaald door flow-cytometrie, kunnen ze worden toegepast voor in vitro en in vivo functionele assays. We beschrijven technieken voor het bewaken van de antitumoractiviteit van neutrofielen, hun vermogen om te migreren en reactieve zuurstofsoorten te produceren, alsmede toezicht op hun fagocytische capaciteit ex vivo. We technieken beschrijven verder de neutrofielen in vivo traceeretiket en hun anti-metastatisch vermogen in vivo te bepalen. Al deze technieken zijn essentieel voor het begrip van het verkrijgen en karakteriseren neutrofielen met anti-tumorfunctie.

Inleiding

Neutrofielen werden aanvankelijk gekarakteriseerd als het aangeboren immuunsysteem cellen die als eerste lijn verdediging tegen binnendringende micro-organismen. Vandaag de dag is het bekend dat neutrofielen hebben verdergaande functies, betrokken zijn bij de montage van adaptieve immuunreacties tegen vreemde antigenen 1,2, het reguleren van hematopoiese 3, angiogenese 4 en wondgenezing 5. Daarbij mag neutrofielen tumorgroei en metastatische progressie beïnvloeden door hun pro- en anti-tumor activiteiten 6,7. Neutrofielen worden gekenmerkt door een polymorfe gesegmenteerde kern (vandaar aangeduid polymorfonucleaire (PMN) leukocyten) en ten minste drie verschillende subklassen van granules en secretorische blaasjes 8 (Figuur 1 A-C).

Neutrofielen hebben grote fagocytische capaciteit en hoge NADPH-oxidase activiteit essentieel is voor microbiële verwijdering en scheiden een groot aantal chemokinen belangrijk bijtraction extra neutrofielen en andere immuuncellen naar de plaats van ontsteking 8,9. Neutrofielen worden gekenmerkt door de expressie van een groot aantal oppervlaktereceptoren zoals Toll-achtige receptoren (TLRs), C-type lectine receptoren (CLRS), complement receptor 3 (CD11b / CD18) en andere adhesiemoleculen (bijvoorbeeld, L-selectine, LFA-1, VLA-4 en carcinoembryonaal antigen gerelateerde celadhesie molecuul 3 (CEACAM3 / CD66b)), chemokine receptoren (bijvoorbeeld, CXCR1, CXCR2, CCR1, CCR2), chemoattractant receptoren (bv PAFR, LTB 4 R en C5AR) , cytokine receptoren (bijvoorbeeld, G-CSFR, IL-1 R, IL-4R, IL-12R, IL-18R, TNFR), formyl-peptide receptoren (bv FPR1-3) en Fc-receptoren (bijvoorbeeld CD16 (FcyRIII ), CD32 (FcyRII) en CD64 (FcyRI) 10. Bij muizen worden gewoonlijk geïdentificeerd als neutrofielen CD11b + Ly6G +, terwijl menselijke neutrofielen worden geïdentificeerd met de CD 11, CD15, CD16 en CD66b leukocyten markers. Ook wordt algemeen aanvaard kleur wordt de granule-eiwitten myeloperoxidase (MPO) en neutrofiel elastase (NE) voor detectie van neutrofielen in weefsels.

Het blijft onduidelijk of de diverse functies van neutrofielen worden gemedieerd door dezelfde cel of door afzonderlijke cel subpopulaties. Accumuleren gegevens wijzen op de aanwezigheid van een heterogene populatie neutrofielen die een hoge mate van plasticiteit die door pro-inflammatoire stimuli en hun micro 11,12 vertoont. Fridlender et al. 13 hebben schromelijk verdeelde de neutrofielen bij kanker in twee belangrijke subpopulaties genoemd N1 met anti-tumor eigenschappen en N2 met pro-tumor eigenschappen. Bij kanker, alsmede in chronische ontsteking, is er een extra subpopulatie uit granulocytic myeloide suppressor cellen (G-MDSCs) dat T-celresponsen 14 onderdrukken. G-MDSCs worden als onrijpe myeloïde cellen gekenmerkt door een CD11b + Ly6C zijnlage Ly6G hi fenotype in muizen 15, terwijl het hebben van een CD15 + / CD16 laag fenotype in de menselijke 16. G-MDSCs uiten hogere niveaus van arginase en myeloperoxidase, terwijl lagere niveaus van cytokines en chemokines dan normaal circulerende neutrofielen. Ze zijn minder fagocytische en trekvogels, maar produceren hogere niveaus van ROS 15,17,18. In dit document zullen we een aantal fundamentele methoden voor isolatie en karakterisering van neutrofielen met anti-tumor eigenschappen te beschrijven.

Terwijl neutrofielen vormen de grootste bevolking van alle witte bloedcellen in het menselijk omloop (45-70%; 1800 - 6000 / ul), bij muizen, onder normale omstandigheden, ze zijn nogal mager (10 - 15%; 300-500 / ul ). De neutrofielen stijgt gestaag op ontstekingen en soms met kanker, die een toestand van chronische ontsteking 7 vertegenwoordigt. Neutrofielen ontwikkelen van multipotent gemeenschappelijke myeloïde voorloper (CMP) cells in het beenmerg, door een differentiatieproces passeren van de fasen van myeloblasten (MB), promyelocyten (PM), myelocyten (MC), metamyelocyten (MM) en band cellen (BC) 8. De volwassen, post-mitotische neutrofielen kan binnen het beenmerg blijven voor 4 - 7 dagen voordat ze worden vrijgegeven aan de circulatie 8. Neutrofielen omzet in het bloed is gewoonlijk snel met een gemiddelde halfwaardetijd van 6-12 uur, eventueel verlengd onder ontstekingsaandoeningen. Gestimuleerde neutrofielen hebben anti-tumorigene activiteit, een functie die kan worden verworven door het blootstellen van de naïeve neutrofielen naar de chemokinen IL-8 (CXCL2), CCL2, CCL5 en CXCL5 6,19 of kunstmatig beperkt door ze bloot te stellen aan de forbolester forbol 12 -myristate 13-acetaat (PMA) 6.

De korte halfwaardetijd van bloed neutrofielen samen met het lage aantal neutrofielen (~ 3-5 x 10 5) bereikt van 1 ml bloed van een naïeve 6-8 weken oude muis, hebben het gemaaktmoeilijk om de functie van circulerende neutrofielen muis in vitro onderzoeken. Om deze moeilijkheid te overwinnen, zijn andere bronnen gebruikt. Zo kunnen grote aantallen neutrofielen worden verkregen uit het beenmerg 20 of het peritoneum volgend op de inductie van steriele ontsteking (bijvoorbeeld na intraperitoneale injectie van thioglycolaat cultuurvloeistof of Zymosan A). Opgemerkt wordt dat neutrofielen verkregen uit de peritoneale holte geen anti-tumorontwikkeling (ongepubliceerde waarneming) uitoefenen.

. Granot et al opgemerkt dat 6 BALB / c muizen geïnoculeerd met orthotopically de muis 4T1 borstcarcinoom cellijn ontwikkelen neutrofilie die verergert tot tumorprogressie 6 (figuur 2A), zodat 20-40000000 bloedneutrofielen gemakkelijk worden geïsoleerd uit 1 ml bloed 3-4 weken na de tumor-inoculatie. Deze neutrofielen hebben anti-tumor activiteiten verworven, en hebben daarom COI geweestned-tumor meegevoerde neutrofielen (TEN), teneinde deze te onderscheiden van naïeve neutrofielen 6 (Figuur 2B). Terwijl high-density neutrofielen (HDN figuur 1A) sterk anti-tumorigene, low-density neutrofielen (LDN figuur 1B) gegenereerd in de context van kanker niet 21. Ook, high-density neutrofielen uit het beenmerg en de milt van tumordragende muizen anti-tumor activiteit (ongepubliceerde gegevens). Opgemerkt wordt dat bij tumorprogressie de milt geleidelijk vergroot (splenomegalie), met toenemende hoeveelheden van neutrofielen.

Opgemerkt wordt dat de TEN ook geproduceerd in andere modellen van kanker waaronder zowel spontane (MMTV-PyMT en MMTV-Wnt1 mammaire tumoren en k-Ras driven longtumoren) en geïnjecteerd (AT-3 (MMTV-PyMT) en E0771 borstcarcinoom cellen, LLC Lewis longcarcinoom cellen en B16-F10 melanoomcellen). De mate van neutrofiel mobilisatie in deze tumof modellen veel minder dan van 4T1-geïnoculeerde muizen, tot 5-10 x 10 6 neutrofielen in 1 ml bloed na 3 weken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Dieren: 5-7 weken oude BALB / c muizen werden gekocht bij Harlan (Israel). Alle experimenten met dieren werden goedgekeurd door de Hebreeuwse Universiteit van de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC). Human monsters: Verzamelen van bloed van kankerpatiënten en gezonde vrijwilligers werd goedgekeurd door Hadassah Medical Center Institutional Review Board (IRB).

1. Inductie van neutrofielen met Anti-tumor Properties in vivo met behulp van een Breast Cancer Mouse Model.

LET OP: Alle stappen moeten worden uitgevoerd met behulp van steriele oplossingen in een laminaire luchtstroom (LAF) Bio-Safety kast.

  1. Seed 5 x 10 5 4T1-cellen in 100 mm weefselkweekplaat in 10 ml Dulbecco's gemodificeerd Eagle medium (DMEM) dat 4,5 g / l D-glucose, aangevuld met 10% hitte-geïnactiveerd foetaal runderserum (FBS), 2 mM D- glutamine, 1 mM natriumpyruvaat, 100 U / ml penicilline G en 100 ug / ml streptomycine sulfaat. Incubate the cellen bij 37 ° C in een bevochtigde incubator met 5% CO2 gedurende 3-4 dagen. Zorg ervoor dat de cellen 50 - 100% confluent op de dag van het experiment.
  2. Om de tumorcellen uit het weefsel kweekplaat losmaken, zuig het kweekmedium, was de cellen met 5 ml PBS, zuig het PBS en voeg 3 ml van een 2,5 g / L trypsine-oplossing. Incubeer de cellen 2-3 minuten met trypsine bij 37 ° C.
  3. Voeg 10 ml serum-bevattend medium om de trypsine te neutraliseren en pipet op en neer totdat alle cellen werden losgemaakt. Breng de celsuspensie aan een 15 ml conische centrifugebuis.
  4. Centrifugeer de cellen bij 200 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Zuig het medium waardoor 200 gl medium boven de celpellet. Resuspendeer de cellen in het restvolume en voeg 10 ml PBS. Inverteer de buis 2-3 maal een homogene celsuspensie af en nemen 10 pi om de cellen in een hemocytometer tellen. Gebruik trypanblauw om onderscheid te maken tussen levende en dode cellen.
  5. Centrifugeer de celsuspensie gedurende 5 minuten bij 200 x g bij kamertemperatuur. Zuig het PBS en resuspendeer de cellen in PBS bij een eindconcentratie van 2 x 10 6 cellen / ml. Zorg ervoor dat de enkele cel schorsing heeft geen klonteren.
  6. Injecteer 1 x 10 6 cellen of 4T1-luciferase expressie brengende 4T1-cellen in 50 ul PBS orthotopically in de linker lies uiervet pad van vrouwelijke BALB / c-muizen met een 0,3 ml spuit met een 30G x 8mm naald.
    1. Vóór injectie, verdoven de muizen in een inductie kamer ontvangen een langzame debiet van isofluraan (3-5%) in 100% zuurstof.
    2. Leg de muis op een steriele chirurgische pad en zorg ervoor dat de kop goed in de isofluraan neuskegel geplaatst. Bevestig de juiste verdoving door knijpen de poot. Gebruik vet zalven ogen tot droog voorkomen terwijl onder narcose. Scheer het haar rond de injectieplaats en desinfecteren met 70% EtOH.
    3. Gebruik een steriele set van chirurgische instrumenten om een ​​kleine horizontale incisie te maken (5 mm) ca.nor- maal gesproken minstens halverwege tussen de lies en de buik tepels, bloot de dikke pad en injecteer 1 x 10 6 4T1 cellen in 50 ul. Sluit de insnijdingen met 9 mm clips die één week later worden verwijderd. Injectie van luciferase uiten cellen zorgt voor de opvolging van de grootte van de tumor en metastase door bioluminescentie beeldvorming.
      LET OP: Deze minimaal invasieve procedure geen post-operatieve behandeling nodig en de geïnjecteerde muizen herstellen binnen 2 - 3 min.
    4. Bewaken van de muizen tot ze weer bij bewustzijn, en zorg ervoor dat ze weer volledig bewustzijn voordat hij het gezelschap van andere muizen.
  7. Na 3-4 weken, wanneer de primaire tumor een volume van 2 cm 3 heeft bereikt, offeren de muizen een langzame CO 2 stroom, en onmiddellijk na de laatste adem, bloed verkregen door hartpunctie onder toepassing van een 25G x 5/8 "naald aangesloten op een 1 ml tuberculine spuit voorbehandeld met heparine. Houd de mond van de naald omhoog wanneer u deinjectiespuit in een horizontale positie door het membraan naar het hart, en langzaam en geleidelijk het bloed voorkomen overdruk (figuur 3) te trekken.

2. neutrofielen Isolatie

  1. Isolatie van cytotoxische neutrofielen uit het bloed van tumordragende muizen.
    1. Verdun 1 ml bloed dat uit tumor-dragende muizen (zie Protocol 1,11) in PBS met 0,5% (w / v) runderserumalbumine (BSA) tot een eindvolume van 6 ml.
    2. Fractionering van verdund bloed op een vers bereide discontinue sucrose gradiënt:
      1. Voeg 3 ml steriel-gefiltreerde sucrose 1,119 g / ml bij de bodem van een 15 ml kegelvormige polypropyleen centrifugebuis.
      2. Langzaam en voorzichtig layer 3 ml steriel-gefiltreerde sucrose 1,077 g / ml boven de 1,119 g / ml laag. Daarna, voeg langzaam en voorzichtig de 6 ml verdund bloed (Protocol 2.1.1) bovenop de 1.077 g / ml layer (Figuur 4A). Het wordt aanbevolen om de buis gekanteld te houden en eendding de verschillende componenten door een langzame maar continue stroom, waarbij de monding van de pipet naar de onderste wand van de buis, zodanig dat er geen turbulentie ontstaat.
    3. Centrifugeer de buis met het verdunde bloed op de sucrose gradiënt bij 700 xg gedurende 30 min bij kamertemperatuur zonder rem.
    4. Haal de buis uit de centrifuge zonder enige turbulentie. Het merendeel van de erytrocyten wordt onderin de buis. High-density neutrofielen (HDN) worden aangetroffen als een witte tot rode ring aan het grensvlak tussen 1,119 g / ml en 1,077 g / ml lagen (om de 3 ml markering), terwijl de lage-dichtheid leukocyten worden gevonden in witte ring aan het grensvlak tussen de 1.077g / ml laag en de BSA-PBS bevattende (rond de 6 ml markering, zie figuur 4B).
    5. Zuig het PBS + 0,5% BSA tot aan 5 mm boven het lage-dichtheid cellaag. Pipet uit de lage dichtheid cellen door langzame zuigkracht in een 1 ml tip door middel langzaam wervelende rond de cellen.Breng de cellen in 30 ml PBS met 0,5% BSA.
    6. Zuig de bovenste laag in hetzelfde verloop buis tot aan 5 mm boven het high-density cell band. Pipetteer de high-density cellen, die meestal high-density neutrofielen, en breng de cellen in 30 ml PBS dat 0,5% BSA.
    7. Centrifugeer de cellen bij 400 xg gedurende 10 min bij kamertemperatuur.
    8. Zuig het supernatant en lyseren erytrocyten door resuspenderen van de cellen in 36 ml steriel HPLC kwaliteit water gedurende 30 sec. Isotoniciteit worden hersteld door toevoeging van 9 ml van een 5x geconcentreerde PBS aangevuld met 2,5% (w / v) BSA.
    9. Centrifugeer de cellen bij 400 xg gedurende 10 min bij kamertemperatuur.
    10. Zuig het supernatant en resuspendeer de cellen in PBS-BSA. Tel het aantal neutrofielen in een hemocytometer en gebruik trypan blue onderscheid maken tussen levende en dode cellen.
    11. Centrifugeer de cellen bij 400 xg gedurende 10 min bij kamertemperatuur en resuspendeer de neutrofielen in gewenste incubatiemedium om uiteindelijke celdichtheid. Gebruikde neutrofielen onmiddellijk.
    12. Dan, na het andere centrifugatie, resuspendeer de neutrofielen in incubatiemedium met uiteindelijke celdichtheid. Gebruik de neutrofielen onmiddellijk.
  2. Isolatie van circulerende neutrofielen uit kankerpatiënten.
    1. Meng 10 ml heparine (20 U / ml) menselijk bloed met een gelijk volume van 3% Dextran T500 in zoutoplossing en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Tijdens deze incubatie worden de erythrocyten sedimenteren.
    2. Bereid een 50 ml conische polypropyleenbuis met 10 ml sucrose 1,077 g / ml en langzaam laag het leukocyt-rijke supernatant boven de 1.077 g / ml sucrose layer (Figuur 4C).
    3. Centrifugeer bij 400 xg gedurende 30 min bij kamertemperatuur zonder rem. De high-density neutrofielen (HDN) zal verschijnen in de pellet. Low-density neutrofielen (LDN) tezamen worden gezuiverd met monocyten en lymfocyten in het grensvlak tussen 1,077 g / ml sucrose laag en plasma (Figuur 4D).
    4. Resuspendeer de neutrofielen in 10 ml 0.2% NaCl gedurende 30 seconden om de contaminerende erytrocyten te lyseren, en isotoniciteit hersteld door toevoeging van 10 ml 1,6% NaCl en een keer om.
    5. Centrifugeer 5 minuten bij 160 x g bij kamertemperatuur en was drie keer in 20 ml Hanks 'gebalanceerde zoutoplossing. Centrifugeer na iedere wasbeurt en zuig het supernatant.
    6. Tel de neutrofielen en resuspendeer de cellen in RPMI-1640 gesupplementeerd met 2% FBS bij 2 x 10 6 neutrofielen / ml of zoals gewenst.

3. Verrijking van Blood neutrofielen behulp van Magnetic Beads

  1. Positieve selectie
    1. Neem 1 ml bloed uit muizen zoals beschreven in protocol 1,8, met een gehepariniseerde injectiespuit.
    2. Centrifugeer het bloed in een 15 ml conische buis bij 400 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
    3. Zuig het supernatant of houd het bloedplasma voor verdere studies.
    4. Lyse de erytrocyten door resuspenderen de cellen in 8 ml HPLC-grade water. Na 30 sec herstellen isotoniciteit door toevoeging van 2 ml 5x concentrated PBS bevattende 2,5% BSA. Tel de cellen.
    5. Centrifugeer bij 400 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
    6. Resuspendeer de celpellet in 200 pl PBS dat 0,5% BSA en 2 mM EDTA per 10 8 cellen.
    7. Voeg 50 pl gebiotinyleerd anti-Ly6G antilichaam. Meng goed en incubeer gedurende 10 minuten in de koelkast (niet op het ijs).
    8. Voeg 150 ul koud PBS dat 0,5% BSA en 2 mM EDTA.
    9. Vortex de anti-biotine gecoat magnetische microbead voorraad oplossing. Breng 100 pi aan de celsuspensie. Meng goed en incubeer gedurende 15 minuten in de koelkast (niet op het ijs).
    10. Was de cellen door toevoeging van 10 ml PBS met 0,5% BSA en 2 mM EDTA en centrifugeer bij 400 xg gedurende 10 min bij kamertemperatuur.
    11. Zuig supernatant volledig en resuspendeer in 500 ul koud PBS dat 0,5% BSA en 2 mM EDTA.
    12. Plaats een magnetische scheiding kolom in een magneet houder die aan een magnetisch stand is bevestigd, en spoel het met 500 ul koude PBS met 0.5% BSA en 2 mM EDTA.
    13. Breng de celsuspensie op de kolom. De doorstroom bevat ongelabeld LyG6-negatieve cellen.
    14. Was de kolom met 500 pl PBS dat 0,5% BSA en 2 mM EDTA. Aanvullende ongelabelde cellen in de doorstroom.
    15. Herhaal de wasstap met een 500 pl PBS dat 0,5% BSA en 2 mM EDTA.
    16. Verwijder de kolom uit de magneet en plaats deze op een 15 ml collectie buis. Voeg 1 ml PBS die 0,5% BSA en 2 mM EDTA, en spoel de magnetisch gemerkte cellen door stevig indrukken van de zuiger in de kolom. De stroom bevat door middel Ly6G + neutrofielen.
  2. Negatieve selectie
    1. Bereid bloed leukocyten volgens de stappen 3.1.1 tot en met 3.1.5.
    2. Resuspendeer 1 x 10 8 cellen in 1 ml PBS met 0,5% BSA en 2 mM EDTA in een 5 ml polystyreen ronde bodem buis.
    3. Voeg 50 ul normale rat serum.
    4. Voeg 50 ul van neutrofielen verrijking cocktail (met gebiotinyleerde antilichamen die specifiek zijn voor niet-neutrofielen witte bloedcellen), mengen en incuberen gedurende 15 minuten in de koelkast.
    5. Was de cellen door toevoeging van 4 ml PBS met 0,5% BSA en 2 mM EDTA en centrifugeer 400 xg gedurende 10 min.
    6. Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in 1 ml PBS met 0,5% BSA en 2 mM EDTA.
    7. Voeg 50 ul van tetramere antistof complexen tegen biotine en dextran. Meng goed en incubeer gedurende 10 minuten in de koelkast.
    8. Vortex en de buis met dextran beklede magnetische korrels voor het toevoegen 150 pi aan de celsuspensie. Meng goed en incubeer 10 minuten in de koelkast.
    9. Breng de celsuspensie tot een totaal volume van 2,5 ml door toevoeging van PBS dat 0,5% BSA en 2 mM EDTA. Meng voorzichtig om een ​​homogene celsuspensie te krijgen.
    10. Steek de buis (zonder de dop) in de magneet, en laat staan ​​voor 3 min.
    11. Keer de magneet met de buis in één doorlopendebeweging zodanig dat de ongebonden cellen in de vloeistof worden overgebracht naar een nieuwe buis. Laat de magneet en de buis omgekeerd voor 2 - 3 sec, dan terug naar rechtop. De magnetisch gelabelde ongewenste cellen gebonden aan de wand van de oorspronkelijke buis blijven, terwijl de ongebonden neutrofielen wordt het overgedragen fluïdum.

4. Cytologisch kleuring van neutrofielen

  1. Resuspendeer 1x10 5 neutrofielen in 50 pl PBS en breng de celsuspensie een dunne laag celpreparaat adapter zoals een Cytospin. Centrifugeer de adapter bij 150 xg gedurende 5 minuten. Scheid de gelabelde glasplaatje van de adapter.
  2. Fix cellen door dompelen van de glasplaatjes in 70% ethanol gedurende 2 minuten. Laat de voorbereidingen van de adapter (zie stap 4.1) drogen bij kamertemperatuur voordat kleuring. Dompel de objectglaasjes 5-6 keer gedestilleerd water.
  3. Vlekken 1-2 min in Mayer's hematoxyline oplossing. Spoel 1 min in leidingwater. Vlek 10 sec in Eosin Y-oplossing . Was in leidingwater. Uitdrogen door spoelen van de glaasjes in toenemende concentraties ethanol (70%, 96% en 100%). Laat de glasplaatjes lucht drogen kort en de dia's te inspecteren onder een lichtmicroscoop.
    OPMERKING: Hematoxylin heeft een diep blauw-paarse kleur en vlekken nucleïnezuren, terwijl eosine is roze en vlekken eiwitten niet-specifiek. De cytoplasmatische granules van neutrofielen blijft ongekleurd door zure of basische kleurstoffen, wat de oorsprong van de naam het houden neutraal ". Overwegende basofiele granulocyten vlek donkerblauw met hematoxyline en eosine en eosinophilc granulocyten helder rood, neutrofielen verschijnen neutrale roze (zie figuur 1A). Oudere neutrofielen worden gekenmerkt door een polymorfonucleaire kern, die over het algemeen groot met 2-5 lobben 'gesegmenteerde neutrofielen (figuur 1A en 1C). Onrijpe neutrofielen worden gekenmerkt door één of gelobde gebogen ringvormige nucleus (Figuur 1B).
ve_title "> 5. Bepaling van de zuiverheid van neutrofielen door flowcytometrie.

  1. Resuspendeer 1x10 6 cellen in 100 ui FACS-buffer (PBS met 0,5% BSA, 2 mM EDTA en 0,02% NaN3). Voor geheel bloedmonsters wordt hemolyse nodig voordat kleuring (stappen 3.1.1 tot 3.1.5). Voeg 10 ul van FcR Blocking Reagent gedurende 5 min.
  2. Voeg 0,5 ug fluorescent-gelabeld antilichaam met een specificiteit voor Ly-6G voor muizen neutrofielen of CD11b en CD66b menselijke neutrofielen, meng en incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
  3. Stel het volume op 500 pl met PBS dat 0,5% BSA en 2 mM EDTA en kleuring geanalyseerd door flow cytometrie.

6. Follow Neutrofiel Poort in vivo

  1. In vivo BrdU labeling van neutrofielen
    1. Injecteer 100 ui van een 10 mg / ml broomdeoxyuridine (BrdU) oplossing in steriel PBS intraperitoneaal aan tumordragende muizen.
    2. Isoleer bloed neutrofielen 48 uur na de injectie eenolgens Protocol 2.1. Stain BrdU-gelabelde neutrofielen onder toepassing van een stroom BrdU kit.
  2. CFSE labeling van neutrofielen
    1. Resuspendeer 10 7 neutrofielen in 1 ml voorverwarmde PBS.
    2. Voeg 2 pi van een 5 mM voorraadoplossing CFSE de neutrofielen gesuspendeerd tot een uiteindelijke concentratie van 10 uM. Goed mengen en incuberen gedurende 15 min bij 37 ° C. 5 mM CFSE wordt bereid door 2,8 mg CFSE (5- (en 6 -) - carboxyfluoresceïne diacetaat succinimidyl ester) in 1 ml DMSO. Verdelen in 10 ul porties in steriele 200 ul buizen en op te slaan in het donker bij -20 ° C.
    3. Neutraliseer overtollige CFSE door toevoeging van een gelijk volume van RPMI-1640 bevattende 10% FBS. Incubeer gedurende 10 minuten bij 37 ° C. Centrifugeer de neutrofielen bij 400 xg gedurende 10 min bij kamertemperatuur. Was de neutrofielen tweemaal in 10 ml RPMI-1640 bevattende 10% FBS.
    4. Centrifugeer bij 400 xg gedurende 10 min en resuspendeer in een geschikt volume van PBS. De neutrofielen (bijvoorbeeld, 1 x 10 7 Cellen) kunnen nu intraveneus of via cardiale injectie ontvangende muizen worden geïnjecteerd.

7. In vitro Luciferase Assay voor de anti-tumor activiteit van geïsoleerde neutrofielen monitor.

  1. Telen luciferase-gelabelde tumorcellen zoals beschreven voor 4T1 cellen in Protocol 1,1-1,5, maar resuspendeer de trypsine-gedissocieerde cellen geoptimaliseerde verminderde serum medium gesupplementeerd met 2% FBS. Stel de celdichtheid 5 x 10 4 cellen per ml.
  2. Seed 5000 luciferase-gelabelde tumorcellen in 100 ul geoptimaliseerde gereduceerd serum medium dat 0,5% FBS in elk putje van een witte 96-vlakke bodem weefselkweek wells plaat.
  3. 4 uur na enten de tumorcellen, voeg 1 x 10 5 neutrofielen in 50 gl geoptimaliseerde gereduceerd serum medium dat 0,5% FBS en geïncubeerd O / N. Bereid een neutrofiel celsuspensie met een dichtheid van 2 x 10 6 cellen / ml. Controleputjes moet 50 ul medium zonder neutrofielen. Doenmeerdere herhalingen van elke experimentele setting.
  4. De volgende ochtend, Zuig voorzichtig het supernatant en was elk putje met 200 ul PBS. Zuig het PBS en voeg 50 ul van passieve lysisbuffer. Voor gemakkelijk losmaken cellen (zoals AT-3-cellen), niet wassen in PBS en voeg onmiddellijk de celkweek lysisbuffer na opzuigen van het groeimedium.
  5. Bedek de plaat met aluminiumfolie en incubeer het op een orbitale schudinrichting bij 150 opm gedurende 20 min bij kamertemperatuur.
  6. Plaats de plaat in een luminescentie plaatlezer. Injecteren goed wijs 50 ul luciferasetest oplossing, en lees de chemiluminescentie 10 seconden per putje.
  7. Bereken het% tumor lysis met de volgende formule:% tumor lysis = (1- [luminescentie van monsters met neutrofielen] / [luminescentie van monsters medium]) x 100%.

OPMERKING: Om de bijdrage van neutrofielen aan uitgezaaide zaaien beoordelen, kan neutrofielen worden uitgeput, zoals beschreven in het protocol 8.1. Voor een effectieve verarmdetion beheren-neutrofielen afbrekende antilichamen beginnen op dag 7 na de tumor implantatie.

8. Anti-metastatische activiteit van neutrofielen in een Breast Cancer Mouse Model.

  1. In vivo depletie van neutrofielen.
    1. Vers bereiden 12,5 ug anti-rat antilichaam Ly6G (neutrofiel afbrekende antilichaam) of rat isotype controle antilichaam (IgG2a, Κ) in zoutoplossing in een eindvolume van 100 pl per muis.
    2. Beginnend op dag 3 post-tumor implantatie dagelijks injecteren van een intraperitoneale dosis van 12,5 ug rat anti-Ly6G antilichaam (100 pi). Injecteer controlemuizen met of 12,5 pg (100 pi) rat isotype controle-antilichaam (IgG2a, Κ).
    3. Beginnend op dag 14, het beheer van de antilichamen tweemaal daags, als de neutrofielen productie snelheid drastisch verhoogt wanneer de 4T1 tumor groeit.
    4. Om de andere dag, het verkrijgen van een bloedmonster (2-3 druppels) door nicking de laterale staart-ader. Verzamel het bloed in een anti-coagulant met buis (heparine, citraat of EDTA).
    5. Controleer neutrofielen uitputting met flowcytometrie zoals beschreven in Protocol 5.
  2. Tumor Neutralisatie Test (Gewijzigd Winn Assay)
    1. Isoleer neutrofielen uit tumordragende muizen. Meng 1 x 10 6 tumorcellen en 3 x 10 6 neutrofielen in 50 gl zoutoplossing (per muis).
    2. Injecteer de cellen subcutaan in de flank van 6-8 weken oude naïeve BALB / c muizen. Scheer de flank voorafgaand aan de tumor aanslaan om nauwkeurige metingen van de grootte van de tumor mogelijk te maken. Meet tumorgrootte dagelijkse startpunt op dag 5 post-implantatie.
  3. Neutrofiel adoptieve overdracht
    1. Injecteer 2 x 10 4-luciferase expressie tumorcellen in 200 ul PBS om de staartader.
    2. Neutrofielen overdracht moet worden uitgevoerd 4 uur na injectie van tumorcellen. Daarom start de zuivering van HDN van tumor-dragende muizen (protocol 2.1) ongeveer 2 uur voor hun geplandvivo overdracht. Resuspendeer neutrofielen in PBS bij een eindconcentratie van 2,5 x 10 7 cellen / ml.
    3. 4 uur na de introductie van de tumorcellen plaatst de muizen onder een warmtelamp gedurende 5 min. Plaats de muizen in een restrainer en injecteer 5 x 10 6 HDN (200 ul) via de staartader. Controle muizen worden geïnjecteerd met drager (PBS).
    4. Bewaken van de vorming van longmetastasen op verschillende tijdstippen onder toepassing van een in vivo bioluminescentie beeldvormingssysteem of immunohistochemie.
  4. Longen uitgezaaide zaaien assay
    1. Injecteer 0,5-1 x 10 6 ouderlijke 4T1 cellen orthotopically in de linker lies uiervet pad zoals beschreven in protocol 1.
    2. Op dag 10, resuspendeer GFP tot expressie brengende 4T1-cellen in PBS bij een eindconcentratie van 5 x 10 5 cellen / ml. Plaats de muizen onder een warmtelamp gedurende 5 min.
    3. Plaats de muizen in een restrainer en injecteer 1x10 5 GFP tot expressie brengende 4T1-cellen (200 ui) intraveneus 4T1 tumordragende muizen en naïeve muizen.
    4. De volgende dag, euthanaseren de muizen en perfuseren de longen 20 ml PBS om de resterende RBC's te verwijderen.
    5. Uitsnijden van de longen voor de analyse van GFP-positieve cellen door immunohistochemie.
      OPMERKING: Om de bijdrage van neutrofielen aan uitgezaaide zaaien beoordelen, kan neutrofielen worden uitgeput, zoals beschreven in het protocol 8.1. Voor een effectieve uitputting beheren-neutrofielen afbrekende antilichamen beginnen op dag 7 na de tumor implantatie.

9. Onderdrukking van T-cel proliferatie door neutrofielen van tumor-dragende muizen.

  1. Verwijder de milt van een ingeslapen naïeve BALB / c muis en plaats in 10 ml PBS.
  2. Plaats de milt op een 40 um cel zeef die geschikt is op een petrischaal gevuld met RPMI-1640. De zuiger einde van de injectiespuit, wrijf de milt door de cellen zeef in de petrischaal. Spoel de cel zeef met 5 ml RPMI. Gooi de zeef.
  3. Breng de geresuspendeerde cellen in een 50 ml conische buis en centrifugeer 400 xg gedurende 10 min.
  4. Verwijder het supernatant en lyseren de erytrocyten door de schorsing van de cellen in 36 ml zuiver water voor 20 sec, en aan te passen aan isotoniciteit door het toevoegen van 4 ml PBS geconcentreerd x 10. Als alternatief, lyseren de erytrocyten door de schorsing van de cellen in 5 ml van erytrocyten lyserende buffer (ACK) en incubeer 5 min bij RT. Neutraliseer het ACK door toevoeging van 10 ml van RPMI-1640 medium. Centrifugeer bij 400 xg gedurende 10 min bij kamertemperatuur. Resuspendeer de cellen in 5 ml PBS en tel de cellen.
  5. Resuspendeer de splenocyten in PBS tot een uiteindelijke dichtheid van 4 x 10 7 cellen / 2 ml in 15 ml buis. Voeg 2 ml van een 2,5 uM CFSE-oplossing in PBS. Snel omkeren van de buis en incubeer gedurende 10 minuten bij 37 ° C met af en toe mengen (elke 2 min), beschermd tegen licht.
  6. Quench overmaat CFSE door toevoeging van 4 ml voorverwarmde FBS (100%) en incubeer gedurende 1 min bij kamertemperatuur. Voeg 3 ml PBS en centrifugeer bij 400 xg gedurende 10min.
  7. Was de cellen met 30 ml PBS en centrifugeer bij 400 xg gedurende 10 min.
  8. Filter de cellen door een 40 um cel zeef en opnieuw wassen met PBS.
  9. Resuspendeer de cellen in RPMI-1640 medium aangevuld met 10% FBS tot een uiteindelijke dichtheid van 2 x 10 7 cellen / ml.
  10. Seed 2 x 10 6 / goed (200 pl) in een 24-well weefselkweek plaat.
  11. Stimuleren van de cellen door toevoeging van 1 ug gezuiverd Armenian hamster anti-muis CD3e antilichaam in 500 ul RPMI-1640 met 10% FBS.
  12. Voeg 2 x 10 6 of HDN LDN in 300 ul RPMI-1640 met 10% FBS aan de CFSE-gelabelde splenocyten en incubeer gedurende 3 dagen bij 37 ° C. Wells zonder neutrofielen moeten krijgen 300 ul medium. Het totale volume in elk putje dient 1 ml.
  13. Verzamel de cellen en voorbereiden op flowcytometrie. Resuspendeer de cellen in 100 ui FACS buffer (protocol 5) en voeg 10 ul van FcR Blocking Reagent. Incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
  14. Voeg 1 &# 956; l APC-geconjugeerd anti-CD8a antilichaam en incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
  15. Bepaal de CFSE fluorescentie-intensiteit op CD8 + T-cellen door flowcytometrie (Figuur 5). De CFSE intensiteit wordt gehalveerd bij elke celdeling. Aldus kan het aantal celdelingen worden bepaald door de intensiteit van CFSE kleuring.

10. neutrofielen Migratie Assay

  1. Zaad 5x10 5 4T1 cellen in 7 ml geoptimaliseerde verlaagde serum medium gesupplementeerd met 0,5% FBS in een 25 cm2 weefselkweek kolf en incubeer 24 uur bij 37 ° C.
  2. Breng 800 pi van het supernatant aan de onderste kamer van een migratie plaat met een poriëngrootte van 5 pm.
  3. Resuspendeer 2 x 10 5 neutrofielen in 400 gl geoptimaliseerde verminderde serum medium gesupplementeerd met 0,5% FBS. Breng de celsuspensie aan de bovenste kamer en incubeer gedurende 2 uur bij 37 ° C.
  4. Aan het eind van de incubatie, verwijder de bovenste kamer entel het aantal neutrofielen die zijn gemigreerd naar de onderste kamer.

11. Monitoring neutrofielen productie van reactieve zuurstofsoorten (ROS).

  1. Bereid 1,1 x 10 6 neutrofielen / ml in Hank's gebalanceerde zoutoplossing zonder fenolrood. Plate 180 ul met 2 x 10 5 neutrofielen in elk putje van een witte 96-platte bodem well plaat.
  2. Plaats de plaat in een luminescentie plaatlezer. Voeg 20 pi van een 500 pM oplossing luminol in PBS aan elk putje tot een eindconcentratie van 50 uM krijgen. Lees de basale chemiluminescentie voor 1sec in een tijdsverloop van 5 min 10 sec intervallen.
  3. Voeg een stimulerend middel (bijvoorbeeld PMA in een concentratie van 10 nM of 100 nM of fMLP bij een concentratie van 10 uM). Bereid een 10 x geconcentreerde oplossing van elk middel in Hank's gebalanceerde zoutoplossing zonder fenolrood en voeg 22 ul aan de desbetreffende putjes. Om controle putten toevoegen 22 ul voertuig.
  4. Measuopnieuw de chemiluminescentie in de plaat lezer. Doe zowel een korte (elke 10 seconden voor 5 min) en een lange (elke minuut voor 1 uur) tijdsverloop.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

In een recente studie van een anti-metastatische werking van neutrofielen 6 identificeerden we. Neutrofielen van tumordragende muizen verwerven van een cytotoxische fenotype en het vermogen om tumorcellen te doden 6. Dit in tegenstelling tot neutrofielen uit naïeve muizen die geen significante anti-tumor effect 6 hebben. Enkele van de in de sectie protocol beschreven technieken gebruikt voor het bestuderen van anti-tumor neutrofielfunctie in vitro en in vivo 6.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Neutrofielen zijn de meest voorkomende van witte bloedcellen en de eerste responders bij infecties en ontstekingen. Als zodanig zijn ze zeer gevoelig voor externe stimuli en zijn allemaal toegewezen. Bovendien neutrofielen een zeer korte halfwaardetijd en een hoge omloopsnelheid. Samen vormen deze elementen voeren een aantal problemen bij het werken met neutrofielen, zodat unieke experimentele strategieën nodig. Zo zijn er verschillende neutrofielen zuiveringsstrategieën, elk met zijn eigen voor- en nadelen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

ZG wordt ondersteund door subsidies van de I-CORE programma van de Israel Science Foundation (Grant No. 41/11), de Abisch-Frenkel Stichting, het Rosetrees Trust, het Israël Cancer Research Foundation (ICRF - Research Career Development Award) en de ZORG stichting. ZGF wordt ondersteund door subsidies van de Israël Cancer Research Foundation (ICRF - Research Career Development Award), Chief Scientist van het Israëlische Ministerie van Volksgezondheid en de Israël Lung Association.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
CELL LINES
Mouse 4T1 breast carcinoma cellsADCCCRL-2539Growth medium: DMEM + 10 % heat-inactivated FBS
PLASTIC WARES AND EQUIPMENTS
24-well Tissue Culture Plate Falcon353047Steriele
100 mm Tissue Culture Plate Corning430167Steriele
25 cm2 Tissue Culture FlaskNunc156340Steriele
90 mm Bacterial Grade Culture Dish Miniplast, Ein Shemer, Israel20090-01-017Steriele
15 ml Sterile Conical Centrifuge Tube Miniplast, Ein Shemer, Israel835015-40-111Steriele
50 ml Sterile Conical Centrifuge Tube Miniplast, Ein Shemer, Israel835050-21-111Steriele
Falcon 12 x 75 mm Round-Bottom Polystyrene Tube Becton Dickinson352058Steriele
Millicell 24 Migration Plate with a pore size of 5μm Merck MilliporePSMT010R1Steriele
White 96-Flat-Bottom Well Plate Costar3917Steriele
Cell Strainer (40 mm) BD Falcon352340Steriele
20G x 1.5" NeedleBD Microlance 3 301300Steriele
23G x 1" Needle BD Microlance 4300800Steriele
25G x 5/8" Needle BD Microlance 5300600Steriele
0.3 ml Syringe with a 30G x 8mm NeedleBD Micro-Fine Plus Demi320829Steriele
9 mm Clips BD, AutoClip 427631Steriele
EasySep Magnet STEMCELL Technologies18000
MACS LS Separation Column Miltenyi Biotech130-042-201Steriele
MidiMACS Separator MagnetMiltenyi Biotech130-042-302
MACS MultiStandMiltenyi Biotech130-042-303
Microscope Glass Slide Menzel-Gläser Superfrost  Plus ThermoJ1800AMNZ
Orbital Shaker Sky line, ELMIS-3.02.10L
Plate Reader TECANInfiniteF200Pro
POWDER
Bovine serum albumin (BSA), fraction VSigmaA7906
Bromodeoxyuridine (BrdU) BD Pharmingen550891Steriele
CFSE (5-(and 6-)-Carboxyfluorescein diacetate, succinimidyl ester)Molecular ProbesC1157
Dextran T500Sigma31392
Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa SigmaH3149
Sodium azide (NaN3)SigmaS8032Highly toxic, handle with care
Thioglycollate powder Difco225650
Zymosan ASigmaZ4250
MEDIA AND SUPPLEMENTS
Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM)SigmaD5796Steriele
Opti-MEM® I reduced serum medium Life Technologies31985062Steriele
Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 mediumSigmaR8758Steriele
Foetal bovine serum (FBS), heat-inactivatedSigmaF9665Steriele
L-GlutamineBiological Industries, Beth HaEmek, Israel03-020-1ASteriele
Sodium pyruvateBiological Industries, Beth HaEmek, Israel03-042-1BSteriele
Penicillin Streptomycin x 1000 solutionBiological Industries, Beth HaEmek, Israel03-031-5Steriele
Phosphate buffered saline (PBS) without Mg2+ and Ca2+ Biological Industries, Beth HaEmek, Israel02-023-1Steriele
PBS x 10 without Ca2+ and Mg2+ Biological Industries, Beth HaEmek, Israel02-023-5ASteriele
HPLC grade water J.T. Baker4218-03Autoclave
SOLUTIONS
ACK – Ammonium-Chloride-PotassiumLife Technologies A10492-01
Bromodeoxyuridine (BrdU) solution (10 mg/ml) in PBSDissolve 10 mg of BrdU in 1 ml PBS and sterile filter.
CFSE, 5 mM in DMSODissolve 2.8 mg of CFSE in 1 ml DMSO. Divide into 10 ml aliquots in sterile 200 ml tubes and store in the dark at -20oC.
Eosin Y solutionSigmaHT110-2-32
Hanks' balanced salt solutionBiological Industries, Beth HaEmek, Israel02-016-1ASteriele
Heparin, 20 mg/ml in PBSDissolve 100 mg Heparin in 5 ml sterile PBS, and sterile filter through a 0.2 mm filter. 
Histopaque-1119 Sigma11191Sterile filter through a 0.2 mm filter.
Histopaque-1077 Sigma10771Sterile filter through a 0.2 mm filter.
Luciferase cell culture lysis buffer x5PromegaE153ADilute 1:5 in sterile water just before use.
Luciferase assay solutionPromegaE1501Contains luciferase assay substrate powder (E151A) and luciferase assay buffer (E152A)

Referenties

  1. Tangye, S. G., Brink, R. A helping hand from neutrophils in T cell-independent antibody responses. Nat Immunol. 13, 111-113 (2012).
  2. Mantovani, A., Cassatella, M. A., Costantini, C., Jaillon, S. Neutrophils in the activation and regulation of innate and adaptive immunity. Nat Rev Immunol. 11, 519-531 (2011).
  3. Pruijt, J. F., et al. Neutrophils are indispensable for hematopoietic stem cell mobilization induced by interleukin-8 in mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 6228-6233 (2002).
  4. Tecchio, C., Cassatella, M. A. Neutrophil-derived cytokines involved in physiological and pathological angiogenesis. Chem Immunol Allergy. 99, 123-137 (2014).
  5. Liu, M., et al. Formylpeptide receptors mediate rapid neutrophil mobilization to accelerate wound healing. PloS one. 9, e90613(2014).
  6. Granot, Z., et al. Tumor entrained neutrophils inhibit seeding in the premetastatic lung. Cancer Cell. 20, 300-314 (2011).
  7. Sionov, R. V., Fridlender, Z. G., Granot, Z. The Multifaceted Roles Neutrophils Play in the Tumor Microenvironment. Cancer Microenviron. , (2014).
  8. Borregaard, N. Neutrophils, from marrow to microbes. Immunity. 33, 657-670 (2010).
  9. Yamashiro, S., et al. Phenotypic and functional change of cytokine-activated neutrophils: inflammatory neutrophils are heterogeneous and enhance adaptive immune responses. J Leukoc Biol. 69, 698-704 (2001).
  10. Futosi, K., Fodor, S., Mocsai, A. Neutrophil cell surface receptors and their intracellular signal transduction pathways. Int Immunopharmacol. 17, 638-650 (2013).
  11. Scapini, P., Cassatella, M. A. Social networking of human neutrophils within the immune system. Blood. 124, 710-719 (2014).
  12. Fridlender, Z. G., et al. Transcriptomic analysis comparing tumor-associated neutrophils with granulocytic myeloid-derived suppressor cells and normal neutrophils. PloS one. 7, e31524(2012).
  13. Fridlender, Z. G., et al. Polarization of tumor-associated neutrophil phenotype by TGF-beta: 'N1' versus 'N2. TAN. Cancer Cell. 16, 183-194 (2009).
  14. Talmadge, J. E., Gabrilovich, D. I. History of myeloid-derived suppressor cells. Nat Rev Cancer. 13, 739-752 (2013).
  15. Youn, J. I., Nagaraj, S., Collazo, M., Gabrilovich, D. I. Subsets of myeloid-derived suppressor cells in tumor-bearing mice. J Immunol. 181, 5791-5802 (2008).
  16. Choi, J., et al. CD15+/CD16low human granulocytes from terminal cancer patients: granulocytic myeloid-derived suppressor cells that have suppressive function. Tumour Biol. 33, 121-129 (2012).
  17. Brandau, S., et al. Myeloid-derived suppressor cells in the peripheral blood of cancer patients contain a subset of immature neutrophils with impaired migratory properties. J Leukoc Biol. 89, 311-317 (2011).
  18. Pillay, J., Tak, T., Kamp, V. M., Koenderman, L. Immune suppression by neutrophils and granulocytic myeloid-derived suppressor cells: similarities and differences. Cell Mol Life Sci. 70, 3813-3827 (2013).
  19. Lopez-Lago, M. A., et al. Neutrophil chemokines secreted by tumor cells mount a lung antimetastatic response during renal cell carcinoma progression. Oncogene. 32, 1752-1760 (2013).
  20. Boxio, R., Bossenmeyer-Pourie, C., Steinckwich, N., Dournon, C., Nusse, O. Mouse bone marrow contains large numbers of functionally competent neutrophils. J Leukoc Biol. 75, 604-611 (2004).
  21. Sagiv, J., et al. Phenotypic Diversity and Plasticity in Circulating Neutrophil Subpopulations in Cancer. Cell Reports. , (2015).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Isolatie van neutrofielendichtheidsgradi nttumor geassocieerde neutrofielenneutrofielen met lage dichtheidneutrofielen met hoge dichtheidflowcytometrieluciferase assaycelcytotoxiciteitreactieve zuurstofverbindingenfagocytisch vermogen
Isolatie en karakterisering van neutrofielen met Anti-Tumor Properties
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.