Cardiale druk-volume curve analyse met behulp Conductance katheters in Muizen

Samenvatting

Cardiac druk-volume lusanalyse is de meest uitgebreide manier om de hartfunctie in het intacte hart te meten. We beschrijven een techniek om cardiale drukvolumelussen uit te voeren en te analyseren, met behulp van geleidingskatheters.

Samenvatting

Cardiac druk-volume lusanalyse is de “gouden standaard” bij de beoordeling van belastingsafhankelijke en belastingsonafhankelijke metingen van ventrikelsystolische en diastolische functie. Metingen van ventrikelcontractiliteit en compliantie worden verkregen door onderzoek van de hartreactie op veranderingen in afterload en preload. Deze technieken werden oorspronkelijk ontwikkeld bijna drie decennia geleden om hartfunctie te meten bij grote zoogdieren en mensen. De toepassing van deze analyses op kleine zoogdieren, zoals muizen, is tot stand gekomen door het optimaliseren van microchirurgische technieken en het creëren van geleidingskatheters. Geleidingskatheters maken schatting van het bloedvolume mogelijk door gebruik te maken van de relatie tussen elektrische geleiding en volume. Wanneer correct uitgevoerd, laten deze technieken het testen van hartfunctie toe in genetisch mutante muismodellen of in geneesmiddelbehandelingsstudies. De nauwkeurigheid en precisie van deze studies zijn afhankelijk van zorgvuldige aandacht voor de kalibratie van instrumenten, systematische uitvoering van hemodynamische metingen en data-analyses. We zullen de methoden bespreken om drukk-volume lusexperimenten uit te voeren met behulp van een geleidingskatheter bij muizen.

Inleiding

Cardiale druk volume curve analyse geeft gedetailleerde informatie van de hartfunctie en de gouden standaard voor functionele beoordeling ^1. Terwijl beeldvormende technieken zoals echocardiografie of cardiale MRI bieden functionele maatregelen, deze maatregelen zijn sterk afhankelijk van het laden van omstandigheden. Lastonafhankelijke maatregelen van cardiale contractiliteit en relaxatie vereisen dynamische metingen van de ventriculaire druk en volume verhouding over een reeks preload en afterload. Dit begrip van de druk-volume relatie komt voort uit het baanbrekende werk van Sagawa en collega's ^2,3. Ze aangetoond in ex vivo doorbloed hond harten dat de druk-volume loop afgeleid contractiliteit maatregelen onafhankelijk van beladingscondities ⁴ waren.

In vivo toepassing van deze analyses werd mogelijk door de ontwikkeling van conductantie catheters in 1980. Deze technische vooruitgang toegestaan ​​Kass en collega druk-volume curve analyse mens ^5,6 uitvoeren. Miniaturisatie geleidingstijd katheters en verbeteringen in chirurgische technieken in de late 1990's ⁷ uit analyse van knaagdieren hartfunctie haalbaar, waardoor genetische en farmacologische studies worden uitgevoerd. Dit voorschot heeft sindsdien geleid tot het wijdverbreide gebruik van de druk-volume curve analyse en heeft geleid tot een grote mate van inzicht in zoogdieren cardiale fysiologie.

Een belangrijk concept in het gebruik geleidingstijd katheters en de interpretatie van gegevens van het de verhouding tussen volume en geleidingsvermogen. Geleiding is omgekeerd evenredig met de spanning die wordt gemeten met een katheter met een proximaal geplaatste elektroden, meestal geplaatst onder de aortaklep, en distaal ten LV apex ^8. Veranderingen in spanning of geleidbaarheid worden gemeten door veranderingen in de stroom van het proximale naar het distale elektrode. Hoewel het bloed zwembad dragenis significant voor geleiding, de bijdrage van de ventriculaire wand, genaamd parallelgeleiding _(Vp), om gemeten geleiding worden afgetrokken absolute LV volumemetingen verkrijgen.

De methoden om deze correctie uit te voeren, een zogenaamde zoutoplossing kalibreren worden besproken in de onderstaande protocol. De wiskundige relatie tussen geleiding en het volume, beschreven door Baan en collega's, dat het volume = 1 / α; (ρ L ²⁾ (GG _p), waarbij α = uniform veld correctiefactor, ρ = bloed weerstand, L = afstand tussen de elektroden, G = geleiding en G _p = niet-bloed geleiding ^9. Van de nota, de uniforme veld correctiefactor bij muizen benadert 1.0 als gevolg van kleine kamer volumes ^10. In combinatie met de druk transducers, de conductantiecatheter biedt real-time gelijktijdige druk en volume data.

Cardiale pressure-volume analyse presenteert bijzondere voordelen ten opzichte van andere maatregelen van de hartfunctie, als zij toestaan ​​dat voor het meten van ventriculaire functie onafhankelijk van de belasting en de voorwaarden van de hartslag. Specifieke belasting-onafhankelijk cardiale indices van contractiliteit omvatten: eind-systolische druk volume relatie (ESPVR), d P / d t _max -end-diastolisch volume relatie, maximale elasticiteit (E _max) en voorspanning rekruteerbare beroerte werk (PRSW). Een last-onafhankelijke maat voor de diastolische functie is het einde-diastolische druk volume relatie (EDPVR) ^11. Het volgende protocol beschrijft het gedrag van de cardiale druk volume curve analyse, met behulp van zowel een halsslagader en een apicale aanpak. Hoewel de methode om deze studies uit te voeren zijn beschreven in detail is ^8,11, zullen we beoordelen belangrijkste stappen nauwkeurige druk-volume metingen zowel zoutoplossing en cuvette corrigeren voor kalibratie, en een visuele demonstratie van Thesse procedures. Onderzoek met dieren uit voor deze studie uitgevoerd werd behandeld volgens de goedgekeurde protocollen en dierenwelzijn reglementen van Institutional Animal Care en gebruik Comite Duke University Medical Center.

Protocol

1. conductantiecatheter Preparaten en druk kalibratie

1. Sluit conductantiecatheter naar de hemodynamische katheter module. Elektronisch kalibreren druk- en volumemetingen door het opnemen van vooraf ingestelde druk en volume van de catheter module. Het opnemen van een tracing van 0 mm Hg en 25 mm Hg (Figuur 1A) en wijs spanningen zowel druk tracings (Figuur 1B en 1C). Ook een volume tracering van 5 RVU en 25 RVU (figuur 1D) opnemen en deze toewijzen spanningen zowel volume tracings (1E en 1F).
2. Bevestig de elektronische druk kalibratie met een manuele druk kalibratie, met behulp van een kwikkolom bloeddrukmeter. Plaats de bloeddrukmeter manchet haven met een 3-weg kraan. Vul een 3-poort hemostaseklep systeem, vaak gebruikt voor coronaire angioplastie, met RT water via de zijpoort.
   1. Plaats de punt van een conductantiecatheter in de vloeistof gevulde hemostaseklep en voorzichtig verzekeren without knikken katheter. Sluit de hemostaseklep om de bloeddrukmeter en opblazen tot 200 mmHg en sluit 3-weg kraan. Onderzoeken of de gemeten druk komt overeen met de druk opgeblazen op de bloeddrukmeter.
3. Plaats katheter in zoutoplossing verwarmd tot 37 ° C die op het niveau van het operatiegebied en meet de druk. Pas drukregeling tot de opgenomen druk op nul.

2. Anesthesie / intubatie

1. Dien ketamine / xylazine (80-100 / 10 mg kg ^-1) als een intraperitoneale injectie.
   Opmerking: Alternatief anesthetische middelen worden gebruikt. Een uitgebreide lijst van anesthesie worden gegeven in eerdere beoordelingen van deze techniek ^11,12. Juiste verdoving kan worden bevestigd door zachte staart knijpen.
2. Eenmaal verdoofd, scheren de nek en borst met tondeuses en leg ze op een verwarmde pad. Houd de muis rectale temperatuur op 36,5-37,5 ºC. Lage lichaamstemperatuurzal resulteren in depressieve hartslag. Breng zalf voor de ogen tot droog voorkoming
3. Voeg een middellijn incisie in de nek en ontleden de tracheale spieren weg naar de luchtpijp bloot. Plaats een endotracheale buis door de mond, terwijl het visualiseren van de luchtpijp te garanderen intubatie en verbinding met de respirator.
4. Handhaaf muis in de ventilator tijdens de procedure. Stel ventilatorinstellingen opgegeven dieren zoals eerder beschreven ^11. Tidal Volume (ml) = 6,2 x (gewicht van het dier in kg) ^1.01 en beoordeel Respiratory = 53,5 x (gewicht van het dier in kg) ^-0,26.

3. Plaatsing van conductantiecatheter in LV kamer

1. Carotis aanpak
   1. Om steriliteit te verzekeren, twee steriele chirurgische instrumenten gebruikt- een voor initiële incisie en één om in het thoracotomie. Instrumenten moeten worden ontsmet met een droge sterilisator tussen dieren tijdens een individuele sessie een chirurgischend geautoclaveerd bij het eind van elke operatieve dag.
   2. Nadat de huid is ontsmet met drie cycli van chloorhexidine + alcohol scrub (0,5% chloorhexidine / 70% alcoholoplossing), een insnijding in de rechter halsslagader van onderkaak tot borstbeen. Ontleden omringende weefsel rechts halsslagader bloot, en snijd de nervus vagus die tegen de halsslagader uitgevoerd.
   3. Plaats een steriele 6-0 zijden hechtdraad rondom het distale einde (weg van de borst) van de halsslagader, binden en veilig. Plaats twee extra hechtingen onder de halsslagader proximale (dichter bij de borst) om de eerste hechting losjes binden midden hechtdraad. Trek de proximale hechtdraad en beveiligen door klemmen aan de huid. Zorg ervoor dat de halsslagader heeft zowel proximaal en distaal is geklemd alvorens.
   4. Voeg een kleine incisie in de halsslagader R., proximaal van de eerste hechting, en strekken zich in lengterichting naar de borst.
   5. Steek de conductantiecatheter tip,vooraf gedrenkt in warme saline gedurende 30 min in het vat door de incisie en zet de katheter met de middelste hechtdraad.
   6. Zachtjes vooraf de katheter in de linker ventrikel via de halsslagader, tijdens het kijken naar de druk-volume loop tracing om een ​​juiste plaatsing te zorgen.
      Opmerking: optimale plaatsing van de katheter druk-volume lussen die rechthoekige verschijnen opleveren (zie figuur 2). Wanneer één weerstand tegen de doorgang van de katheter wordt aangetroffen, trek heen en weer vooruit lichte druk. Zachte draaiing van de katheter kan helpen bij plaatsing in de linker ventrikel. Waardoor de conductantiecatheter kan leiden tot ernstige cardiovasculaire complicaties of beschadiging van de catheter.
   7. Neem basislijndruk-volume lussen ~ 10 minuten na katheter en het bereiken van een stabiele toestand (figuur 2).
2. Apical Approach
   1. In een verdoofde en geventileerd muis, maken een incisie frOM het processus xiphoideus en doorsnijden de borstwand zijdelings totdat het membraan zichtbaar.
   2. Snijd hoewel het membraan en visualiseren van de apex van het hart.
   3. Plaats de conductantie katheter in de apex van de linker ventrikel via een naald steekwond (met behulp van een 25-30 G naald), totdat het proximale elektrode net binnen de hartkamer.
   4. Neem basislijndruk-volume lussen ~ 10 minuten na katheter en het bereiken van een steady state.

4. Variërend nabelasting behulp Transient Aorta occlusie

1. Voorbijgaande aorta occlusie uit te voeren, een kleine horizontale incisie in de borst en ontleden omringende weefsel om de dwarse aorta bloot te leggen.
2. Plaats een 6-0 zijden ligatuur onder het dwarse aorta. Nadat de druk-volume lussen zijn teruggekeerd naar de basislijn, sluiting beide einden van de hechtdraad met een naaldklem, voorzichtig en langzaam de hechtdraad verhogen dan 1-2 seconden en langzaam spanningen weg.
3. Herhaal deze procedure tot drie afzonderlijke optimale opnamen zijn gemaakt van hetzelfde dier.
   Opmerking: Optimale opnames moeten minstens 5 druk volume luscycli en een gestage toename van de eind systolische druk tijdens het aanbrengen van spanning op de hechtdraad (figuur 3A en 3C) zijn.

5. Variërend Preload behulp Transient vena cava inferior occlusie (IVC)

1. Voorbijgaande inferior vena cava occlusie voeren, maken een horizontale snede onder de processus xiphoideus, onder het diafragma de IVC bloot.
2. Plaats een 6-0 zijden ligatuur onder het IVC. Nadat de druk-volume lussen zijn teruggekeerd naar de basislijn, sluiting beide einden van de hechtdraad met een naaldklem; voorzichtig en langzaam verhogen de hechting dan 1-2 sec, en langzaam de spanning los te laten. IVC occlusie kan ook worden uitgevoerd door het zachte uitoefening van druk met een wattenstaafje.
3. Herhaal deze procedure tot drie afzonderlijke optimale opnamen made van hetzelfde dier.
   Opmerking: Optimale opnames moeten minstens 5 druk volume luscycli en een constante daling van de linker ventriculaire einddiastolische druk tijdens het aanbrengen van spanning op de hechtdraad hebben (figuur 4A en 4B).

6. Saline Calibration

1. Aan het einde van de studie kan een parallelgeleiding _(Vp) waarde verkregen door injectie van een bolus van 10 gl hypertone zoutoplossing (15%) in het dier door de halsader (figuur 5A en 5B).
   Opmerking: Dit bolus zal een duidelijke toename van het volume met geen verandering in de druk veroorzaken. Deze schijnbare verandering in volume is het gevolg van een verandering in het bloed pool geleiding plaats als gevolg van een feitelijke toename van het volume. Een tijdelijke daling van de dP / dt _max kunnen worden waargenomen, zoals hypertone zoutoplossing heeft een negatief inotroop effect ^13. De berekende V _p kunnen samen in druk volume curve analyse software worden ingevoerdde cuvette kalibratie parameters en converteren RVUs in microliter.

7. Cuvette Calibration

1. Om een ​​cuvet kalibratie uit te voeren, plaatst een cuvet met putten van bekende diameters geleverd door de fabrikant op een verwarmingselement of een waterbad opgewarmd tot 37 ºC. Vul de eerste 4-5 gaten met verse warme gehepariniseerd bloed van muizen die een hemodynamische assessments.
   Opmerking: Een cuvette kalibratie zorgt voor een nauwkeurige evaluatie van de linker hartkamer bloed zwembad met de muis bloed en zorgt voor de omzetting van datavolume van RVUs naar microliter.
2. Plaats de conductantie katheter in het eerste putje, totdat alle elektroden ondergedompeld. Beweeg de katheter in de put, die variëren RVUs zal genereren.
3. Noteer de geleiding veranderingen in het volume kanaal RVUs. Selecteer de hoogste RVU voor de kalibratie.
   Opmerking: Het volume van de putten ofwel berekend 1) met de vergelijking voor de volume van een cilinder, waarbij de straal die van de cuvette put en de lengte is gebaseerd op de lengte tussen de binnenste twee meetelektroden of 2) inchecken instructies van de fabrikant. De geleiding uitgang kan worden gecorreleerd met de bekende volumes een kalibreringsformule dat de gegevens omzet van RVUs in ¹¹ microliter ontwikkelen.

8. Euthanasie

1. Bij de sluiting van het protocol, worden de muizen gedood met behulp van cervicale dislocatie terwijl onder narcose.
2. Om te zorgen dood, muizen hebben ondergaan cervicale dislocatie moet secundaire werkwijze euthanasie ondergaat. We gebruiken verbloeding onder verdoving met oogsten van hartweefsel voor experimenten of bilateraal thoracotomie onder verdoving.

9. Data-analyse met behulp van Volume Pressure Loop Analyse Software

1. Bereken V _p van Saline Calibration
   1. Selecteer druk en volume lussen verkregen tijdens het uitwerpen van hypertone zoutoplossing (figuur 5A en 5B)
   2. Export loops drukvolume analysesoftware. Kies optie voor Saline kalibratie (figuur 5C)
   3. Noteer de berekende waarde _Vp (Figuur 5D).
      Opmerking: De _Vp waarde wordt berekend door het identificeren van het snijpunt van de 1) Eind-diastolische volume versus eind-systolisch volume van de zoutoplossing kalibratie en 2) End-diastolisch volume = eind-systolisch volume lijn. Het snijpunt van deze lijnen geeft de _Vp, die wordt berekend door de druk volume curve analyse software.
2. Voer geleiding naar volume (RVU) ten opzichte van het volume kanaal opties (Figuur 1F)
3. Meet Baseline druk-volume loop relatie
   1. Selecteer 8-10 cardiale cycli van druk en volume kanalen eenmaal steady state is bereikt (Figuur 2A) en de uitvoer naar de analyse zachteware. Identificeer 5-6 eindexpiratoire lussen (Figuur 2B)
   2. Gebruik de _Vp waarde te corrigeren voor parallelle geleiding. Kies de optie 'Steady State' en het genereren van een hemodynamische overzichtstabel (figuur 2C)
4. Maatregel Pressure-Volume loop Relation tijdens Aorta Vernauwing
   1. Selecteer 8-10 hartcycli van druk en volume kanalen die overeenkomen met aorta vernauwing voorafgaand aan een verhoging van eind-diastolische druk (figuur 3A) en de uitvoer naar analysesoftware. Identificeer 5-6 eindexpiratoire loops (figuur 3C)
   2. Selecteer "Contractiliteit" analyse (Figuur 3B), die de End-systolische druk Volume Relation berekent (ESPVR)
5. Maatregel Pressure-Volume loop Relation tijdens IVC Vernauwing
   1. Selecteer 8-10 hartcycli van druk en volume kanalen die overeenkomen met IVC vernauwing (Figure 4A) en de uitvoer naar analyse software. Identificeer 5-6 eindexpiratoire lussen (Figuur 4B)
   2. Selecteer "Contractiliteit" analyse (figuur 3B), die voorspanning rekruteerbare Stroke Work berekent (PRSW) (Figuur 4C), maximum dP / dt versus EDV (figuur 4D), evenals de ESPVR en eind-diastolische druk volume verhouding (Fig 4E)

Resultaten

De druk-volume curve analyse kan worden gebruikt om de hartfunctie bij genetisch gemodificeerde muizen of muizen ondergaan ^14,15 drug studies ¹⁶ meten. Representatieve druk volume lussen zijn voorzien van het eerder gepubliceerde werk ¹⁶ onderzoeken van het effect van ß-arrestine bevooroordeeld AT1R ligand, TRV120023. Om te testen of TRV120023 invloed op de hartfunctie in vivo, werd de druk-volume lus analyse uitgevoerd op wild-type muizen die conventionele en nieuwe angiotensin...

Discussie

We beschrijven een werkwijze voor de druk-volume curve analyse perfoming met een conductantiecatheter bij muizen, uitgebreide analyses van zowel cardiale contractiliteit en relaxatie ontlenen. Suga, Sagawa en collega benut druk-volume lussen maatregelen van cardiale contractiliteit bijzonder de helling van de ESPVR of eind-systolische elastantie (E _sen) en _Emax definiëren. Elasticiteit, bepaald door de verhouding van druk op volume (P / V) varieert over de duur van systole. Tijdens elke systole, de...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
AnaSed (xylazine)	Lloyd Laboratories	NADA no. 139-236	Anestheticum
Ketaset (ketamine)	Pfizer	440842	Anestheticum
VIP3000	Matrx Medical Inc.		Anesthesieapparaat
Ventilator	Harvard Apparatus	Model 683	Chirurgisch materieel
Tubing kit	Harvard Apparatus	72-1049	Chirurgisch materieel
Homeothermic Blanket	Kaz Inc.	5628	Chirurgisch materieel
Stereo microscope	Carl Zeiss Optical Inc.	Stemi 2000	Chirurgisch materieel
Illuminator	Cole–Parmer	41720	Chirurgisch materieel
Dumont no. 55 Dumostar Forceps	Fine Science Tools Inc	11295-51	Chirurgische instrumenten
Graefe forceps, curved	Fine Science Tools Inc	11052-10	Chirurgische instrumenten
Moria MC31 forceps	Fine Science Tools Inc	11370-31	Chirurgische instrumenten
Mayo scissors	Fine Science Tools Inc	14512-15	Chirurgische instrumenten
Iris scissors	Fine Science Tools Inc	14041-10	Chirurgische instrumenten
Halsey needle holder	Fine Science Tools Inc	12501-13	Chirurgische instrumenten
Olsen–Hegar needle holder	Fine Science Tools Inc	12002-12	Chirurgische instrumenten
spring scissors	Fine Science Tools Inc	15610-08	Chirurgische instrumenten
disposable underpads	Kendall/Tyco Healthcare	1038	Chirurgische benodigdheden
Sterile gauze sponges, sterile	Dukal	62208	Chirurgische benodigdheden
Cotton-tipped applicators, sterile	Solon	368	Chirurgische benodigdheden
Surgical suture,  silk, 6-0	DemeTECH	FT-639-1	Chirurgische benodigdheden
1 cc Insulin syringes	Becton Dickenson	329412	Chirurgische benodigdheden
Access 9 Hemostasis Valve	Merit Medical	MAP111	Hemodynamisch materieel
Sphygmomanometer	Baumanometer	320	Hemodynamisch materieel
Millar PV system MPVS-300/400 or MPVS Ultra (includes calibration cuvette)	ADInstruments Inc		Hemodynamisch materieel
1.4F conductance catheter	ADInstruments Inc	SPR-839	Hemodynamisch materieel
PowerLab 4/30 with Chart Pro	ADInstruments Inc.	ML866/P	Hemodynamische software
animal clipper	Wahl	8787-450A	Diverse
Intradermic tubing PE-10	Becton Dickenson	427401	Diverse
Intradermic tubing PE-50	Becton Dickenson	427411	Diverse
Needle assortment (18, 25 and 30 gauge; Thomas Scientific)			Diverse
0.9% (wt/vol) sodium chloride injection, USP)	Hospira	NDC no. 0409-4888-50	Diverse
Surgical tape			Diverse
Alconox (Alconox Inc.) for catheter cleaning	ADInstruments Inc.		Diverse