Eenvoudig en Computer-assisted Olfactorische testen voor Muizen

Summary

We presenteren een eenvoudige en onbevooroordeelde olfactorische test bij muizen. Met dit protocol kunnen olfactorische discriminatie, voorkeur, vermijding en gevoeligheid voor een nieuwe geur in vergelijking met water worden beoordeeld in sessies van enkel gedrag. Deze methode is geïndiceerd voor een enkele experimentator en de analyse is gebaseerd op computerondersteunde videoverwerking.

Abstract

Reukzin is sterk geconserveerd tussen soorten en is vereist voor de reproductie en overleving.

Bij mensen reukzin is één van de betekenissen die is aangetast door veroudering en is een sterke voorspeller van neurodegeneratieve ziekten. Aldus wordt reukzin testen gebruikt als een niet-invasieve diagnostische methode van neurologische tekorten vroeg detecteren. Om de mechanismen die ten grondslag liggen aan olfactorische netwerk gevoeligheid te begrijpen, heeft olfactorische onderzoek in knaagdieren momentum opgedaan in het afgelopen decennium.

Hier is een zeer eenvoudige, efficiënte en reproduceerbare tijd olfactorische testmethode van aangeboren geurwaarneming en gevoeligheid in muizen presenteren we zonder of vooraf voedsel of water beperking. De tests worden uitgevoerd in een vertrouwde omgeving aan de muizen, vereisen slechts de geuren en 2 min sessie geurstof blootstelling. De analyse wordt uitgevoerd, post-hoc computergestuurd ondersteunde commando's ImageJ en kan derhalve, Van begin tot eind uitgevoerd door een onderzoeker.

Dit protocol vereist geen speciale hardware of configuratie nodig en is geïndiceerd voor elk laboratorium geïnteresseerd zijn in het testen van olfactorische perceptie en gevoeligheid.

Introduction

Reukzin is een van de meest ontwikkelde en belangrijke zintuigen bij zoogdieren. Elke impairment in olfactorische activiteit kan beïnvloeden voedselinname, sociaal gedrag en, in het ergste geval, zelfs overleven. Bij mensen olfactorische verslechtering leeftijdsafhankelijk ¹ en als een sterke voorspeller van neurologische aandoeningen ^2-6. De olfactorische identificatie-test ontwikkeld door de Universiteit van Pennsylvania vertegenwoordigt momenteel een van de meest gebruikte, niet-invasieve en kwantificeerbaar, diagnostische tests die vroege neurologische tekorten ⁷ kunnen beoordelen en te voorspellen met een hoge kans op de progressie van dementie ^8,9.

De toegankelijkheid van het olfactorische systeem en de bekendheid van de reukzin bij knaagdieren, heeft een intense lijn van onderzoek aanpakken van de onderliggende mechanismen die olfactorische functies ¹⁰ aangewakkerd. We hebben eerder aangetoond dat het verlies van functie van de signalering receptof Notch1 beïnvloedt olfactorische vermijden ^11. In dit protocol gebruiken we muizen ontbreekt de signalering ligand, Jagged1, in neuronen of glia om olfactorische prestaties te bestuderen.

Innate reukzin wordt gedefinieerd door drie parameters als waarneming, discriminatie tussen geuren en olfactorische gevoeligheid ^4. Olfactorische testen bij knaagdieren kan op verschillende manieren en dragstherapie onderzoeken maken gebruik van olfactometers, waarvan de geur aan het dier verschaffen van een specifiek dampconcentraties en een nauwkeurig tijdschema ^12-14. Toch is dit instrumentatie is duur en zijn mogelijk alleen beschikbaar in gespecialiseerde faciliteiten. In ons werk, bieden wij een eenvoudige, snelle en reproduceerbare olfactorische testprotocol, dat wordt uitgevoerd met behulp van vluchtige geuren. De tests beschreven maatregel perceptie van een lokstof of een afstotende geur en de discriminatie tussen de geur en water ^11,15,16 evalueren. Met dezelfde setup, we kan de gevoeligheid voor een geur bij verschillende concentraties ^16,17 meten. De post-hoc-computerondersteunde videoverwerking, geïnspireerd door het werk van de pagina en collega's ^18, biedt resultaten zonder de noodzaak van het experimentele verblinding en de mogelijkheid van een persoon om het hele experiment uit te voeren.

Dit protocol is bedoeld als uitgangspunt voor het bestuderen olfactorische gedrag bij muizen.

Protocol

Alle dierlijke procedures het in overeenstemming zijn met de EU-Richtlijn 2010/63 / EU betreffende de bescherming van dieren die voor wetenschappelijke doeleinden worden gebruikt en zijn goedgekeurd door de lokale Animal Care Committee (kanton Fribourg, Zwitserland).

1. Dierlijke Voorbereiding

1. Proefdieren
   1. Experimenten uitvoeren van mannelijke volwassen wildtype en transgene muizen (C57BL / 6 achtergrond) van 3-5 maanden. De drie groepen muizen overeen met wildtype nestgenoot controles (groep A, Jagged1 flox / flox ¹⁹⁾ en twee voorwaardelijke KO muizenlijnen (groep B, en C Jagged1ncKO, Jagged1gcKO).
   2. Huis muizen onder standaard laboratorium omstandigheden in een geventileerde ruimte, met een 12 hr gecontroleerde donker / licht-cyclus en zorgen voor voedsel en water ad libitum.

2. Experimentele Setup

1. Experimentele arena
   1. Voor de experimentele arena, gebruik dan een schone gesteriliseerde muis kooi (36 cm lengte x 20,5 cm breed x 13,5 cm hoog) (Figuur 1A).
   2. Wijs elke muis aan een genummerde kooi met fris beddengoed, 3 cm hoog. Als kooien worden hergebruikt, zoals in de geur gevoeligheid test, de volgende maatregelen te nemen om kruisbesmetting tussen geuren en muizen te voorkomen.
      1. Markeer de waterzijde.
      2. Reinig de smallere wanden van de kooien met twee tissuepapier besproeid met 70% ethanol, een voor elke zijde.
      3. Stapel kooien volgens de genotype van de muizen en tijdelijk op te slaan onder een laminaire afzuigkap.
2. Camera
   1. Monteer een camera op een statief aangepast met het oog op 58 cm van de onderkant van de kooi (figuur 1A). Bevestig de positie van het statief en de kooi en bakenen met markeringen om de camera te centreren op de bovenkant van de kooi.
   2. Record video's bij 320 pixels x 240 pixels, 15.08 frames per seconde als MOV-bestanden.
3. Geuren
   1. Resuspendeer de scents, op indicatie, in het oplosmiddel waarin zij oplosbaar zijn.
   2. Voor de voorkeur testen gebruik pindakaas. Resuspendeer de pindakaas pinda olie (10% w / v).
   3. Ter vermijding testgebruik pure 2-methylboterzuur (2-MB) acid (98%).
   4. Voor de gevoeligheidstest Gebruik female urine uit dezelfde muizenkolonie en achtergrond (C57BL / 6).
      1. Gemakshalve verzamelen van de urine 1-2 dagen voorafgaand aan het olfactorische proef. Restrain en houd de muis onder de kap met zijn buik boven de kooi net. Onder de kooi rooster plaatst een plastic petrischaal met de druppels urine te verzamelen.
      2. Verzamel de urine van elk vrouwtje in een 1,5 ml buis en meng alle urinemonsters te normaliseren van variabiliteit tussen de dieren. Bewaar bij -20 ° C tot gebruik.
      3. Op de dag van het experiment dooi urine en voer 4 verdunningen met tweemaal gedestilleerd water met een verdunningsfactor van 10 (1:10, 1: 100, 1: 1000, 1: 10.000).

3. Olfactorische Testing

Opmerking: In dit protocol geuren zijn bewust gekozen die worden gezien als sterke lokstoffen (pindakaas en vrouwelijke urine) of sterke afstotende (2-MB zuur) ^15. Het is belangrijk de voorkeur en gevoeligheidstests aangename geuren voorafgaand voeren naar vermijdingstest om de mogelijkheid van enige interferentie met de olfactorische gedrag elimineren. Niettemin is het voor de eenvoud in dit document, voorkeur en vermijdingstest zullen beide worden beschreven in de perceptie testen. Elke behavioral sessie start met een gewenning fase.

1. Gewenning Phase
   1. Plaats het dier in de schone toegewezen kooi en laat deze onderzoeken voor 5 min (Figuur 1B). Daar de omgeving van de experimentele kooi bekend aan de kooi, deze korte tijd genoeg om voor gewenning.
   2. Als de gevoeligheid testen in één dag is voltooid, voert gewenning maar één keer voor de application van de hoogste verdunde geur. Als de gevoeligheid test op verschillende dagen wordt uitgevoerd, op elke dag een gewenning fase op een nieuwe, schone kooi nodig is.
2. Perception Test
   1. Na gewenning, het activeren van de camera en onmiddellijk pipet 60 ul van de aangename geur (pindakaas) en 60 ul van de neutrale geur (leidingwater) op de tegenoverliggende wanden van de kooi op ongeveer 10 cm van de bodem (figuur 1C).
   2. Laat de muis verken de geuren voor 2 min (figuur 1D). Daarna schakelt de camera uit.
   3. Op dit moment, verder met de volgende muis vanaf de gewenning fase. Voer de vermijdingstest exact dezelfde wijze door toepassing van 60 pi van het afstotende geur (2-MB acid) en 60 pl water.
3. Gevoeligheid-test
   1. Evalueer de aantrekkelijkheid drempel van mannelijke muizen met toenemende concentraties van vrouwelijke urine in de volgende volgorde: 1: 10.000; 1: 1000; 1: 100; 1:10 en pure urine.
   2. Na gewenning, bloot elke muis met de hoogste verdunning gepipetteerd door de experimentator zoals eerder beschreven in 3.2.1.
   3. Noteer de verkennende gedrag van de urine versus water, binnen een 2 min tijdsbestek op een video camera. Nadat alle muizen cohorten worden getest op de hoogste verdunning (1: 10.000), blootgesteld aan een hogere concentratie van urine, zoals hierboven aangegeven.

4. Post-hoc gegevensanalyse

Opmerking: Alle gedragstesten beschreven worden volgens de instructies data-analyse verwerkt post hoc.

1. Open MOV Bestanden in ImageJ voor Windows-systemen
   1. Installeer Quick Time voor Java met behulp van de aangepaste instellingen van http://www.apple.com/quicktime/download.
   2. Installeer de Quick Time plugin van de website ImageJ (http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/qt-capture.html).
   3. Importeer de QTJava.zip (C: Program Files QuickTime QTSystem) in de bibliotheek extensometersion van ImageJ (.ImageJ jre lib ext).
   4. Kopieer ook de QTJava.zip in de map plugins en hernoem het als QTJava.jar.
   5. Installeer de zes scripts bevestigd in de map macro's (ImageJ plugins Macros).
   6. Open ImageJ en compileren en uitvoeren van de Quick Time plugin, daarna dicht ImageJ.
   7. Heropenen ImageJ en open het MOV-bestand via Bestand> Importeren> met Quick Time.
2. Video Adjustment
   1. Zodra het videobestand wordt geopend in ImageJ, snijd de video om een ​​constante 2 min exploratie vanaf het moment de onderzoeker de geurstoffen is gepipetteerd in de kooi (T0) te verkrijgen. Identificeer het frame overeenkomt met de T0 en verwijder de vorige frames met stappen van 1 (ImageJ Image Stapels ToolsSlice remover). Gebruik hetzelfde commando om alle frames boven de 2 min exploratie verwijderen.
   2. Zorg ervoor dat de kooi is gecentreerd en gebruik zo nodig de Afbeelding> Transformatie> opdracht Roteren aan te passen.
3. Video Processing
   Opmerking: Video verwerking is volledig computerondersteund en maakt gebruik van macro commando's bij dit artikel.
   1. Om het gebied op de kooi van een 127 pixels x 218 pixels grootte beperken lopen de Stap 1 macro vanaf de Plugin> Macro's> Uitvoeren commando. Beweeg de vaste rechthoek over de kooi (Figuur 2, Stap 1).
   2. Snijd de oppervlakte van de kooi op het gebied van belang (ROI) met de macro Stap 2 (Figuur 2, Stap 2).
   3. Gebruik de Stap 3 macro om de muis afbeelding van de achtergrond te halen door het toewijzen van een drempel signaal, ontvlekken en filteren van het signaal variantie. De waarden in de Z-as grafiek geven de gemiddelde grijswaarden, die overeenkomt met de intensiteit van de muis schaduw zich binnen het ROI van de "waterkamer" tijdens de 2 min exploratie. Kopieer de resultaten in een werkblad genoemd naar het ROI in rekenbladbestand (Figuur 2, Stap 3).
   4. Gebruik de Stap 4 macroextraheer de gemiddelde grijswaarden van de muis in het ROI "geur chamber". Kopieer de resultaten in een werkblad genoemd naar de ROI in dezelfde spreadsheetbestand zoals in 4.3.3 (figuur 2, stap 4).
   5. Om de analyse van de muisbewegingen in het ROI "water perimeter" verder te beperken gebruiken Stap 5 macro. Kopieer het resultaat op het werkblad genoemd naar de ROI in dezelfde spreadsheetbestand zoals in 4.3.3 (figuur 2, stap 5).
   6. Om de analyse van de bewegingen van de muis in de ROI "geur perimeter" beperkt gebruik maken van de Stap 6 macro. Kopieer het resultaat op het werkblad genoemd naar het ROI spreadsheetbestand zoals in 4.3.3 (figuur 2, stap 6).
   7. Verwerk alle video's en controleer de consistentie van het aantal frames per dieren. Hier, nemen alle voor 1810 frames die overeenkomen met een 2 min verkenning sessie.
   8. Voor elk dier en voor elke ROI soort frames met een gemiddelde grijs values groter dan 0. Verdeel het aantal frames van de waarden die overeenkomen met 1 seconde en het verkrijgen seconden doorgebracht in elk ROI.

5. Statistische analyse

1. Voor elke test controleren homogeniteit van variantie binnen groepen / genotypes van Bartlett's test met de formule beschikbaar http://www.real-statistics.com/one-way-analysis-of-variance-anova/homogeneity-variances/.
2. In de aantrekking en vermijding test uitvoeren vergelijken de tijd doorgebracht met water versus geur binnen één groep onder toepassing van een ongerichte t-toets bij gelijke of ongelijke varianties afhankelijk van de resultaten van de Bartlett-test. Vergelijk de tijd doorgebracht met de geuren afgetrokken tegen de tijd doorgebracht met water tussen de genotypen door one-way ANOVA met Bonferroni post-hoc-test.
3. In de gevoeligheid testen analyseren de vergelijkingen van de tijd doorgebracht met de geur afgetrokken van de tijd doorgebracht met water tussen groepen op een specifieke verdunningen van urine door eenzijdige ANOVA met Bonferroni post-hoc-test. Vergelijk de gevoeligheid tussen groepen aan de groeiende concentraties geur door 2-Way ANOVA met herhalingen met Bonferroni post-hoc-test.
4. Interactie tussen genotypen en behandelingen in de aantrekkingskracht en vermijding testen worden onderzocht door 2-way ANOVA met Bonferroni post-hoc-test.

Results

De perceptie test meet de aantrekkingskracht pindakaas en vermijding 2-MB zuur. Drie groepen muizen worden getest en de tijd doorgebracht in de "geur omtrek" worden gekwantificeerd ten opzichte van water. In de preferente proef de controlegroep A vertoont significante voorkeur voor de geur in vergelijking met water ₍₈ t = 2,52, p <0,05). Aan de andere kant, groep B geen significante aantrekkingskracht pindakaas te tonen en besteedt meer tijd met water ₍₆ t = 3,22, p <0,05). Zo is he...

Discussion

De in dit protocol voorgesteld testen toelaten om verschillende aspecten van aangeboren olfactorische gedrag bij muizen te evalueren: perceptie te geuren, discriminatie tussen geuren versus water en gevoeligheid voor geuren. Dit protocol kan worden toegepast op elke geur dat naar keuze en voorkoming schaal eerder aangetoond ^15. Aangezien het protocol is gebaseerd op experimentele activiteit is het belangrijk dat muizen geen motorische beschadiging of angst, die hun beweging kunnen beïnvloeden en verstoren olf...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Muisenkooi	Italplast (Italië)	1144B	36 cm lengte x 20,5 cm breedte x 13,5 cm hoogte
Gespleten houten bedden	Abedd (Oostenrijk)	LTE E-001	3 cm hoog
Pindakaas	Migros (Zwitserland)	NA	1:10
2-Methylbutyric	Sigma Aldrich (Zwitserland)	W269514	Puur
Vrouwelijke urine van vruchtbare vrouwtjes van hetzelfde muisras	NA	NA	Verdunningsreeks
Camera	Olympus (VS)	Camedia C-8080	MOV-bestanden
Quicktime voor Java (Windows)	Apple (VS)	NA	video-plugin voor het visualiseren van MOV-bestanden
ImageJ voor Windows	NIH (VS)	NA	Videoverwerking/Analyse