Fase Diagram Analyse Met behulp van Magnetic Beads als vloeibare dragers

Samenvatting

Hier presenteren we een protocol om multi-component fasediagrammen te onderzoeken met behulp van extern bestuurde magnetische kralen als vloeistofdragers in een lab-in-buis aanpak. Deze aanpak kan helpen bij toepassingen die meer informatie willen verzamelen over faseovergangen in complexe vloeistofsystemen.

Samenvatting

Magnetische kralen met ~ 1,9 micrometer gemiddelde diameter werden gebruikt microliter hoeveelheden vloeistoffen tussen aangrenzende segmenten transporteren vloeistof met een slang ten behoeve van onderzoek faseverandering van de vloeistof segmenten. De magnetische bolletjes werden extern gecontroleerd met behulp van een magneet, waardoor de korrels aan de luchtklep tussen de aangrenzende segmenten vloeibare overbruggen. Een hydrofobe bekleding werd aangebracht op het binnenoppervlak van de buis om de scheiding tussen de twee vloeibare segmenten verbeteren. Het aangelegde magnetische veld vormde een aggregaat cluster van magnetische korrels, het vastleggen van een bepaalde vloeistofhoeveelheid binnen de cluster die wordt aangeduid als overdracht volume. Een fluorescerende kleurstof werd toegevoegd aan een vloeibaar segment, gevolgd door een reeks van overdrachten vloeistof, die vervolgens veranderde de fluorescentie-intensiteit in de omringende vloeistof segment. Op basis van de numerieke analyse van de gemeten fluorescentie-intensiteit verandering, heeft de carry-over volume per massa van magnetische bolletjes gevondennaar ~ 2 tot 3 ul / mg. Deze kleine hoeveelheid vloeistof termijn voor het gebruik van relatief kleine vloeibare segmenten van een paar honderd microliter, verbeteren van de uitvoerbaarheid van de inrichting voor een lab-in-buis benadering. Deze techniek van het aanbrengen van kleine compositionele variatie in een vloeistofvolume werd op de analyse van de binaire fasediagram tussen water en oppervlakte-C12E5 (pentaethylene monododecyl glycol ether), wat leidt tot snellere analyse met kleinere monstervolumes dan conventionele werkwijzen.

Inleiding

Magnetische korrels (MB) in de orde van 1 micrometer in diameter zijn gebruikt ^1,2- vaak in microfluïdische toepassingen, met name voor biomedische apparaten. Bij deze inrichtingen hebben MBs geboden mogelijkheden zoals cel en nucleïnezuur scheiding contrastmiddelen en geneesmiddelafgifte, een paar te noemen. De combinatie van externe (magnetisch veld) controle en-druppel op basis van microfluidics heeft ³ controle van immunoassays met behulp van kleine hoeveelheden (<100 nl) ingeschakeld. MB's hebben ook aangetoond belofte wanneer gebruikt voor vloeibare hanteren ^4. Deze benadering maakt gebruik van de MB aan biomoleculen tussen vloeibare segmenten vervoer binnen een buis van elkaar gescheiden door een luchtklep. Deze methode is niet zo krachtig als andere complexere lab-on-chip apparaten in het verleden, maar het is veel eenvoudiger en biedt wel de mogelijkheid hanteren microliter grotere hoeveelheden vloeistof. Een soortgelijke benadering is recentelijk gerapporteerd ⁵ per groep Haselton en toegepast biomedischassays.

Een van de belangrijkste van deze inrichting is het vloeibare segment scheiding die door de oppervlakte-spanning-gestuurde luchtklep. Microliter hoeveelheden vloeistof verbonden MB worden getransporteerd door deze luchtspleet tussen vloeibare segmenten met behulp van een extern aangelegd magnetisch veld. Microdeeltjes MB's (van ~ 0,4-7 micrometer in diameter met een gemiddelde van 1,9 urn) onder invloed van het externe magnetisch veld een microporeuze cluster binnen vloeistofvangers. De kracht van deze vloeistof entrapment voldoende is om de krachten van de oppervlaktespanning weerstaan ​​bij het transporteren van de MB's van het ene reservoir naar de volgende. Meestal is dit effect ongewenst is, omdat de meeste benaderingen willen alleen transport van specifieke moleculen (bijvoorbeeld biomarkers) vervat in de vloeistof ^6. Zoals te zien is in ons werk, dit effect kan worden gebruikt om een ​​positief aspect van de inrichting te worden.

We hebben deze 'lab-in-buis gebruiktAanpak, schematisch weergegeven in figuur 1, voor het analyseren van fasediagrammen in binaire materiaalsystemen. De oppervlakteactieve C12E5 is gekozen als de belangrijkste focus van de karakterisering, omdat het op grote schaal wordt gebruikt in industriële toepassingen, zoals farmaceutische producten, levensmiddelen, cosmetica, enz. In het bijzonder werd de H _{2 O} / C12E5 binair systeem onderzocht, omdat het een rijke set van fasen om te verkennen. We hebben gericht op een specifiek aspect van deze stof mengsel, namelijk de overgangen naar vloeibaar kristallijne fasen onder bepaalde concentraties ^7-9. Deze overgang wordt gemakkelijk in onze apparaat waargenomen door het opnemen van polarisatoren in de optische microscopie studies om fasegrenzen markeren.

In staat zijn om fasediagrammen kaart is een zeer belangrijk gebied van onderzoek met het oog op de betrokken met faseovergang ¹⁰ kinetiek begrijpen. Het vermogen om de interactie van oppervlakteactieve stoffen met oplosmiddelen een nauwkeurig bepalennd overige componenten cruciaal gezien de complexiteit en vele fasen ^11. Vele andere technieken zijn eerder gebruikt om faseverandering karakteriseren. De conventionele benadering behelst het maken van vele monsters, elk bestaande uit verschillende concentraties en hen in evenwicht, waarbij lange verwerkingstijden en hoge hoeveelheid monstervolumes vereist. Vervolgens worden de monsters gewoonlijk geanalyseerd door optische methoden zoals diffuse grensvlak transport (DIT), die een hoge-resolutie van dergelijke oppervlakteactieve preparaten ^12,13 biedt. Vergelijkbaar met de methode die we hebben gebruikt, maakt gebruik van de DIT methode gepolariseerd licht aan het duidelijke fasegrenzen.

Protocol

1. Voorbereiding van de one-time gebruik Materialen in Apparaatbeheer

1. Voorbereiding van de buis
   1. Snijd slangen in 15 cm segmenten. Tubing heeft 1,6 mm inwendige diameter en 3,2 mm buitendiameter.
   2. Hang buissegmenten verticaal met tape. Plaats papieren handdoek onder buizen om het overtollige fluorpolymeer oplossing te verzamelen.
   3. Injecteer 100 ui van fluorpolymeer oplossing in bovenopening van elk buissegment gebruik van de spuit, zodat het in contact gehele omtrek van de binnenste wand komt.
   4. Sta buis segmenten op te hangen in plaats van 1 uur tot overmaat fluorpolymeer oplossing te verwijderen.
   5. Verwijder eventueel fluorpolymeer oplossing van onderzijde van de buis die niet druppelen uit. Verwijder slang uit opknoping positie en gooi papieren handdoeken.
   6. Plaats buissegmenten in de oven bij 100 ° C gedurende 1 uur om het fluorpolymeer bekledingslaag gloeien.
   7. Verwijder buis segmenten uit de oven. Gebruik een pincet, als buis segmenten zal heet zijn.
2. Bereiding van verdunde magnetische bead oplossing
   1. Bereken magnetische bead concentratie nodig om de gewenste overdracht volume te bereiken, zoals bepaald door de relatie tussen de overdracht volume en massa MB figuur 2.
      Opmerking: De originele MB oplossing 1 g MB in 50 ml oplossing. Uitgaande van een testkamer volume van 20 ui, verdund originele MB-oplossing met gedestilleerd water tot een verhouding van 6: 4 (MB oplossing: water) een carry-over volume van ~ 0,4 ul verkrijgen. Pas verdunningsverhouding bij verschillende carry-over volume gewenst is.
   2. Plaats een 20 ml monsterflesje op een micro-balans. Nul de balans.
   3. Schud de magnetische kraal oplossinghouder, dan trekt 0,6 ml met behulp van een micropipet.
   4. Afzien gepipetteerde oplossing in het monster flesje per saldo.
   5. Doseer 0,4 ml gedestilleerd water in het monster flesje.
3. Fluorescerende kleurstof liquid voorbereiding
   1. Los 2 gew.% Van kleurstof in gedeïoniseerd water door vortexen de oplossing gedurende 1 min.

2. Voorbereiding van de experimentele opstelling voor Fluorescentie Experimenten

1. Bereiding buis apparaat.
   1. Plaats een vrouwelijke Luer-lock connector op één uiteinde van de slang.
   2. Breng de buis in een luerlockspuit die een volume 3 ml en 0,1 ml afstuderen heeft.
   3. Plaats de injectiespuit in de spuitpomp en stel de toevoersnelheid bij 2 ml / uur.
   4. Voor nauwkeurige inbrengen van vloeistoffen in de slang, gebruik de spuitpomp aan de oplossing die het magnetische kralen en fluorescerende kleurstof trekken.
   5. Breng 20 gl van magnetische bead-oplossing in buis met behulp terugtrekking injectiepomp. Deze vloeistof segment wordt aangeduid als de testkamer (testkamer volume kan variëren afhankelijk van het experiment). Vortex de container met magnetische kraal oplossing gedurende 1 minuut en dan schud de hand tijdens de terugtrekking cyclus uniforme MB dispersies te vormen.
   6. Na testkamer vloeistof inbrengen wordt gesloten, trekt 6 ul van de lucht in de buis. Dit luchtvolume zal later vormen een afsluiter tussen de twee vloeibare segmenten.
   7. Na luchtspleet inbrengen is voltooid, beginnen terugtrekking 180 ul van vloeistof met fluorescerende kleurstof. Deze vloeistof segment wordt aangeduid als het reservoir. Reservoirvolume kan variëren afhankelijk van het experiment. Groter reservoir volume is gunstig voor de verandering van de kleurstof concentratie minimaal.
   8. Plaats een tweede vrouwelijke Luer-lock connector op het andere uiteinde van de buis.
   9. Verwijder het buisinrichting van de spuit.
   10. Plaats Luer-lock caps aan beide uiteinden van de inrichting.
2. Optica setup voor fluorescentie experimenten
   1. Zet alle componenten aangesloten op de omgekeerde microscoop.
   2. Zet de computer en open de microscoop imaging software.

"> 3. Experimentele Procedure voor fluorescentie experimenten

1. Neem de eerste fluorescentie-intensiteit meting van de testkamer en het reservoir met behulp van de omgekeerde microscoop. Bij het analyseren van de fluorescentie van het monster te verzekeren dat de focus in het midden (in x- en y-richting) van het vloeibare deel in de buis. Record metingen in data spreadsheet.
2. Plaats het apparaat over de top van kubusmagneet zodanig dat de magnetische bolletjes alle segregeren op een gebied in de testkamer. Breng de parels aan het reservoir door het bewegen van de inrichting over de top van de magneet (~ 10 sec). De 1 inch neodymium kubusmagneet is leerjaar N48 met een trekkracht van 45,6 kg.
3. Zodra magnetische kraal cluster wordt overgedragen via de luchtspleet en in het reservoir, schud de magnetische korrels door het plaatsen van het apparaat over de top van de magneet en roteren om de vloeistof wordt opgesloten binnen het cluster los. Blijf roeren van de magnetische korrels tot homogenisering van het reservoir isafgerond (~ 30-45 sec).
4. Plaats het apparaat over de top van de magneet zodanig dat de magnetische korrels in het reservoir alle scheiden om een ​​gebied. Breng de magnetische kraal cluster terug naar de testkamer.
5. Zodra de cluster de testkamer bereikt, bewegen de magnetische korrels door het plaatsen van het apparaat over de top van de magneet en roteren om de gevangen fluorescerende vloeistof binnen los. Doorgaan agitatie van de magnetische bolletjes tot homogenisering van de testkamer is afgerond (~ 30-45 sec).
6. Neem fluorescentie-intensiteit metingen van zowel de testkamer en het reservoir met de geïnverteerde microscoop. Record metingen in data spreadsheet.
7. Stappen 3,2-3,6 herhaald totdat zowel vloeibare segmenten convergeren naar vergelijkbare fluorescentie-intensiteiten (~ 100 cycli).

4. Numerieke Analyse van de TL-gegevens

1. Met de fluorescentie-intensiteit van gegevens opgeslagen in een spreadsheet, voer numerieke analyse met behulp van MATLAB.
2. Derive vergelijkingen om een ​​theoretische waarde van de fluorescentie-intensiteit te berekenen in zowel het reservoir en de testkamer. Nemen de volgende vergelijkingen in een MATLAB script bestand:
   waarbij I de fluorescentie-intensiteit (AU), V = volume (pl), n is het aantal overschrijvingen, R het reservoir, T de testkamer en C overdracht.
3. Met behulp van MATLAB, het genereren van percelen en analyseren om de overdracht volume voor alle experimenten te bepalen. Gebruik deze gegevens om figuur 2 te produceren.

5. Voorbereiding van de experimentele opstelling voor Surfactant Experimenten

1. Bereiding buis apparaat.
   1. Plaats een vrouwelijke Luer-lock op een uiteinde van de slang.
   2. Breng de buis in een Luer-lock spuit.
   3. Plaats de injectiespuit in de spuitpomp en stel de toevoersnelheid bij 2 ml / uur.
   4. Voor nauwkeurige inbrengen van vloeistoffen in de slang, gebruik de spuitpomp aan de oplossing die het magnetische kralen en su trekkenrfactant.
   5. Plaats 20 ul magnetische kraal oplossing in de buis met behulp van terugtrekking injectiepomp. Deze vloeistof segment wordt aangeduid als de testkamer (testkamer volume kan variëren afhankelijk van het experiment). Schud de container met magnetische kraal oplossing door hand tijdens de terugtrekking cyclus uniforme MB dispersies te vormen.
   6. Na testkamer vloeistof inbrengen wordt gesloten, trekt 6 ul van de lucht in de buis. Dit luchtvolume zal later worden aangeduid als de luchtspleet.
   7. Na luchtspleet inbrengen is voltooid, beginnen terugtrekking 180 pi zuivere C12E5 oppervlakteactieve. Dit zal later worden aangeduid als het reservoir.
2. Optica setup voor oppervlakteactieve experimenten.
   1. Beweeg de spuit pomp met slangen apparaat zodanig dat de testkamer met magnetische bolletjes in focus met de stereo-microscoop.
   2. Leg een vel polarisator film op de top van een LED lichtbron. Schuif de LED-lichtbron onder de buis verbonden aande injectiepomp.
   3. Voeg nog polarisatorfilm de lens van de stereomicroscoop met tape. Zorg ervoor dat de beide folies een polarisator 90 graden ten opzichte van elkaar.
   4. Monteer een CCD (charge coupled device) camera aan op de stereo-microscoop. Sluit de camera aan op de computer en het openstellen van de imaging software.

6. Experimentele Procedure voor oppervlakteactieve Experiments

1. Plaats de kubus magneet naast de testkamer, terwijl de magneet op een stand wordt gemonteerd.
2. Nadat de magnetische korrels vormen een cluster beginnen pompen van vloeistoffen in de buis bij de toevoersnelheid van 2 ml / uur, zodanig dat de magnetische kraal cluster wordt verplaatst van de testkamer, over de luchtspleet en in het surfactant reservoirkamer.
3. Nadat de magnetische kraal cluster het middelpunt van de reservoirkamer bereikt, stopt de pomp op de injectiepomp.
4. Verplaats de kubus magneet weg van de buis, waardoor magnetische korrels een scheidennd verminderen de diffusie van de vloeistof ingesloten in het magnetische bolletje cluster.
5. Kijken naar het computerscherm om de H te observeren ₂ O / C12E5 mengsel door de verschillende fasen.
6. Zodra de diffusie en de faseverandering van de vloeistof voltooid is, plaatst de magneet weer in oude bestemming van het reservoir zodat de magnetische korrels vormen een cluster.
7. De spuitpomp, trekt de vloeistof zodanig dat de magnetische kraal cluster wordt van de oppervlakte reservoir, over de luchtspleet, en terug in de H ₂ O testkamer.
8. Nadat de magnetische kraal cluster het middelpunt van de testkamer bereikt, stopt de pomp op de injectiepomp.
9. Verplaats de kubus magneet weg van de buis. Hierdoor kunnen magnetische korrels te scheiden en zal helpen de verspreiding van de vloeistof ingesloten in het magnetische bolletje cluster.
10. Kijken naar het computerscherm om de H te observeren ₂ O / C12E5 mengsel door de verschillende fasen.
11. Zodra de verspreiding en faseverandering van de vloeistof is afgerond, plaatst de magneet terug naar zijn vroegere bestemming door de testkamer waardoor de magnetische bolletjes te vormen in een cluster.
12. Herhaal stappen 6,2-6,11 tot de testkamer een faseverandering weergeeft.

Resultaten

De Lab-in-buis benadering voor het transporteren ul-volume hoeveelheden vloeistof met magnetische korrels met MATLAB voor numerieke analyse, gemiddelde vloeibare versleping volumes, als functie van magnetisch bolletje massa gevonden (figuur 2). Hogere massa van magnetische bolletjes biedt hogere volume carry-over in de snelheid van 2-3 pl / mg. De experimentele opstelling (figuur 1) werd gebruikt om faseverandering in de H ₂ O / C12E5 binair systeem waarnemen. Aangezien de H ...

Discussie

In de meest gebruikelijke technieken voor het fasediagram onderzoek meerdere monsters met verschillende samenstellingen en verhoudingen moeten worden bereid en moeten thermodynamisch evenwicht waarbij een langdurig proces en een aanzienlijke hoeveelheid materiaal veroorzaakt bereiken. Een aantal uitdagingen kunnen worden opgelost door DIT methode (diffusie grensvlak transport) met behulp van platte capillair en de infrarood-analyse methode, maar geen van hen kan alle uitdagingen met lage kosten investering op te lossen....

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
AccuBead	Bioneer Inc.	TS-1010-1	Magnetische kralen
C12E5 Surfactant	Sigma-Aldrich	76437
Thermo Scientific Nalgene 890	Fisher Scientific	14176178
Cube Magnet	Apex Magnets	M1CU
Polarizer Film	Edmund Optics	38-493
Teflon AF	Dupont	400s1-100-1	Fluoropolymeeroplossing
Keyacid Red Dye	Keystone	601-001-49	Fluorescente kleurstof
Luer-Lock	Cole-Parmer	T-45502-12	Vrouwelijk
Luer-Lock	Cole-Parmer	T-45502-56	Mannelijk
Spuit	Fisher Scientific	14-823-435	3 ml
Spuitpomp	Stoelting	53130
Stereomicroscoop	Nikon	SMZ-2T
Inverteerbare microscoop	Nikon	Eclipse Ti-U	De gebruikte filtercube had een excitatiegolflengtebereik van 540-580 nm en een dichroïsche spiegel bij 585 nm, waardoor fotoemissie mogelijk was van 593-668 nm.
Weegschaal	Denver Instruments	PI-225D
Microscoopcamera	Motic	5000