Kwantificering van cytosolische vs. vacuole<em&gt; Salmonella</em&gt; In het Primair macrofagen door Differential Permeabilisatie

Samenvatting

We beschrijven de kwantificering van cytosolische en vacuolaire Salmonella typhimurium in uit beenmerg afgeleide macrofagen met behulp van differentiële digitonine permeabilisatie.

Samenvatting

Intracellulaire bacteriële pathogenen kunnen repliceren in het cytosol of in gespecialiseerde pathogeen bevattende vacuolen (PCVs). Om de cytosol te bereiken, bacteriën zoals Shigella flexneri en Francisella novicida nodig om de breuk van de phagosome induceren. Daarentegen Salmonella typhimurium repliceert in een vacuolaire compartiment zogenaamde Salmonella bevattende vacuole (SCV). Maar bepaalde mutanten van Salmonella niet aan SCV integriteit te behouden en zijn dus vrij in het cytosol. Het percentage cytosolische vs. vacuole bacteriën op het niveau van afzonderlijke bacteriën kan worden gemeten door differentiële permeabilisatie, ook bekend als phagosome bescherming assay. De aanpak maakt gebruik van het onroerend goed van wasmiddel digitonine selectief cholesterol te binden. Aangezien de plasmamembraan bevat meer cholesterol dan andere cellulaire membranen kunnen digitonine worden gebruikt om selectief permeabiliseren het plasmamembraan terwijl intracellulaire membranenintact. Kortom, na infectie met het pathogeen expressie brengen van een fluorescente merker eiwit (bijv mCherry oa), wordt het plasmamembraan gastheercellen permeabel gemaakt met een korte incubatie in digitonine bevattende buffer. De cellen worden vervolgens gewassen en geïncubeerd met primair antilichaam (gekoppeld aan een fluorofoor keuze) gericht tegen de bacterie naar keuze (bijvoorbeeld anti- Salmonella FITC) en opnieuw gewassen. Als alleen bacteriën worden gebruikt, kan een extra stap worden uitgevoerd, waarbij alle membranen permeabel en bacteriën gekleurd met een corresponderende antilichaam. Na de kleuring, kan het percentage in vacuolen en cytosolische bacteriën worden gekwantificeerd door FACS of microscopie door telling met één of twee positieve gebeurtenissen. Hier hebben we experimentele details voor het gebruik van deze techniek met de bacterie Salmonella typhimurium. Het voordeel van deze test is dat, in tegenstelling tot andere assay biedt een kwantificering van het niveau van afzonderlijke bacte-ria, en indien geanalyseerd met behulp van microscopie levert het exacte aantal cytosolische en vacuolaire bacteriën in een bepaalde cel.

Inleiding

Intracellulaire bacteriële pathogenen repliceren rechtstreeks in de gastheercel cytosol of in gespecialiseerde vacuolaire compartimenten ^1. Tijdens de beginfase van de infectie meest pathogenen te geïnternaliseerd hetzij fagocytose door gespecialiseerde cellen (bijvoorbeeld macrofagen) of actief bevorderen hun opname in niet-fagocytaire cellen. In fagocytische cellen, de fagosoom normaal gen met lysosomen een degradatieve compartiment, waarbij de gefagocyteerde deeltjes gedigereerd vormen. Gespecialiseerde cytosolische bacteriën, zoals Francisella novicida of Shigella flexneri, ontsnappen phagosomal afbraak door het induceren van de breuk....

Protocol

1. Digitonine Assay met mCherry-expressie Salmonella (FACS-gebaseerde analyse)

1. Voorbereiden van bacteriën
   Opmerking: Salmonella wildtype SL1344 (streptomycineresistente) tot expressie mCherry uit een plasmide (pFPV codeert mCherry onder RPSM promoter) wordt gebruikt in deze test. Bacteriële fagocytose en proliferatie indien niet gewijzigd door de constitutieve expressie van mCherry (gegevens niet getoond) ^16.
   1. Inoculeer de stam 1 dag vóór de infectie in 3 ml LB medium aangevuld met streptomycine (90 gg / ml) en ampicilline (100 ug / ml, mCherry expressie vector) in een schudder bij 37 ° CO / N.

Resultaten

Figuur 1 en Figuur 2 tonen de schema's van de digitonine assay in protocol 1 en protocol 2 ter illustratie van de kritische stappen in het protocol en de verkregen resultaten worden beschreven. Figuur 3 toont typische FACS resultaten. Positieve en negatieve controles worden gebruikt om de poorten die voor mCherry + / FITC bacteriën (Salmonella vacuole) en mCherry + / + FITC bacteriën (Salmonella cytosol). Op basis van deze poorten het percentage cytosolische en vacuola.......

Discussie

Differential permeabilisatie is een eenvoudige en robuuste methode te analyseren en kwantificeren van de subcellulaire verdeling van de bacteriële ziekteverwekkers tussen vacuole compartimenten en het cytosol. Dezelfde test is met succes gebruikt bij bacteriën zoals Francisella novicida ^2,4 en Shigella flexneri ^12. Aangezien vele intracellulaire pathogenen wijzigen of de ontvangende structuren endomembrane wijzigen, de robuustheid van de digitonine permeabilisatie zal moeten worde.......

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Digitonine	Sigma	D5628	50 μg/ml
PFA	mpbio	219998380
HEPES	Life Technologies	15630
Kaliumacetaat	Sigma	791733
MgCl2	Sigma	M8266
BSA	Sigma	A2153
anti-Salmonella CSA-1-FITC	KPL	01-91-99-MG	1/500
anti-Salmonella CSA-1	KPL	02-91-99-MG	1/500
anti-Calnexine	Enzo Lifesciences	SPA-860D	1/100
anti-PDI	Enzo Lifesciences	SPA-890	1/100
Saponine	Sigma	47036
Vectashield montagemedium	Vectorlabs	H-1200
Anti konijn antilichaam-488	Molecular Probes	A-11070	1/500
Glycine	Sigma	G8898
Gentamicine	Life Technologies	15710-49	100 μg/ml en 10 μg/ml
Triton X-100	Promega	H5141
PBS	Gibco	20012-019
DMEM	Sigma	D6429
NEAA	Amimed	5-13K00-H
LSM700 Confocal microscoop	Zeiss		beeldvorming gedaan bij 63X
FACS Fortessa	BD technologies		detectie mCherry 610 nm
FACS Fortessa	BD technologies		detectie FITC 530 nm