Aanpassing van de elektrospinproces te bieden drie unieke omgevingen voor een Tri-layered In Vitro Model van de Airway Muur

Samenvatting

Vooruitgang in biomateriaaltechnologieën maakt de ontwikkeling van driedimensionale constructen met meerdere celtypen mogelijk. We hebben electrospinning protocollen ontwikkeld om drie individuele scaffolds te produceren om de belangrijkste structurele cellen van de luchtweg te kweken en zo een 3D in vitro model van de wand van de bronchiolen in de luchtweg te bieden.

Samenvatting

Electrospinning is een zeer aanpasbare methode die poreuze 3D vezelachtige structuren produceert die kunnen worden gebruikt in in vitro celkweek. Aanpassingen aan intrinsieke parameters binnen het proces geven een hoge mate van controle over de kenmerken van de structuur, inclusief vezeldiameter, uitlijning en porositeit. Door structuren te ontwikkelen met vergelijkbare afmetingen en topografieën als orgaan- of weefselspecifieke extracellulaire matrices (ECM), kunnen micro-omgevingen worden gecreëerd die representatief zijn voor de omgevingen waaraan cellen in situ worden blootgesteld.

De wand van de luchtwegbronchiolus, bestaande uit drie belangrijke micro-omgevingen, werd geselecteerd als een modelweefsel. Met behulp van gedecellulariseerd luchtweg-ECM als leidraad, hebben we het niet-afbreekbare polymeer, polyethyleentereftalaat (PET), door middel van drie verschillende protocollen geëlectro-spun om drie individuele geëlectro-spunnen structuren te produceren, geoptimaliseerd voor epitheel-, fibroblast- of gladde spiercelkweek. Met behulp van een commercieel beschikbaar bioreactorsysteem, hebben we de drie celtypen stabiel co-gecultiveerd om een in vitro model van de luchtwegwand te bieden over een langere periode.

Dit model benadrukt het potentieel van dergelijke methoden die worden gebruikt in in vitro diagnostische studies die belangrijke intercellulaire cross-talk-mechanismen onderzoeken of nieuwe farmaceutische doelwitten evalueren, door een relevant platform te bieden om de kweek van volledig gedifferentieerde volwassen cellen binnen 3D, weefselspecifieke omgevingen mogelijk te maken.

Inleiding

Het gebied van regeneratieve geneeskunde en tissue engineering gaat snel, met doorbraken in tracheale en nieren regeneratie twee opmerkelijke recente prestaties. De biomaterialen ontwikkeld in tissue engineering worden steeds toegankelijker, met mogelijkheden om dergelijke protocollen over te dragen aan minder gespecialiseerde laboratoria. Een veld gevuld te profiteren door middel van een toenemend gebruik van biomaterialen in vitro diagnostiek.

In vitro studies zijn een belangrijk platform voor intra-cellulaire signaalwegen binnen enkele cel-types te onderzoeken, en hebben geholpen af te bakenen mechanismen die ten grondslag liggen tal van ziekten pathophysiologies. Deze studies algemeen gebruik gemaakt van een enkele celsoort die wordt gekweekt als een monolaag op weefselkweekkunststof (TCP); een tweedimensionale (2D) stijf oppervlak veel minder elastisch en poreus dan de driedimensionale (3D) omgeving cellen worden blootgesteld aan binnen een weefsel of orgaan. Dierlijke modellen zijn van oudsher employed effecten in vitro ook vertalen naar gehele weefsel te bevestigen en kan ook worden gebruikt als pre-klinische platforms om menselijke ziekten te onderzoeken. Echter, inter-species verschillen ondermijnen deze afhankelijkheid diermodellen in ons begrip van menselijke ziekten ^-. Zo is veel kennis van de longziekte astma basis van een muismodel ondanks inherente verschillen tussen de menselijke conditie en dit model met weinig bewijs van mestcel infiltratie van de gladde spieren bundel luchtwegen of het vermogen tot spontane ziekteontwikkeling in het dier modelleren ^3,4. Er zijn ook ethische overwegingen met betrekking tot het gebruik van dierlijke modellen, met de "3 V's" standaard "vervanging, verfijning en vermindering" in dierproeven worden aangemoedigd in het Verenigd Koninkrijk en andere landen.

Een aantrekkelijk alternatief zou de reprise van menselijk weefsel in vitro creëren structuurs aan het coöperatieve karakter tussen volwassen menselijke celtypes in één apparaat te onderzoeken. Cellen bestaan ​​in 3D multi-cellulaire structuren binnen weefsel, elk binnen een unieke micro-omgeving. Het kweken van cellen op TCP laat alleen de cultuur van celmonolagen, niet kunnen repliceren deze omgeving, of moet de capaciteit voor multi-celcultuur. Biomaterialen vooruitgang biedt de mogelijkheid om zowel natuurlijke en synthetische 3D-platforms voor celcultuur ontwikkelen. Cellen ontdane ECM kan worden gebruikt voor 3D-celkweek bij recellularized met andere celtypen waaronder stamcellen ^1, maar dergelijke protocollen kan ingewikkeld en tijdrovend zijn, door de beschikbaarheid van weefsel beperkt en grotendeels van niet-humane oorsprong. Andere protocollen maken een grotere controle over de cellulaire omgevingen gecreëerd zoals nanoimprinting, ECM afzetting, cellaag technologieën of electrospinning. Electrospinning creëert geweven 3D poreuze matten van vezels met een diameter van nanometer tot micrometer, replicating natuurlijke ECM dimensies. Electrospun steigers worden steeds vaker gebruikt als 3D-cel kweken platforms ^-. Manipulatie van de electrospinning parameters worden ingewikkelde controle scaffold eigenschappen zoals poriëngrootte, vezeldiameter, topografie en uitlijning en oppervlaktechemie. Veranderingen van deze parameters bleken direct beïnvloeden celadhesie en de groei, wanneer cellen werden gekweekt in isolement.

Deze voordelen zijn in het huidige onderzoek werd benut om het kweken van meerdere celtypen maken als een enkele 3D-weefsel constructie, met behulp van de luchtwegen bronchiole als model 3D-weefselstructuur. De bronchiole wand bestaat uit drie gebieden (figuur 1). Het slijmvlies is waar epitheelcellen zitten aan de lucht-vloeistof interface (ALI), die een belangrijke belemmering voor de externe omgeving. Ze bevinden zich op de reticulaire basaal membraan (RBM), een strak compacte ECM bestaat voornamelijk uit collagen IV, perlecans en laminins. De sub-mucosale laag direct onder het slijmvlies, een poreuze regio bestaat uit meerdere soorten cellen, waaronder fibroblasten, myofibroblasten en infiltreren leukocyten onder aandoeningen gevonden. Tenslotte gladde spier bundels wikkel rond de luchtweg in een spiraalvormige wijze, en bestaan ​​uitgelijnde vellen van gladde spieren van de luchtwegen (ASM). Het is relatief contractiel toestand van de gladde spieren dat luchtwegen toonregeling. De tewerkstelling van elektrogesponnen steigers binnen de longen had tot voor kort beperkt tot regeneratieve doeleinden; met een electrospun tracheale vervanging met succes getransplanteerd. Hoewel succesvol, zulke behandelingen zijn beperkt in aantal en zijn gericht op de trachea, gezien de relatief eenvoudige aard van de functie van het weefsel. Beperkte voorbeelden van de luchtwegen modellen die gebruikt worden voor in vitro diagnostiek bestaan, en zijn vooral gericht op gladde spiersamentrekking ^metingen. De niet-toxisch en geenn-afbreekbaar polymeer polyethyleentereftalaat (PET) is eerder electrospun en werd gebruikt in de onderhavige studie scaffolds geproduceerd kan worden opgeslagen gedurende langere tijd te waarborgen zonder afbreuk (waardoor ze worden "off the shelf"), en ook geschikt voor stabiele celcultuur over langere perioden. Eerdere studies van onze groep hebben aangetoond dat het gebruik van drie varianten van een basische electrospinning protocol, drie afzonderlijke PET electrospun scaffolds kan worden geproduceerd om een optimale topografieën van kweken luchtweg epitheelcellen, fibroblasten en gladde spiercellen geïsoleerd ^21,22 en de co-cultuur van de luchtweg voorzien epitheel- en fibroblastcellen ^22. Vezeldiameter bleek grote invloed epitheliale functionaliteit ²² en fiber uitlijning liet toe uitgelijnde vellen van gladde spieren ^21. Deze studies werden onafhankelijk van elkaar onder statische omstandigheden uitgevoerd. In de huidige studie, deze different scaffolds gemaakt met volledig gedifferentieerde volwassen humane cellen werden tezamen gekweekt gedurende een week in ALI in een commercieel verkrijgbaar bioreactor als 3D deel van de luchtwegwand, die een fysiologisch relevante in vitro model van de luchtwegen inter-cellulaire responsen te onderzoeken. Hoewel dit protocol gebruikt de luchtweg bronchiole als modelsysteem zou kunnen worden aangepast als een platform voor de 3D co-cultuur van mucosale eenheden uit andere organen.

Protocol

Primaire gladde spiercellen van niet-astmatische individuen werden geïsoleerd uit bronchiale biopsieën in het Glenfield Hospital (Leicester, UK) zoals eerder beschreven. Het onderzoek werd goedgekeurd door de Leicestershire ethische commissie en de patiënten gaven hun schriftelijke, geïnformeerde toestemming.

1. Electrospinning PET Scaffolds (figuur 2)

1. Bereid een oplossing (10 ml) drank bottle grade PET in een 1: 1 dichloormethaan (DCMro) - trifluorazijnzuur (TFA) oplossing. PET concentratie van 8%, 30% en 10% gewicht / volume (wt / vol) vereist voor nanovezels, microfiber respectievelijk uitgelijnd scaffolds en roer de oplossing O / N bij kamertemperatuur gedurende de PET te lossen.
2. Breng de PET-oplossing in een spuit en bevestig een 23-G (voor nanovezel) of een 18-G (voor microfiber en uitgelijnd) naald op de spuit en plaats de spuit in een gemotoriseerde injectiepomp. Zorg ervoor dat de punt van de naald wordt geroteerd naar de bodem.
3. Plaats de mandrel 15 cm vanaf de punt van de naald, waardoor de naald gericht op het midden van de trommel.
4. Sluit de stroomtoevoer naar de naald met krokodil clips en aard de doorn (via banaan bus) naar de aarde. Schakel de stroom naar de doorn en ingestelde snelheid op 60 opm (overeenkomend met ongeveer 13,2 m · min ^-1) voor nanovezels en microfiber steigers. Ingestelde snelheid tot 2000 rpm (gelijk aan ongeveer 440 m · min ^-1) voor uitgelijnd steigers.
5. Stel de spuit pomp naar een stroomsnelheid van 0,5 ml · hr ^-1 voor nanovezel willekeurige en uitgelijnd steigers of 2,0 ml · hr ^-1 voor microfiber steigers. Laat de pomp lopen tot oplossing wordt geëxtrudeerd uit de naaldpunt om eventuele lucht in de naald te verwijderen. Stop dan de pomp.
6. Op de spuitpomp Stel het totale volume van de oplossing verwijderd naar 2 ml en start de pomp.
7. Set voedingsspanning tot 14 kV, en schakel de stroom Supply.
8. Electrospin tot 2 ml van de oplossing is electrospun (4 uur voor nanovezel en uitgelijnd steigers, 1 uur voor microfiber steigers).
9. Snijd het schavot met een mes over de breedte van de doorn. Dit levert een 2D vel scaffold de omvang van de doorn oppervlak (in dit geval een rechthoekige plaat 22 cm x 11 cm) die zorgvuldig kan worden afgepeld van de doorn). Bewaar de steiger in aluminiumfolie om elektrostatische lading te verminderen).
   Opmerking: Bifasische steigers worden geproduceerd door opeenvolgende elektrospinnen een nanovezel steiger direct op een microfiber schavot.

2. Sterilisatie van steigers voor het gebruik in celcultuur

1. Vanaf het schavot vel, punch-out schijven van bifasisch of uitgelijnd steigers met behulp van een 0,8 mm diameter biopsie pen en vasthouden aan pakking met behulp van niet-giftige lijm aquarium.
2. Steriliseer draagstructuren via ultraviolette bestraling gedurende 30 minuten aan elke zijde van de steigers voor het weken in een 20% Vol / vol antibiotische / antimycotische oplossing (2x10 ml ^{-1 5} eenheden penicilline G, 2000 mg ^-1 ml streptomycine sulfaat en 500 ug ^-1 ml amfotericine B) O / N bij 4 ° C.
3. Was steigers met PBS 3 keer en bewaar scaffolds TCP putjes in PBS bij 4 ° C tot gebruik.

3. Cell Culture Media bestanddelen

1. Culture CALU3 epitheelcellen in DMEM-F12 medium aangevuld met 10% v / v foetaal kalfsserum (FCS), 2 nM L-glutamine-oplossing, 1% vol / vol antibiotische / antimycotische oplossing (10.000 eenheden ^-1 ml penicilline G, 100 mg ^-1 ml streptomycine sulfaat en 25 ug ml ^-1 amfotericine B).
2. Culture MRC5 fibroblastcellen en gladde spiercellen in DMEM medium aangevuld met 10% v / v foetaal kalfsserum (FCS), 2 nM L-glutamine-oplossing, 1% vol / vol antibiotische / antimycotische oplossing (10.000 eenheden ^-1 ml penicilline G, 100 mg ml ^-1 streptomycine sulfaat en 25 ug ml ^-1 amfotericine B).
3. Cultuur epitheliale-fibroblast-ASM cel co-culturen in een 70:30 DMEM-F12: DMEM media mengsel.

4. Zaaien van Fibroblast en epitheelcellen op Bifasisch Steiger

1. In een weefselkweekplaat Week de steigers in DMEM gesupplementeerd media en incuberen bij 37 ° C gedurende 1 uur voor het zaaien van cellen.
2. Verwijder de DMEM-aangevuld media, plaatst de microfiber fase van steiger apicaal en zaad 1.5 x10 ⁴ MRC5 fibroblast cellen in 30 ul DMEM-aangevuld media. Schud plaat op een orbitale schudder gedurende 2 uur, voordat hij in een incubator bij 37 ° C 5% _CO2 in lucht O / N.
3. Draai het schavot om zodat de nanovezel fase van steiger gezichten apicaal, zaad 3.0 x10 ⁴ CALU3 epitheelcellen in 30 ul DMEM-F12 aangevuld media op de nanovezel fase van het schavot en incubeer for 2 uur bij 37 ° C, 5% _CO2 in lucht voordat dompelen het skelet in 70:30 DMEM-F12: DMEM-medium gesupplementeerd O / N voorafgaand aan overdracht aan de bioreactor.

5. Het zaaien van ASM Cells op de Aligned Steiger

1. In een weefselkweekplaat Week de steigers in DMEM-aangevuld medium en incubeer gedurende 1 uur bij 37 ° C voor het zaaien 2,5 x10 ⁴ cellen in 30 ui DMEM-aangevuld medium en incubatie gedurende 2 uur (37 ° C, 5% CO ₂ in de lucht). Dompel steiger in DMEM-aangevuld media terugkeer naar de incubator en laat O / N voor het opzetten van een tri-cultuur in de bioreactor.

6. Oprichting van de Tri-cultuur met behulp van het bioreactorsysteem (figuur 7)

1. Plaats de bifasische schavot pakking in de groef binnen één kamer met de epitheliale fase naar boven in de kamer.
2. Plaats de uitgelijnde scaffold onder de bifasische scaffold (zodat het grenst aan de microfiber fase van de tweefasige steiger) en vergrendel de twee kamers van de bioreactor elkaar.
3. Monteer twee perfusie stroom circuits verbonden met twee reservoirs medium (DMEM-F12-aangevuld medium in apicale reservoir, DMEM-F12 / DMEM-aangevuld medium in basale reservoir) en pomp media rond de twee circuits bij ongeveer 0,1 ml / min onder toepassing van een peristaltische pomp (40 ml medium wordt gerecirculeerd door elk circuit). House alle onderdelen van het stelsel in een incubator bij 37 ° C, 5% _CO2 in lucht.
4. Na een week, verwijder de media uit de apicale kamer, en de cultuur van de epitheelcellen in het ALI voor een verdere week voor analyse.

Resultaten

Scanning elektronenmicroscoop beelden van gedecellulariseerde luchtwegen weefsel of immunohistologische beelden van de luchtwegen biopsies geïdentificeerd gewenste kenmerken van de luchtweg ECM we willen introduceren in electrospun schavot topografieën: Native RBM matrix bestaat uit vezels ongeveer 153 nm ± 30,6 nm (gemiddelde ± SD n = 50 metingen ) in diameter (figuur 3A en 5A), terwijl de matrix rond de RGB was poreus van aard (figuur 3C). Immunohistologische doorsneden door gladde spierbundels zien ASM aanwezig als uitgelijnde vellen cellen ²¹ (figuur 3E). Deze informatie werd gebruikt om gids kenmerken ingebracht in de electrospun steigers. Een roterende mandrel is kan stabiel draait met hoge snelheid (> 2000 rpm / 440 m · min ^-1) tot scaffolds met uitgelijnde vezels te produceren. Slow doorn rotatie (60 tpm 13,2 m · min ^-1) geen invloed op de vezel oriëntatie, Maar produceerde steigers met meer uniforme dikte dan wanneer electrospinning op een statisch bord. Door het veranderen van het elektrospinnen parameters (PET concentratie en vloeistoftoevoer rate), was het mogelijk om steigers vezels met een diameter van enkele micrometers en honderden nanometers maken (elektrospinnen parameters worden vermeld in Tabel 1).

Electrospun vezels met een equivalente vezeldiameter van natuurlijke RBM vezels (150 nm) werden vervaardigd onder toepassing van een 6% PET-oplossing, maar bij zulke lage concentraties PET, kralen van de vezels plaatsvond (Figuur 4A). Dit werd geëlimineerd door de concentratie van de PET oplossing 8% dat uniform nanovezels geproduceerd bezitten een gemiddelde diameter van 255 nm ± 2,4 nm (gemiddelde ± SEM) en de gemiddelde poriëngrootte van 1,43 pm ± 0,02 pm (figuur 4B, 5A en B). Om nanovezels electrospin was het nodig om de naald grootte van 18 G te beperken tot 23 G, waardoor tragere debieten whilst behoud van een hogere stroomsnelheid en het verminderen van de naald blokkade, een terugkerend probleem met de grotere naald. Bij electrospinning microvezels, een toename van PET oplossing tot> 30% PET leiden tot een gebrek aan uniformiteit in vezeldiameter (figuur 4F) naast meerdere blokkades bij de naaldpunt door de hoge oplossingsviscositeit. Uniform microfiber mats bezitten een gemiddelde vezeldiameter van 2,50 pm ± 0,02 pm (gemiddelde ± SEM) en de gemiddelde poriëngrootte van 10,45 pm ± 0,13 pm werden geproduceerd wanneer elektrospinnen een 30% gew / vol PET oplossing bij een stroomsnelheid van 2 ml / h ^-1 (Figuur 4F, 5A en B). Sequential electrospinning van de nanovezel steiger direct op een microfiber scaffold (nog aan de doorn) creëerde een tweefasen steiger (Figuur 3D). De gemiddelde vezeldiameter was 280 nm respectievelijk ± 20 nm en 2,30 pm ± 0,06 pm voor de nanovezel en microfiber fasenvergelijkbaar met afmetingen van afzonderlijke nanovezels en microfiber steigers. Bovendien is de dikte van de bifasische scaffold was vergelijkbaar met de som van de individuele nanovezels en microfiber scaffolds (figuur 5C). Door het verhogen van de doorn toerental (2.000 rpm / 440 m · min ^-1), zeer gericht nano- of microfiber steigers werden geproduceerd. De 8% gew / vol PET oplossing niet optimaal voor de productie lijn nanovezels en produceerde vezels bezitten een golfvormige morfologie (figuur 3F). Een toename tot 10% PET vernietigd Daartoe maar resulteerde in een gereduceerde diameter vezel (216 nm ± 2,2 nm (gemiddelde ± SEM)) in vergelijking met de willekeurig uitgelijnd nanovezel scaffolds. Fiber uitlijning werd berekend door het bepalen van de afwijking van de hoek elke vezel van het gemiddelde vezelhoek. In lijn nanovezel steigers 79% van de vezels werden afgestemd (± 10 ° gemiddelde fiber hoek) in vergelijking met 10,2% van de vezels in willekeurig uitgelijnd nanovezel scaffjarigen (figuur 5D).

De 8% nanovezels scaffold werd gebruikt voor het ringbandmechanisme waarop epitheelcellen bevinden herhalen, en werd gebruikt voor de kweek van cellen CALU3 (luchtweg epitheel cellijn) ondersteunen. De 30% w / v microfiber scaffold, die meer poreus van aard werd gebruikt om de sub-mucosale regio nabootsen en gekweekt met MRC5 cellen (luchtweg fibroblast cellijn). De 10% gew / vol uitgelijnd nanovezel steiger voorzien topologische verwijzingen naar ASM cel uitlijning te garanderen wanneer gekweekt op het schavot. Alle drie celtypen werd een verhoogde levensvatbaarheid indien gekweekt op hun individuele stellages gedurende 2 weken (figuur 6A), en expressie celtype-specifieke eiwitten na 2 weken kweekperiode (figuur 6B, 6C en 6D). Verdere karakterisatie van individuele cel-scaffold interacties zijn elders vermeld ^21,. De sequentiële electrospinning van de nanovezel steigerop de microvezel scaffold produceerde een bifasische matrix voor de co-cultuur van de CALU3 epitheelcellen en MRC5 fibroblastcellen op de nanovezel en microfiber fase resp. Het kweken van de twee cellen samen onder statische omstandigheden elders is ²² gerapporteerd. Verder onderzoek probeert andere cellagen tweefasige kweek tijden na 2 weken toevoegen of verlengen onder statische omstandigheden niet gelukt (data niet getoond). Om cultuur een tri-gelaagd model over een langere periode, gebruikten we een perfusie stroom bioreactor. De CALU3 en MRC5-cellen werden gezaaid op het bifasisch scaffold en gladde spiercellen gezaaid op een uitgelijnde scaffold, en beiden werden afzonderlijk gekweekt gedurende 2 dagen. De twee scaffolds werden dan samen gekocht om een tri-lagenmodel van het luchtwegwand binnen de bioreactor te vormen (figuur 7). Beide kamers werden geperfuseerd met media gedurende 7 dagen vóór de apicale epithele kamer had een medium verwijderd en de epitheelcellen werden gekweekt opALI voor een verdere 7 dagen. Steigers werden vastgesteld en ofwel doorgesneden en gekleurd, of hele steigers werden immunostained voor mobiele-specifieke markers. Secties door de drielaags kweek toonde celkernen verdeeld over de drie lagen van de co-cultuur (Figuur 8B). Wanneer cellen werden immunologisch gekleurd voor celspecifieke markers, epitheelcellen bevolkt de apicale nanovezel fase als een confluente laag cellen en gekleurd positief voor cytokeratine (Figuur 8C) op microfiber fase fibroblasten gekleurd positief voor S100A4 (Figuur 8D) en de uitgelijnde 10% scaffold ASM cellen gekleurd positief voor SM22α (figuur 8E), wat aangeeft goede overleving van elk celtype in het 3D-model van de luchtwegen muur.

Figuur 1. De luchtwegen bronchiole. Bronchiale biopsie van een ernstigeastmatische luchtwegen toont het epitheel van de reticulaire basale membraan (REM), waarbij de onderliggende submucosale regio bevolkt met mesenchymale cellen en de omringende gladde spier bundels bevolkt met gladde spiercellen gekleurd voor gladde spier alfa actine (bruin). Schaal balk geeft 200 pm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2. Een schematische weergave van de electrospinning materiaal. Een spuit die het polymeer / oplosmiddel-oplossing (met naald) geplaatst op een injectiepomp tegenover de doorn. Een elektrische potentiaal wordt vastgesteld tussen de naald en de doorn waardoor vezels worden uitgeworpen uit de naaldpunt en afgezet op de roterende mandrel. Aangezien de vezel passeert de atmosfeer,het oplosmiddel verdampt waardoor afzetting van polymeer vezels op de doorn. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3. Vergelijking van electrospun scaffolds met natief ECM luchtwegen. Scanning elektronenmicroscoop afbeeldingen ontcelde basaal membraan (A), gedecellulariseerde luchtwegen bronchiole dwarsdoorsnede (C) en een histologische sectie van de luchtweg gladde spier bundel (gekleurd met hematoxyline en eosine, omvang bar 40 micrometer) (E), vergeleken met nanovezel (B) bifasisch (D) en lijn (F) PET steigers. Klik hier om te bekijkeneen grotere versie van deze figuur.

Tabel 1. Parameters gebruikt voor electrospinning de microfiber, nanovezel en individueel als voor de bifasische steiger uitgelijnd steigers.

Figuur 4. Verandering in PET concentraties beïnvloedt vezeleigenschappen. Scanning elektronenmicroscoop afbeeldingen elektrogesponnen scaffolds gesponnen 6%, 8%, 10% (AC), 25%, 30% en 35% (EG) (wt / vol) PET oplossingen . Ook getoond worden uitgelijnd steigers geproduceerd uit 8% (D) en 30% (H) wt / vol PET-oplossingen. AD afgebeeld op 5,000X vergroting, EH afgebeeld bij 1000x vergroting. Klik hier voor een grotere weergaveversie van deze figuur.

Figuur 5. Eigenschappen van elektrogesponnen PET steigers. (A) Distributie krommen die de distributie vezeldiameter van de reticulaire basaal membraan extracellulaire matrix (RBM ECM), willekeurig uitgelijnd nano- en micro-fiber steigers en de uitgelijnde nanovezel schavot. (B) Histogram die de relatieve poriegrootteverdeling in nano- en microvezel scaffolds. (C) De gemiddelde dikte van de nanovezel, microfiber, bifasische en uitgelijnd scaffolds (gemiddelde ± standaardafwijking, n = 6). (D) Histogram grafiek die de afwijking van de gemiddelde oriëntatie vezel in willekeurige of uitgelijnde nanovezel steigers Steiger vezelanalyse werd uitgevoerd met ImageJ software. Please klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 6. De cultuur van de verschillende celtypen van het individu steigers. (A) AlamarBlue cellevensvatbaarheid testresultaten van gladde spiercellen op lijn steigers, CALU3 cellen op nanovezels steigers en MRC5 cellen op microfiber scaffolds (gemiddelde ± SEM, n = 3- 20). Scanning elektronenmicroscoop afbeeldingen van de nanovezel, microfiber en uitgelijnde vezels scaffolds (B, C en D respectievelijk) en immunofluorescente afbeeldingen CALU3 cellen gekleurd voor E-cadherine (red), MRC5 cellen gekleurd voor vinculin (rood) en ASM cellen gekleurd voor SM22α (red) allen op hun speciale scaffold (E, F en G, respectievelijk). Hoechst werd gebruikt om de kernen (blauw) vlek, schaal balk geeft 40 &# 181; m. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 7. perfusie systeem voor tri-layer luchtwegen wandmodel. (A) Foto van bioreactorvat verbonden peristaltische pomp en 2x media reservoirs. (B) Schematische voorstelling van de tri-layered steigers. (C) Schematische weergave van de twee bioreactor circuits wanneer de luchtweg model wordt gehouden in de lucht-vloeistof-interface. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 8. Complete 3D luchtwegen wandmodel. (A) bronchiale biopsie van de luchtwegen muur met de mucosale laag in het rood, de submucosale regio groen gemarkeerd, en de gladde spieren bundel benadrukt in goud. (B) Sectie door middel van tri-gelaagd luchtwegen muur bestaat uit twee fasen en uitgelijnd steigers bevolkt met epitheel, fibroblasten en glad na 2 weken coculture vaste spiercellen. Celkernen werden gekleurd met DAPI (blauw) met steiger reflectie (grijs) gelijktijdig afgebeeld. Scaffolds werden gefixeerd en immunologisch gekleurd voor celspecifieke markers na 2 weken, met CALU3 cellen gekleurd voor cytokeratine (groen) (C), MRC5 cellen gekleurd voor S100A4 (groen) (D), en gladde spiercellen gekleurd voor SM22α (red) ( E). Schaal balk geeft 200 pm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Tabel 1.

Discussie

Het vermogen om polymere vezels structurele eigenschappen die vergelijkbaar zijn met natuurlijke ECM electrospin heeft geleid tot talrijke natuurlijke of synthetische polymeren of polymeermengsels die electrospun soort ruimten ^herscheppen. Manipulatie van de procesparameters (inclusief polymeer keuze, polymeer concentratie, oplosmiddel naaldtip afstand en temperatuur) kunnen allemaal invloed schavot kenmerken; maar sommige parameters kunnen grotere impact op steiger eigenschappen dan de andere ^{25 hebben.} Bij het aanpassen van PET vezeldiameter, vonden we de sleutelparameters voor de concentratie van het toegepaste polymeer, de snelheid waarmee de polymeeroplossing was elektrogesponnen, en de diameter van de naald zijn. Wanneer elektrospinnen uitgelijnd vezels de sleutelparameters de collectie methode (een draaiende as), en de snelheid van de spil roteert. Door het verminderen van de doorn snelheid tot 60 rpm, vonden we de willekeurig uitgelijnd steigers geproduceerd toonde grotere steiger uniconformiteit ten opzichte van electrospinning op een vlakke collector plaat.

De kenmerken van gedecellulariseerde luchtwegen weefsel werden geanalyseerd om aanwijzingen te geven voor de diverse steiger topografieën ontwikkeld voor de cultuur van elke luchtweg celtype. Electrospun nanovezels een aantrekkelijke scaffold basaalmembraan structuren vanwege de kleine poriegrootte, maar hoge totale poreusheid die zorgt voor een grotere vraag metaboliet terwijl beperking cellulair verkeer repliceren. ⁹ Terwijl optimale electrospinning parameters, diverse PET concentraties en stroomsnelheden werden getest. De dunste vezels werden bereikt onder toepassing van een 6% gew / vol PET -oplossing, andere groepen gebruikt. Echter, een hoge mate van kralen, en een gebrek aan uniformiteit waren voortdurende problemen. Aanvankelijke pogingen om de kralen te verwijderen inclusief het toevoegen van een kationisch oppervlakte, cetyltrimethylammoniumbromide (CTAB), aan de oplossing van de oppervlaktespanning verlagen en testen van diverse bronnenPET. De toevoeging van surfactant verminderde de hoeveelheid beading, maar niet volledig. Na het uitproberen van een aantal commerciële bronnen van PET pellets, werd food grade drank fles PET gebruikt, door snijden drankflessen en het oplossen van deze in de DCM: TFA oplosmiddel oplossing. Met dit als de PET bron resulteerde in een toename vezel uniformiteit en vermindering van vezel beading. Door verhogen van de concentratie van de oplossing lichtjes tot 8% w / v en het reduceren van de diameter naald (18G tot 23G) we consequent geproduceerd foutvrij nanovezels met een vezeldiameter van ongeveer 250 nm. Electrospun nanovezels scaffolds kan zeer elektrostatische bij het afhalen van de doorn making hanteren van de steigers moeilijk. Dit werd verbeterd door het opslaan van de steigers aluminiumfolie na het spinnen en het weken in 70% IMS voor gebruik. Dit leek te helpen verdrijven van de resterende elektrostatische lading links op de steiger van de elektrospinproces.

Om boven te biedenographies vergelijkbaar met de individuele micro-omgevingen waarmee de drie belangrijkste luchtwegen celtypen binnen de luchtwegen muur, een basis electrospinning protocol werd aangepast aan drie unieke steigers voor deze celtypen te produceren: door elektrospinnen een lage concentratie PET-oplossing langzaam, werden willekeurig afgestemd nanovezels gegenereerd, waarop epitheliale cellen werden geënt (het nabootsen van de RBM). Door elektrospinnen een hogere concentratie PET oplossing sneller, werden willekeurig uitgelijnd microvezels verkregen (een min poreus scaffold), waarin fibroblasten werden gezaaid (nabootsen van de sub-mucosale gebied direct onder de REM). Door elektrospinnen lage concentratie PET oplossing op een hoge snelheid roterende mandrel uitgelijnd nanovezels geproduceerd, waarop gladde spiercellen georiënteerd in de vezelrichting, produceren uitgelijnde vellen van cellen.

Verhoogde vezeldiameters leiden tot een verhoogde poriën, waardoor een grotere cel penetration in de steigers en zo bijdragen aan het creëren van een echte ^3D-omgeving. Microfiber scaffolds werden gebruikt voor het kweken van fibroblasten in het onderzoek dat de cellen verbleven op meerdere vlakken binnen de scaffold. Door verhogen van de PET concentratie 30% gew / vol, werden PET vezels met een gemiddelde diameter van 2,5 urn vervaardigd. Vezels grotere diameter (≈ 4 pm) werden vervaardigd onder toepassing van een 35% gew / vol oplossing PET, maar scaffold dikte uniformiteit was verloren en hogere variabiliteit tussen individuele vezels duidelijk. Poriën in de microfiber steiger waren meer dan 7 keer groter dan die gemeten in de nanovezel steigers (10.45 pm vs respectievelijk 1,43 pm), maar nog steeds statische zaaien van cellen voorzien beperkte cellulaire penetratie. Dit werd verbeterd door het dynamisch zaaien de cellen met behulp van een orbitale menger, een eerder aangetoond effectief methode.

Zeer gericht nanovezel steigers zijn gemaakt door elektrospinnen een 10%wt / vol PET oplossing op de doorn roteert met 2000 rpm (≈ 440 m · min ^-1). De PET-concentratie werd verhoogd van 8% tot een onregelmatige golfachtige morfologie die vezels vertoonden bij lagere concentraties te voorkomen. Ondanks de toegenomen concentratie uitlijnen van de vezels verminderde de gemiddelde vezeldikte (216 nm versus 255 nm, uitgelijnd ten opzichte random). De hoge snelheid van de doorn trekken van de vezels voordat zij gedroogd waarschijnlijk dit effect veroorzaken. De uitlijning van de vezels beïnvloed de afstemming van gladde spiercellen en heeft ook andere fysiologische effecten op de gladde spiercellen die elders ²¹ zijn gekarakteriseerd.

De belangrijkste beperking van dit protocol is het onvermogen om het levende cellen op / in de steigers maken initiële cel-gehechtheid of differentiatie over een langere periode niet mogelijk om vast te stellen zonder in te boeten monsters. Dit betekent dat de meeste optimalisatie optreedt na de kweekperiode, dat wil zeggen, op te lossening samples en vervolgens meten of celkweek succesvol was na niet tijdens de celcultuur. Observeren van een kleurverandering in steigers geïncubeerd in AlamarBlue (blauw naar roze) geeft cellen aanwezig en levensvatbaar zijn, maar is niet ideaal. Elektrospinning transparanter polymeren zoals gelatine kunnen helpen bij het visualiseren van cellen op de steigers. The electrospinning van nanofibrous scaffold in ons model kon de replicatie van de luchtweg RBM, eveneens bestaande uit dichte nanovezels waarop de epitheliale cellen bevinden. Eerder is aangetoond dat structurele cellen niet kunnen migreren door de nanovezel stellage ^22, alhoewel immune cellen kunnen (gegevens niet getoond). Hoewel voordelig voor het kweken van specifieke celtypen op een 3D-oppervlak (bijvoorbeeld epitheliale en endotheliale cellen), deze voorkomen van structurele celmigratie door nanovezels kunnen schadelijk voor het kweken van andere celtypen. Omdat gladde spieren kan niet migreren door the uitgelijnd nanovezel steiger we samengesteld de tri-gelaagde coculture met de gladde spieren en fibroblast lagen tegenover elkaar (in tegenstelling tot de uitgelijnde steiger tussen de twee soorten cellen). Hoewel dit stelt de cellen in dichte appositie, kan de huidige studie niet vaststellen of een celtype (ofwel de fibroblasten of gladde spier) de hele laag zou halen gedurende een verlengde kweekperiode. Ondanks deze beperkingen is een levensvatbare drielaags model van de luchtwegwand ontwikkeld die een alternatief platform verschaft om de interacties tussen de verschillende celtypen te onderzoeken. Eenzelfde tri-layered onderzoek is onlangs gepubliceerd waarin fibroblasten ingebed in een cilindrisch collageen I hydrogel gladde spieren gezaaid op het buitenoppervlak en epitheelcellen binnen het luminale oppervlak ^17. De mechanische stabiliteit van de electrospun scaffolds hier ontwikkeld zou vergelijkbaar buisvormige constructen mogelijk te vormen, en blijft een stroom research doel binnen onze groep. Hoewel het onderzoek zich gericht op de luchtwegen, verschillende organen in het lichaam deel deze fundamentele mucosale structuureenheid, en door modificeren van de huurders die in deze studie kan laadborden worden ontwikkeld weefsel dat een basaalmembraan eenheid met bloedvaten, de blaas en de cornea, waarbij collageen gebaseerde multi-layered modellen zijn gebruikt.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Polyethyleentereftalaat (PET)	Lucozade (GSK) flessen	N/A	Bron van PET voor elektrospinning. In kleine stukken snijden en naar behoefte afwegen
Dichloormethaan (DCM)			Oplosmiddel voor PET
Trifluorazijnzuur (TFA)	Sigma		Oplosmiddel voor PET
Roterende mandrel	In huis gebouwd		Wordt gebruikt om elektrogesponnen vezels te verzamelen. Door met verschillende snelheden te draaien, kunnen vezels worden uitgelijnd of willekeurig gepositioneerd
Spuitpomp	Harvard apparaat		Wordt gebruikt in het elektrospinproces
DMEM-F12	Gibco		Kweekmedium voor CALU3-cellen
DMEM	Gibco		Kweekmedium voor HASM-cellen
MEM	Gibco		Kweekmedium voor MRC5-cellen
Antibioticum/ antimycotisch oplossing	Gibco		Mediasupplement
FCS	Gibco		Mediasupplement
Orbitale mixer (Orbitale schud 503)	Stuart Scientific		Voor dynamisch zaaien van cellen op microvezelschalen
Peristaltiek Pomp	Watson Marlow		Voor mediastroom door bioreactor
3DKube	Kiyatec		Bioreactor voor 3D-celcultuur