Observatie van de Ciliaire Beweging van Choroid Plexus epitheelcellen Ex Vivo

Samenvatting

In dit onderzoek werd een gedetailleerde lichtmicroscopische techniek geoptimaliseerd voor real-time observatie en analyse van de beweging van CPEC cilia ex vivo samen met een elektronenmicroscopische methode voor ultrastructurele analyse.

Samenvatting

De choroïdale plexus bevindt zich in de ventrikelwand van de hersenen, waarvan de belangrijkste functie wordt geacht de productie van hersenvocht te zijn. Epitheelcellen van de choroïdale plexus (CPEC's) die het oppervlak van het choroïdale plexusweefsel bedekken, herbergen meerdere unieke trilharen, maar de meeste functies van deze trilharen moeten nog worden onderzocht. Om de functie van CPEC-trilhaartjes te ontdekken, met bijzondere aandacht voor hun beweeglijkheid, werd een ex vivo observatiesysteem ontwikkeld om de trilhaarbeweeglijkheid tijdens embryonale, perinatale en postnataal perioden te monitoren. De choroïdale plexus werd uit de hersenventrikel gedissecteerd en onderzocht onder een video-verbeterde contrastmicroscoop, uitgerust met differentieel interferentiecontrast-optica. Onder deze omstandigheden werd een eenvoudige en kwantitatieve methode ontwikkeld om de beweeglijkheidsprofielen van CPEC-trilhaartjes gedurende enkele uren ex vivo te analyseren. Vervolgens werden de morfologische veranderingen van trilharen tijdens de ontwikkeling waargenomen door middel van rasterelektronenmicroscopie om de relatie tussen de morfologische rijpheid van trilharen en beweeglijkheid te verduidelijken. Interessant is dat deze methode veranderingen in het aantal en de lengte van trilharen kon bepalen, die op postnataal dag (P) 2 een piek bereikten, terwijl de slagfrequentie een maximum bereikte op P10, gevolgd door abrupte stopzetting op P14. Deze technieken zullen de verheldering van de functies van trilharen in verschillende weefsels mogelijk maken. Hoewel verwante technieken in een eerder rapport zijn gepubliceerd¹, richt de huidige studie zich op gedetailleerde technieken om de beweeglijkheid en morfologie van CPEC-trilhaartjes ex vivo te observeren.

Inleiding

Cilia zijn haarachtige uitsteeksels op het oppervlak van de meeste gewervelde cellen, die de aandacht hebben getrokken van medische onderzoekers vanwege een klasse ziekten die ciliopathieën worden genoemd^2–4. Ondanks de alomtegenwoordigheid van het orgaan, is er een grote verscheidenheid aan ciliaire functies gerapporteerd, waaronder beweeglijkheid en biosensing. Bijvoorbeeld, beweeglijke cilia op het mucoepitheliale oppervlak transporteren slijm⁵ en epitheelresten naar de uitgang van tractussen, waardoor ziekte wordt voorkomen door het oppervlak van epitheel te reinigen. Bovendien, tijdens vroege ontwikkelingsperioden en embryonale stadia, reguleren cilia de proliferatie van stamcellen⁶ en zijn betrokken bij de bepaling van de links-rechts asymmetrie van het gewervelde lichaam⁷.

Choroid plexus epitheelcellen (CPEC's) zijn derivaten van neuroepitheliale cellen die het oppervlak van het choroïde plexusweefsel in de hersenen bedekken, die belangrijke rollen spelen bij het handhaven van de homeostase van de intracraniale omgeving door productie van hersenvocht (CSF). Het is eerder aangetoond dat CPEC's meerdere niet-beweeglijke cilia hebben die de productie van CSF reguleren via G-proteïnegekoppelde receptoren die specifiek geconcentreerd zijn op de cilia⁸. Hoewel deze cilia als rustige niet-beweeglijke cilia werden beschouwd, werd ontdekt dat sommige CPEC-cilia een voorbijgaande beweeglijkheid vertonen tijdens de neonatale periode¹. Deze bevinding was belangrijk omdat het aantoonde dat zogenaamde niet-beweeglijke cilia niet noodzakelijkerwijs onbeweeglijk zijn vanaf het begin van de ontwikkeling en mogelijk een voorbijgaande beweeglijkheid tijdens specifieke tijdsvensters kunnen vertonen, mogelijk als reactie op specifieke fysiologische eisen en functies⁹. Om de beweeglijke aard van CPEC-cilia precies te beschrijven, is het noodzakelijk om een ex vivo observatiesysteem te ontwikkelen dat de analyse van de kinetische profielen die uniek zijn voor CPEC-cilia omvat.

Met betrekking tot beweeglijkheid, hoewel verschillende technische rapporten observaties van de beweeglijke cilia van het tracheaal epitheel^5,10, beweeglijke enkelcellige flagellen¹¹, zogenaamde conventionele beweeglijke cilia¹² en nodal cilia¹³ hebben beschreven, zijn gedetailleerde analytische methoden die toepasbaar zijn op relatief onregelmatige structuren zoals het choroïde plexus tot nu toe niet goed gedocumenteerd. Bovendien is een hoge tijdresolutie vereist om de ciliaire beweging van CPEC's te analyseren, waarbij dure hogesnelheidscamera's onmisbaar zijn. Om deze noodzaak te omzeilen en het monitoren van de ciliaire beweeglijkheid van verschillende celtypen te vereenvoudigen, is een goedkope, hogesnelheidscamera geïntroduceerd en is een gemakkelijk toegankelijke en handige methode ontwikkeld om de beweeglijkheid van beweeglijke cilia op te nemen, met name om de snelheid en het bewegingspatroon van elk cilium te beschrijven¹. Bovendien is originele beeldanalysesoftware "TI Workbench" hier gebruikt om gedetailleerde analyse van de beweeglijkheid te vergemakkelijken. Gezamenlijk biedt deze methode een nieuwe beknopte strategie om ciliaire beweging te analyseren samen met correlatieve scanning elektronenmicroscopie (SEM), die kan worden toegepast in een breed scala van ciliumonderzoek.

Protocol

De protocollen en het gebruik van proefdieren werden goedgekeurd door de institutionele dierlijke zorg en gebruik van commissies aan de Universiteit van Yamanashi en Waseda University. Dierverzorging werd uitgevoerd volgens institutionele richtlijnen.

1. CPEC Voorbereiding

1. Bereid de volgende inrichtingen en materialen: een stereomicroscoop, bij voorkeur kunnen overbrengen verlichting van onderen; een paar van horlogemaker pincet (Dumont # 3 en # 4), vlam gesteriliseerd, rechte operationele schaar, vlam gesteriliseerd; twee steriele 10 cm plastic schaaltjes met 20 ml ijskoude Leibovitz L-15-medium; 35 mm glazen bodem gerechten met 2 ml RT Leibovitz L-15-medium; een bekerglas van 100 ml bevattende 70% ethanol; neonatale muis pups.
2. Kort dompelen een neonatale muis in 70% ethanol en snel euthanaseren door onthoofding met de operationele schaar.
3. Plaats de kop onmiddellijk in ijskoude Leibovitz L-15 medium in steriele 10 cm dish.
4. Verwijder het vel van de calvaria met het paar horlogemaker tang, opengesneden de schedel naar de hersenen bloot te leggen, en dan snijd de hersenzenuwen om de hele hersenen te isoleren.
5. Breng de hersenen om een ​​nieuwe schotel met ijskoude Leibovitz L-15-medium en observeren onder de stereo-microscoop, om ervoor te zorgen dat de hersenen volledig is ondergedompeld in het medium.
6. Stel het dorsale aspect van de hersenen naar boven en oriënteren de hersenen, zodat de olfactorische bollen wonen op de drie uur positie (voor rechtshandige personen). Houd de hersenen voorzichtig met de tang in de linkerhand.
7. Met behulp van de fijne dissectie pincet (Dumont # 3 en # 4) in de rechterhand, snijd het corpus callosum en onder de parenchym aansluiten van de hersenhelften, langs de longitudinale spleet van de grote hersenen.
8. Duw de hersenhelften weg aan de zijkanten en de dwarse cerebrale spleet bloot te leggen.
9. Scheid de hersenhelften door knijpen uit the parenchym tussen de halve bol en thalamus.
10. Trek de laterale ventriculaire choroid plexus, dat aan de zijkant van de hippocampus wordt bevestigd door de lamina affixa.
11. Breng de geïsoleerde choroid plexus naar de 35 mm glazen onderste schaal met vers Leibovitz L-15 medium, en overtrek gewicht (Materials List) langzaam aan het weefsel op zijn plaats.

2. Live-Imaging van CPEC Cilia

1. Bevestig juiste ultraviolet (UV) en afgeleid (IR) cut filter (s) te blokkeren licht korter dan 400 nm en langer dan 700 nm, en dat neutrale dichtheid (ND) filters (25% en 6%) worden in het lichtpad geplaatst van de geïnverteerde microscoop.
2. Pas de scherpstelling van het objectief ruwweg op het oog, en pas vervolgens de condensor, zodat het centrum en de focus te voldoen aan de Köhler verlichting. Plaats een passende differentiële interferentie contrast (DIC) prisma, een DIC element, evenals analyzer polarisator elementen in de liGHT weg om te voldoen aan de DIC optiek.
3. Pas het contrast gezien door het prisma positie DIC zodat de structuur van het weefsel oppervlak meest herkenbare. Als alle cilia van de doelcellen beweeglijk kan een duidelijk beeld beweeglijke cilia niet worden verkregen op door hun beweging.
4. Verander het lichtpad om de video camera, en verwijder de ND filters om het licht macht te vergroten.
5. Gebruik de camera in richtmodus het gezichtsveld en scherp te stellen. Tijdens het scherpstellen, waarin videobeelden worden weergegeven op real-time op het scherm, een duidelijk beeld van beweeglijke cilia is niet beschikbaar.
6. Gebruik de camera op 200 Hz met een belichtingstijd van 0,1 msec voor de gewenste periode (seconden tot minuten). Na de overname van het beeld stack, zal enkele frames duidelijke trilharen structuren weer te geven. Als ciliary randen zijn vaag, verhoging van de frame rate of gebruik een kortere belichtingstijd.
7. Noteer de beweging van CPEC cilia binnen 25-60 minuten na euthanasie in LeibovitzL-15 medium.

3. Analyse van Ciliaire Motion

1. Handmatig bijhouden slaan patronen van elk cilium op het computerscherm. Mark ciliary tip posities in elk frame met de muisaanwijzer, die worden geassembleerd voor traject informatie van elk cilium. Ofwel analyseren de baan informatie met behulp van dezelfde software of de uitvoer naar andere, meer algemene toepassingen voor verdere analyse. De efficiëntie van deze analysestap wordt beschreven in de discussie.
2. Classificeren de trajecten in twee vormen van beweging, heen-en-weer of rotatie, door het oog.
3. Bereken de ciliaire kloppende frequentie (CBF) volgens de volgende formule: [CBF = (het aantal frames per seconde) / (gemiddeld aantal frames voor een enkele slag)] ^14, dat kan worden verkregen uit een ciliaire tip motion diagram (Figuur 3 ). Herhaal deze berekening voor meerdere cycli ciliaire slaan, omdat andere cilia op dezelfde cel kan interfereren met de beweging van elk cilium, waardoor onregelmatigheden.
4. Om de hoek uniformiteit van de ciliaire slaan assen in één cel te analyseren, definiëren het kloppende hoek θ elke bal (figuur 4). Voor back-en-weer trajecten, past de posities van de trilharen tip om een rechte lijn, en definieer θ als de hoek van de lijn maakt met de x-as. Bij roterende trajecten, past de positie van een ellips, en definieert θ de hoek van de lange as van de ellips maakt met de x-as. Details van de fitting worden beschreven in de sectie Representatieve resultaten.
5. Voor kwantitatieve beschrijving van elk traject, berekenen algemene aspect ratio AR. In het kort, roteren het traject van - θ en AR definiëren als de verhouding tussen de breedte van de langsheen x - en y -axes (figuur 4B). Details worden in de representatieve resultaten sectie, en de interpretatie, Significantie en de beperking van de parameter worden beschreven in de discussie.

4. Monstervoorbereiding voor SEM

Let op: SEM is een belangrijke methode om de status van de cilia op CPECs op een alomvattende manier te evalueren. Specimens voor SEM te bereiden, een standaard procedure eerder gerapporteerd ¹⁵ wordt gebruikt met lichte wijzigingen.

1. Voor ontleden het weefsel uit de hersenen, bereidt het fixeermiddel in een 5 ml glazen flacon met polyethyleen dop. Het fixeermiddel bestaat uit 2% paraformaldehyde, 2,5% glutaraldehyde (half Karnovsky's oplossing ¹⁶⁾ in 0,1 M fosfaatbuffer, pH 7,4.
2. Ontleden het weefsel van de hersenen zoals beschreven in stap 1.
3. Kort spoel de geïsoleerde weefsel met Hank's gebalanceerde zoutoplossing (HBSS) in een nieuwe schaal en bevestig het weefsel in het fixeermiddel in het glazen flesje gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geroerd. Gebruik wegwerp overdracht pipetten en omgaan met de exemplaren gently. Na spoelen in HBSS, het weefsel kleverig.
   1. Om de monsters te zetten in de fixeeroplossing langzaam verdrijven een kleine hoeveelheid oplossing die het weefsel van de pipet een druppel en aan het fixeermiddel.
4. Na fixatie, gooi het fixeermiddel en spoel het weefsel met fosfaatbuffer driemaal.
5. Dompel het weefsel in een 10% sucrose-oplossing te spoelen de resterende aldehyden. Om volledige verwijdering van aldehyden waarborgen, dompel de monsters in de oplossing gedurende 10 minuten en herhaal vervolgens tweemaal met vers 10% sucrose. Deze stap is belangrijk om goede post-fixatie in opeenvolgende stappen.
6. Dompel het weefsel in een oplossing van 1% osmiumtetroxide in fosfaatbuffer gedurende 30 min en vervolgens op ijs te plaatsen voor post-fixatie. Oordelen over de mate van osmification door het monster kleur: wanneer aldehyden volledig worden verwijderd, het monster is zwart.
7. Was het achteraf vaste weefselmonsters uitgebreid met dubbele distilled water een paar keer.
8. Uitdrogen de monsters door onderdompeling in gegradeerde concentraties ethanol, gewoonlijk 65%, 75%, 85%, 95%, 99% en 100%, gedurende 10 minuten elk. Verkrijgen watervrij ethanol door het plaatsen van moleculaire zeven in 99,5% ethanol uit een nieuw aangeschafte fles. Herhaal dehydratie met watervrij ethanol drie keer.
9. Plaats de gedehydrateerde monsters in isoamylacetaat, wisselen reagens voor kritische punt gedroogd, gedurende 10 min. Herhaal deze stap twee keer. Dit reagens snel verdampt en het monster kan droog worden, wat resulteert in vernietiging door oppervlaktespanning. Daarom is niet het monster volledig opdrogen.
10. Na de laatste uitwisseling van isoamylacetaat, verwijder het grootste deel van het oplosmiddel, onmiddellijk wikkel de open glazen flacon met aluminiumfolie en plaats de flacon op droog ijs. Met behulp van een naald of fijne tang, maken verschillende gaten in de folie die de monding van de fiool, zodat vloeistof koolstofdioxide gemakkelijk stroomt in de injectieflacon in het kritische punt droger. Ga naar de volgende stapzo snel mogelijk.
11. In deze stap, het minimaliseren van de overdracht van isoamylacetaat in de kamer van de droger, maar laat het monster uit te drogen voordat kritisch punt drogen. Bovendien, niet het monster op droogijs onnodig lang aan de vorming van ijs op de flacon voorkomen verlaten.
12. Breng de folie verpakte glazen flacon met weefselmonsters in het kritische punt droger die zorgt voor de oppervlaktestructuur van het weefsel blijft intact onder verwijdering van water in het weefsel. Gedetailleerde informatie over de bediening van het kritische punt droger is verkrijgbaar bij instructies van de fabrikant.
13. Behandel de monsters voorzichtig met een tandenstoker om mechanische schade te minimaliseren. De verkregen gedroogde weefselmonsters zijn kwetsbaar. Monteer de monsters op metalen stompjes en jas met goud-palladium met behulp van een ion sputter.

5. Observation door SEM

1. Observeren door SEM en beelden opnemen met een digitale camerauitgerust met scanning elektronenmicroscoop.
2. Transfer digitale beeldgegevens naar een PC voor analyse.

Resultaten

Een overzicht van de werkstroom wordt getoond in figuur 1, inclusief afbeeldingen van de inrichtingen.

Live beweging observaties van CPECs

Film 1 toont een film van CPECs geïsoleerd uit een perinatale muis en film 2 is een uiteengenomen aanzicht van de beelden in film 1. Opgemerkt wordt dat individuele ciliaire tips zijn minder duidelijk in foto's vergeleken met die van films. Figuur ...

Discussie

Perspectieven van deze methode

Hoewel de hier beschreven techniek biedt geen nadere analyse van cilia dan eerder gepubliceerde methoden, het belang van deze techniek ligt in de eenvoud van het systeem en kosteneffectiviteit, die gemakkelijk kan worden toegepast op het screenen van elk soort ciliaire motiliteit ex vivo. In het bijzonder, TI Workbench biedt een eenvoudige en gebruiksvriendelijke interface die de onderzoekers in staat stelt om te observeren en gemakkelijker te analyser...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Vereiste reagentia
voor live celbeeldvorming
ethanol	Wako Chemicals	057-00456
Leibovitz L-15 medium	Life Technologies	11415-064
voor SEM-voorbereiding
ethanol	Wako Chemicals	057-00456
Hank's balanced salt solution	Life Technologies	14170112
paraformaldehyde	Merck	1040051000
glutaraldehyde	Nacalai tesque	17003-05
isoamyl acetate	Nacalai tesque	02710-95
Molecular Sieves 4A 1/8	Wako Chemicals	130-08655	voor de bereiding van watervrij ethanol
fosfaat bufferoplossing (PBS)	Sigma-Aldrich	D1408
fosfaat buffer, 0.1 M			Om 100 ml te maken, meng 19.0 ml van 0.1 M NaH2PO4 en 81.0 ml van 0.1 M Na2HPO4
mononatriumfosfaat (dihydraat)	Nacalai tesque	31718-15
dinatriumfosfaat (watervrij)	Nacalai tesque	31801-05
suclose	Nacalai tesque	30406-25
osmiumtetraoxide	Nisshin EM	300
droog ijs
[header]
Gereedschap en materialen voor dissectie
voor zowel live beeldvorming als SEM-voorbereiding
stereomicroscoop	Olympus	SZX7
platte papieren handdoek
Φ10 cm plastic schaal
100 ml beker
rechte operatieschaart	Sansyo	S-2B
horlogemakerstangen	Dumont	No.DU-3 of -4, INOX
voor live celbeeldvorming
glasbodemschaal	Matsunami Glass	D110300
voor SEM-voorbereiding
aluminiumfolie
5 ml glazen vial met polyethyleen dop	Nichiden Rika-Glass	PS-5A
transferpipet	Samco Scientific	SM251-1S	voor monstersoverdracht
tandenstoker			voor monstersoverdracht
ion sputter met goud-palladium	Hitachi	E-1030
kritische puntdroger	Hitachi	HCP-2
[header]
Microscopisch apparatuur en materialen
voor live celbeeldvorming
invertede microscoop	Olympus	IX81
100 W kwiklamphuisvesting en voeding	Olympus	U-ULH en BH2-RFL-T3
100 W kwiklamp	Ushio	USH103D
DIC condensor, n.a. 0.55	Olympus	IX-LWUCD
elektrische sluiter	Vincent Associates	VS35S22M1R3-24 en VMM-D1	manuele sluiter kan worden gebruikt.
bandpass filter (400-700 nm, Φ45 mm)	Koshin Kagaku	C10-110621-1
ND filter (Φ45 mm)	Olympus	45ND6, 45ND25	combinatie van 25% en 6% ND filters worden gebruikt
objectieflens (water immersie) met DIC element	Olympus	UApo 40XW/340, n.a., 1.15 met IX-DPAO40
hoge snelheidsvideocamera	Allied Vision Technologies	GE680	≥200 Hz frame rate en 1 msec sluitertijd
beeldverwerving / analyse software	in-house software	TI Workbench	geschikt voor acquisitie met hoge frame rates.
PC voor camera controle / analyse	Apple	Mac Pro
vibratie isolatie tafel	Meiritsu Seiki	AD0806
gewicht voor weefsel	Warner Instruments	slice anchor kits	Het kan worden gemaakt met nylon gaas dat aan een U-vormige samengedrukte Φ0.5 mm platinadraad is vastgelijmd.
dekglas (alternatief gewicht voor weefsel)	Matsunami	op bestelling	Een dekglas kan worden gebruikt als weefselgewicht.
voor SEM
invertede microscoop	Olympus	IX81
scannende elektronenmicroscoop	JEOL	JSM-6510