Gecombineerd Shuttle-Box Training met Elektrofysiologische Cortex opnemen en stimulatie als een instrument om Perception en learning studie

Samenvatting

Shuttle-box vermijdingsleren is goed opgericht in behavioral neurowetenschappen. Dit protocol beschrijft hoe shuttle-learning in knaagdieren kan worden gecombineerd met locatie-specifieke elektrische intracorticale microstimulatie (ICMS) en gelijktijdige chronische in vivo opnames als een instrument om meerdere aspecten van leren en perceptie bestuderen.

Samenvatting

Shuttle-box vermijden leren is een gevestigde methode in gedrags-neurowetenschappen en experimentele opstellingen waren van oudsher op maat; de nodige apparatuur is nu beschikbaar door diverse commerciële bedrijven. Dit protocol geeft een gedetailleerde beschrijving van een twee-weg shuttle-box vermijden leren in knaagdieren (hier Mongoolse gerbils; Meriones unguiculatus) in combinatie met locatie-specifieke elektrische intracorticale microstimulatie (ICMS) en gelijktijdig chronisch elektrofysiologische in vivo opnames. De gedetailleerde protocol is van toepassing op verschillende aspecten van het leergedrag en perceptie in verschillende soorten knaagdieren bestuderen.

Plaatsspecifieke ICMS auditieve corticale circuits geconditioneerde stimuli hier wordt gebruikt als een instrument om het perceptuele belang van specifieke afferente, efferente en intracorticale verbindingen te testen. Distinct activeringspatronen kan worden opgewekt door verschillende stimulatie-elektrode arrays voor lokale, laag-afhankelijke ICMS of verre ICMS sites. Gebruik makend behavioral signaaldetectie analyse kan worden bepaald welke stimulatiestrategie het meest effectief voor het opwekken van een gedragsmatig detecteerbaar en opvallende signaal. Verder parallel multichannel-opnamen met verschillende elektrode-ontwerpen (oppervlakte-elektroden, diepte-elektroden, enz.) Zorgen voor het onderzoeken van neuronale van de zichtbaarheid in het tijdsverloop van dergelijke leerprocessen. Het zal worden besproken hoe veranderingen van het ontwerp van de cognitieve gedragstherapie complexiteit kunnen verhogen (bv detectie, discriminatie, reversal learning).

Inleiding

Een fundamentele doelstelling van behavioral neurowetenschappen is om specifieke verbindingen tussen neuronale structurele en functionele eigenschappen, leren en waarneming vast te stellen. Neurale activiteit in verband met de perceptie en leren kan worden bestudeerd door elektrofysiologische opname van actiepotentialen en lokale veld potentieel in verschillende hersenstructuren op meerdere plaatsen. ^{3 -} terwijl elektrofysiologische opnames bieden correlatieve associaties tussen neurale activiteit en gedrag, heeft directe elektrische intracorticale microstimulatie (ICMS) voor meer dan een eeuw de meest directe methode voor het testen van causale relaties van opgewonden populaties van neuronen en hun gedrag en perceptuele effecten ¹ geweest. Vele studies hebben aangetoond dat dieren kunnen maken van verschillende ruimtelijke en temporele eigenschappen van elektrische stimuli perceptuele taken naargelang de stimulatie plaats binnen bijvoorbeeld retinotopische ^4, vooreerstonotopic ⁵ of somatotopic ⁶ regio's in de cortex. Voortplanting van elektrisch opgewekte activiteit in de cortex wordt voornamelijk bepaald door de indeling van axonale vezels en hun gedistribueerd synaptische connectiviteit ² dat in cortex, duidelijk layer-afhankelijke ^7. De resulterende polysynaptic activering opgeroepen door ICMS is voortaan veel meer wijdverspreid dan de directe effecten van het elektrisch veld ^2,8,9. Dit verklaart waarom de drempels van perceptuele effecten opgewekt door intracorticale microstimulatie sterk layer-afhankelijke ^8,10,11 en locatie-afhankelijke ⁹ kan zijn. Een recente studie toonde in detail dat de stimulatie van de bovenste lagen leverde meer wijdverbreide activering van corticocortical circuits in voornamelijk supragranular lagen, terwijl het stimuleren van de diepere lagen van de cortex resulteren in een brandpunt, terugkerende corticoefferent intracolumnar activering. Parallelle gedragsexperimenten bleek dat de laatste heeft veel lagere perceptuele detectie THResholds ^8. Daarom is het gebruik van plaatsspecifieke ICMS als geconditioneerde stimuli werd in combinatie met elektrofysiologische opnames benut causaal verband specifieke corticale circuit activeringen ⁸ tot gedragsmaten leren en waarneming in de shuttle-box.

De twee-weg shuttle-box paradigma is een gevestigde laboratoriumapparatuur te vermijden leren ¹² te bestuderen. Een shuttle-box bestaat uit 2 compartimenten gescheiden door een hindernis of deuropening. Een geconditioneerde stimulus (CS), die wordt vertegenwoordigd door een geschikte signaal als een licht of geluid, is voorwaardelijk gevolgd door een aversieve ongeconditioneerde stimulus (US), zoals bijvoorbeeld een voet schok over een metalen roostervloer. Onderwerpen kunnen leren de Amerikaanse vermijden door shuttling van een shuttle-box compartiment naar het andere in reactie op het CS. Shuttle-box learning omvat een reeks van onderscheiden leerfasen ^13,14: Ten eerste,onderwerpen leren om de VS uit het CS te voorspellen door klassieke conditionering en om te ontsnappen aan de VS door instrumentale conditionering, de VS wordt beëindigd op pendelen. In een volgende fase, onderwerpen leren de Amerikaanse helemaal te vermijden door shuttling reactie op de CS bij Amerikaanse aanzet (vermijding reactie). In het algemeen, shuttle-box leren impliceert klassieke conditionering, instrumentale conditionering, evenals doelgericht gedrag afhankelijk leerfase ^14.

De shuttle-box procedure kan worden ingesteld eenvoudig en over het algemeen produceert robuust gedrag na een paar dagelijkse trainingen ^15-17. Naast eenvoudige vermijding conditionering (detectie), kan de shuttle-box verder worden gebruikt voor discriminatie stimulus bestuderen door gebruik go / nogo paradigma. Hier worden dieren getraind om de VS door een geconditioneerde respons (CR) (ga gedrag; shuttle in tegenovergestelde compartiment) voorkomen in reactie op een go-stimulus (CS +) en Nogo gedrag (verblijf in de huidige compartiment, geen CR) in reactie op een Nogo-stimulus (CS) Parallelle microstimulatie en registratie van neurale activiteit high-density Multielectrode laten bestuderen. de fysiologische mechanismen die ten grondslag liggen succesvol leren. Diverse technische details die van fundamenteel belang voor de succesvolle combinaties van shuttle-box training ICMS en parallelle elektrofysiologie zijn, zullen worden besproken.

Protocol

Alle experimenten die in dit werk werden uitgevoerd in overeenstemming met de ethische normen die door de Duitse wet voor de bescherming van proefdieren. Experimenten werden goedgekeurd door de ethische commissie van de deelstaat Saksen-Anhalt.

1. Maatwerk Multichannel elektrode arrays voor microstimulatie en opnemen

1. Custom-made microstimulatie scala
   1. Voor het leveren van ICMS, bereiden stimulatie elektroden in de gewenste ruimtelijke inrichting (hier laterale serie van 2 kanalen) met 3 cm lange Teflon geïsoleerde roestvrij staaldraad (Ø met isolatie = 50 pm). Zie figuur 2.
   2. Krimp ene uiteinde van de draden met een mannelijke pen systeem (1,25 mm spoed).
   3. Voor een 2-kanaals array met ~ 0,5 mm of ~ 0,7 mm elektrode afstand pas draden loodrecht via twee verticaal uitgelijnde elektronenmicroscopie object-houder grids (afstand van roosters ~ 5 mm) leiden van de draden (0,1654 mm pitch).
   4. Lijm draden met een kleine druppel van tandheelkundige acrylaat ongeveer 4 mm boven de uiteinden van de draden die uiteindelijk dienen als elektrodetoppen.
   5. Gebracht mannelijke pennen in de stekerbehuizing.
   6. Doe de elektrode in een schotel met elektrolytische oplossing (bijvoorbeeld 0,9% natriumchloride) en meet de impedantie van elk kanaal met een respectievelijk impedantiemeetelektrode (bijv., FHC impedantie Conditioning Module). Richt op impedanties in de 100 tot 500 kOhm bereik.
      1. Als de impedantie te hoog is, leveren korte elektrische stroom (1 sec, 1 mA) door de kanalen om deze te verlagen. Controleer impedantie weer.
2. Custom-made multichannel opname arrays hoge resolutie
   Let op: Dit protocol beschrijft de productie van oppervlakte-arrays voor het opnemen electrocorticogram (ECoG) gegevens. Toch kunnen ontwerpen worden afgestemd op de eisen van de desbetreffende vraagstelling (diepte opnames, etc.) voldoen. Multichannel arrays hoge resolutie zijn built by-Teflon geïsoleerde roestvrij staaldraad (Ø met isolatie = 50 pm) gekrompen met een mannelijke pin-systeem (1,25 mm pitch).
   1. Voor oppervlakte-elektrode arrays, begeleiden 18 draden door een matrix van twee voorbereide elektronenmicroscopie object-houder grids 3 x 6.
   2. Insluiten de 6 x 3 rangschikking van de draden tussen de roosters met tandheelkundige acryl en zet pinnen in de stekker behuizing.
   3. Maal de tandheelkundige acryl in een rechthoekig blok met behulp van molen gehecht aan een hand gehouden boor.
   4. Controleer dat de impedantie van alle kanalen (zie 1.1.6) is in het gebied tussen 100-500 kOhm.
   5. Vóór implantatie (zie stap 2) grind oppervlak van de arrays aan de convexiteit van de corticale oppervlak passen.

2. Chirurgische Implantatie van Arrays in de auditieve cortex in verdoofde Mongoolse Herbils voor chronische Usage

1. Houd de officiële goedkeuring van alle nodige experimentele stappen die zijn gepland uit te voeren. Slijtage voorkomendgeval beschermende kleding (jas, steriele handschoenen, chirurgisch masker, kap).
2. Gebruik volwassen mannelijke Mongoolse gerbil (Meriones unguiculatus) of enige andere knaagdieren. Draag beschermende handschoenen en een jas en altijd gebruik gesteriliseerd en goed geïdentificeerde chirurgische instrumenten.
3. Bij woestijnratten, verdoven dieren met ip injectie van een mengsel van ketamine (100 mg / kg) en xylazine (5 mg / kg) verdund in 0,9% steriele natriumchlorideoplossing. Handhaaf door infusie van 0,6 ml / uur / kg van een mengsel van ketamine componeren: xylazine: natriumchloride (0,9%) in een verhouding van 9: 1: 10.
4. Plaats dier op een verwarmingsplaat voor het handhaven lichaamstemperatuur bij 37 ° C met een rectale sonde feedbacksysteem (bijv World Precision Instruments).
5. Scheren bont die interoccipital, pariëtale en temporale botten. Aseptisch bereiden de incisie site met een effectieve desinfectiemiddel (bijv., Afwisselende Betadine of Nolvasan en 70% alcohol scrubs 3 keer). Protect ogen tegen uitdroging door oogzalf.
6. Snijd de craniale huid die de interoccipital, pariëtale en frontale botten met behulp van een scalpel en verwijder beenvlies door voorzichtig het verplaatsen van een boor over het bot oppervlak.
7. Boor kleine gaatjes in de contralaterale pariëtale en frontale bot lateraal mogelijk niet belemmeren later hoofd te monteren. Schroef twee botschroeven met een diameter van ongeveer 1 mm stevig in de openingen. Controleer of de pariëtale schroef goed contact met de dura, als het wordt gebruikt als een gemeenschappelijke referentie en de grond, alsmede retourelektrode voor elektrostimulatie later.
8. Lijm een ​​kleine aluminium bar mediaal over de voorhoofdsbeenderen en gebruik het als hoofd fixatie tijdens de implantatie van een headholder.
9. Verwijder het vel over de Musculus temporalis aan de ene kant met een schaar.
10. Snijd het dorsale gedeelte van de temporale spier om toelating tot de temporale bot te verkrijgen.
11. Expose auditieve cortex door craniotomy (~ 3 mm x 4 mm) vanhet temporale bot met behulp van een tandartsboor. Bepaal de locatie van auditieve cortex basis van de typische signatuur bloed-hersen-vat ^18,19.
12. Zorgvuldig maakt een incisie van de dura met een micro scalpel op de plaats waar de stimulatie-elektrode wordt geïmplanteerd in de hersenen. Beweeg langs het oppervlak tot aan de dura scheuren om schade aan de onderliggende neuropil verbieden.
13. Plaats stimulatie scala micromanipulator onder controle. Kies een tangentiële inbrenghoek om de epidurale matrix in het gebied van belang worden geplaatst. Afhankelijk van de invoeging hoek en de positie en de beoogde plaats van stimulatie, zorgvuldig de insteekdiepte.
14. Plaats de epidurale oppervlak opname array met goed contact aan de hersenen oppervlaktebedekking het gebied van belang (hier auditieve cortex) van een tweede micromanipulator. Zorg ervoor dat de matrix overeenkomt met de kromming van de cortex naar de dura niet inspringen.
15. Fixeren zowel elektrode arrays en hun plugbehuizingen met tandheelkundige acryl aan de schedel.
16. Cover blootgesteld corticale oppervlak met een antiseptische smeermiddel (bijv, KY-Jelly) en dicht craniotomie met tandheelkundige acryl (bijv Paladur Heraeus Ulzer). Houd in gedachten dat de polymerisatie warmte kan produceren. Gebruik voldoende glijmiddel tussen neuropil en tandheelkundige acryl om elk contact van de tandheelkundige acryl en de corticale oppervlak te voorkomen, want dit kan weefselschade veroorzaken.
17. Nu laat de dieren herstellen voordat het begin van elke verdere procedure. Hersteltijden kunnen verschillen tussen soorten (bijvoorbeeld, gerbils: ≥3 dagen, muizen: ≥7 dagen). Bewaak zorgvuldig de toestand van het dier en geeft pijnstillende behandeling in de volgende dagen indien van toepassing (bijv Meloxicam; 1 mg / kg postsurgical en 24 uur na de operatie).

3. Twee richtingen Shuttle-box ontwerpen met behulp van ICMS als geconditioneerde stimulus

1. Shuttle-box training
   1. Plaats een shuttle-box (cangepaste-build of een commercieel product, bijvoorbeeld, E10-E15, Coulbourn Instruments) in een akoestisch en elektrisch afgeschermde ruimte. De doos bevat twee compartimenten gescheiden door een hindernis. Denk aan de hoogte van de hindernis als het van invloed op de gedragsmatige vooringenomenheid van go-responsen. Gebruik de juiste hoogte voor specifieke soorten (bijvoorbeeld ~ 2 cm voor muizen, ~ 3 cm voor gerbils).
   2. Aan de voet-shock (VS) van toepassing, gebruik dan een roostervloer met een afstand tussen de tralies voor de soort geschikte in onderzoek ^12,15. Neem altijd de zorg dat er niets elektrisch snelkoppelingen van de afzonderlijke staven (ontlasting, haren, elektrode room).
   3. Na een aanzienlijke hersteltijd van het dier (zie 2.17), sluit het onderwerp aan de opname en stimulatie kabel bij voorkeur zonder gebruik van een korte termijn anesthesie. Proberen om het dier met een handdoek bedekken en voorzichtig neemt het dier in handen. Onthullen het hoofd en de aansluitingen van het dier met de andere hand en sluit de kabels.
   4. Sta dieren wennen aan de training kamer voor 3 min voor aanvang van elke sessie.
   5. Per training (1-2 per dag) van toepassing tussen 30-90 trials. Gebruik proef duur van maximaal 15 sec, en inter-proces intervallen die willekeurig variëren tussen 25 - 30 sec.
   6. Voor het leveren ICMS voor geconditioneerde stimulatie van de stimulatie-elektroden gebruiken een meerkanaals stimulator (bijvoorbeeld MCS STG2000). Om gedragseffecten verkrijgen zonder schade aan het hersenweefsel, pulsreeksen (bijvoorbeeld 300 ms lengte, 100 pps) van tweefasige, lading evenwichtig pulsen (kathodische eerst) toe te passen met een 200 microseconden faseduur. Herhaal treinen met een pauze van 700 ms voor een duur van 4 seconden (kijkvenster).
   7. Voor de presentatie van auditieve CS gebruik van een analoge uitgang PCI-kaart (bv NI PCI-6733). Programmeren van deze apparaten met Matlab flexibel beheersen en hardware-leiden van de shuttle-box systeem via de digitale uitgang lijnen.
   8. Route de analoge uitgang signaal naar the shuttle-box luidsprekers via een audio versterker.
   9. Voorwaardelijk leveren de voet-shock VS door een roostervloer. Voor optimale elektrofysiologische opnamekwaliteit, het genereren van de schok door een tweede high-end multichannel stimulator (MCS STG2000).
   10. Om de opleiding detectie alleen aanwezig CS + stimuli toe te passen. Hier presenteren blanco proeven zonder CS en de US afgewisseld tussen de test trials (~ 10%) te corrigeren voor partijdige shuttle gedrag (zie 3.2). Voor een meer veeleisende taak, train dieren om onderscheid te maken tussen CS + en CS-stimuli gepresenteerd in dezelfde sessie in willekeurige volgorde.
   11. Classificeren een compartiment verandering na de CS + ontstaan ​​binnen een kritiek moment raam van 4 sec (CR) als een hit reactie. In CS + proeven zonder CR in de kritische tijdvenster (miss), direct leveren een milde voet schok voor 6 tot 10 seconden als ongeconditioneerde stimulus (US).
       Opmerking: herhaalde CS + stimulatie die overlapt met de VS zal het leren inspanning voor de dieren een vermindering vannd verbeteren leren snelheid en prestaties ('delay' versus 'trace' conditioning, zie bespreking).
   12. Voor CS-trials, classificeren een compartiment verandering binnen de kritische tijdvenster als vals alarm reactie, en toepassing van de VS voor maximaal 10 seconden direct na dit ongepast CR. Ons niet toe te passen na CS wanneer het dier blijft in de ruimte (geen CR) tijdens de kritieke tijdvenster, en classificeren van deze studie als juist afwijzing.
       Let op: Belangrijk is dat de voet shock VS wordt altijd uitgeschakeld, wanneer de dieren verandert compartiment in reactie daarop (escape). Met meer kritische tijdvensters voor CS proeven, bijvoorbeeld wanneer geconditioneerde herhaalde stimulatie gebruikt, hoewel een meer conservatieve learning criterium wordt opgelegd zoals verschaft hogere inspanning van het dier naar CR remmen.
   13. Voor een effectieve organisatie van CS en de VS aan te passen shock kracht in een matige reeks om aversieve maar niet pijnlijk. Optimale Initial huidige sterkte verschilt tussen soorten (bijvoorbeeld 50 uA voor muizen, 200 uA voor gerbils). Daarom, zie de volgende twee kogels voor verdere technische gegevens:
       1. Individueel de schok kracht aan te passen in de eerste training te beginnen met een milde amplitudes (~ 200 uA voor gerbils). Als voet shock kracht het te laag is, ontsnappen latency jitter en associatie tussen CS en de VS is niet optimaal.
       2. Altijd aandacht besteden als de dieren beginnen te vocalize en te bevriezen in reactie op de CS. In dit geval footshock kracht te hoog. Deze geconditioneerde angstreactie interfereert met vermijding leren.
   14. Bepalen zorgvuldig de ontsnapping latencies. Verhoog voetschok sterkte stap voor stap als escape latencies langer dan 2 seconden na de eerste 20 trials. Controleer na elke training als het dier onder shock controle, dat wil zeggen, het toont ontsnappen latencies aanzienlijk lager dan 2 sec.
       Let op: Vermijd echter te voet te verhogenshock kracht te snel, als de gedrags-strategie van een zeer gestresst dier terug te kunnen vallen op pure ontsnappen reacties. Daarom nauw observeren van het gedrag, met name de reactietijden tijdens het instellen van de amplitude van de Verenigde Staten. Voor een voorbeeld zie figuur 3E.
   15. Als het dier toont de CR, stoppen met de presentatie van de CS onmiddellijk. Dit is essentieel voor de versterking van het vermijden respons.
   16. Als dieren een vermijden strategie, dat wil zeggen hebben verworven, tonen de juiste CR alle CS, variëren parameters (ICMS amplitude, fase duur, de herhaling tarief etc.) om psychometrische analyses uit te voeren. Solliciteer parametrische CS variatie in een bloksgewijs mode met de Amerikaanse paren, die zal echter leren en aanpassing induceren.
       1. Om dit te voorkomen, te beginnen met 15 tot 30 proeven van de oorspronkelijke opleiding, en vervolgens willekeurig tussenwerpen CS variaties zonder VS als proef proeven tussen de reguliere training proeven met de originele CS's. Maximaal use 25% van testproeven.
   17. Na de training verwijder het dier uit de training kamer en zorgvuldig reinigen van de volledige doos voor de training van het volgende dier. Probeer te voorkomen dat het trainen van verschillende soorten tegelijk in hetzelfde vak, als hun natuurlijke geur kunnen interfereren met de opleiding prestaties.
2. Analyse van de trainingsgegevens
   1. Nemen alle compartiment veranderingen in de gewenning fase.
   2. Registreert alle compartiment veranderingen tijdens de training en verdeel het in hits en valse alarmen, ontsnappen reacties (mist en terug shuttles na een vals alarm) en spontane intertrial shuttles (ITS).
   3. Bereken CR tarieven voor CS + en CS als volgt: hit tarieven = raakt / aantal CS + proeven; vals alarm tarieven = vals alarm / aantal CS-trials.
   4. Verkrijgen CR tarieven sessie-wise. Echter, het leren dynamiek beoordeelt een hogere temporele resolutie, bereken CR tarieven van korte blokken evenveel CS + en CS- trials ( bijvoorbeeld n = 10), respectievelijk.
   5. Perceel CR tarieven in functie van de sessie of proces blok voor de training vooruitgang en leren dynamiek evalueren.
   6. Voor kwantificering van de gedragsmatige gevoeligheid onafhankelijke experimentele omstandigheden voorspannen van de respons van het dier, afleiden d 'waarden gebaseerd op signaaldetectietheorie ^8,9,17.
   7. Voor d 'analyse gebruik Z-scores van overeenkomstige hit en vals alarm tarieven (leren discriminatie) of hit tarieven en ITS (detectie-learning) is afgeleid van de inverse van een gestandaardiseerde normale verdeling functie en aftrekken van deze z-scores. Een drempelwaarde criterium stimulusdetectie van d '= 1,0, wat overeenkomt met een signaalsterkte van één standaarddeviatie boven de ruis. Zie figuur 3 als voorbeeld.
   8. Bovendien bepaalt CR-, allemaal reactietijden in reactie op verschillende CS door meting van de tijdsduur tussen CS onset en gedragsmatige respons (complete compartimentveranderen).
   9. Het verkrijgen van een meer gedetailleerde gedragsanalyse van video-opnamen van de shuttle-box gedrag. Bereiken temporale synchronisatie tussen video en opnamesystemen door het opnemen triggerpulsen van de shuttle-box of stimulatiesysteem van de audio spoor van de video. Video-analyse maakt het mogelijk om ezels aandacht en oriëntatie reacties van de dieren voorafgaand aan de CR.

4. In Vivo Elektrofysiologische technieken in Learning Dieren

1. Elektrofysiologische opname tijdens de training
   1. Tijdens de training, nemen elektrofysiologische signalen (bijvoorbeeld met de beschreven ECoG-arrays) van meerdere elektroden monopolarly tegen de gemeenschappelijke referentie / massa-elektrode.
   2. Feed signalen van alle elektroden in een headstage versterker aangesloten hetzij direct of via een korte adapter in de kop connectors.
   3. Sluit de headstage de belangrijkste versterker via een harnas van dunne, flexibele kabels gewikkelddoor een metalen gaas te beschermen tegen beschadiging door dieren bijten.
      Opmerking: Mechanische stress in de kabelboom kan worden verlicht door een veer verdere waardoor het vrije verkeer en de rotatie van het dier in de doos. Ideaal is het gebruik van een draaibare en gemotoriseerde draaibare. Echter, voor auditieve experimenten plaats de draaibare buiten de geluidsdichte kamer of het geluid af te schermen met schuim om de hoge frequentie auditieve geluid geproduceerd door de motor te verminderen.
   4. Gebruik een voorversterker in de afgeschermde box stijgen signaal-ruisverhouding en banddoorlaatfilter van het signaal in het gewenste frequentiebereik.
   5. Sample data op meer dan 1 kHz bemonsteringsfrequentie (plaatselijke veldpotentiaal opnames) en ten minste 40 kHz (voor actiepotentiaal opnames) en opslaan in de PC voor offline analyse. Gebruik geschikte filter instellingen voor beide soorten (bv 2 - 300 Hz voor de lokale veld potentieel, 300 - 4000 Hz voor actiepotentialen).
   6. Controleer de kwaliteit van de opname zorgvuldig voor de start van tregent (geen geluid of beweging artefacten). Breng een online FFT-filter om het signaal met de amplitude van 50 Hz ruis te bepalen. Indien nodig double-check alle aansluitingen tussen de kop-connector, de adapters, de headstages, de kabelboom, en de versterkers.
   7. Voor reductie van artefacten in de geregistreerde data opgewekt door elektrische stimulatie gebruik een interpolatieprocedure alle gegevenspunten die door het artefact 1 ms voor tot ~ 5 ms na het begin van elke puls te reconstrueren. Hiervoor plaatst u nullen tussen de onaangetast datapunten, en een symmetrische FIR-filter dat de gemiddelde-kwadraat fouten tussen de geïnterpoleerde punten en hun ideale waarden (Matlab's interp.m functie) minimaliseert toepassing. Gelden deze procedure om het ruwe signaal, afzonderlijk op elk kanaal voor verdere analyse ^9.
2. Technische details van de parallelle shuttle-box training, ICMS, en de opname
   1. In het algemeen, ervoor te zorgen dat de dieren comfortabel in de doos omg voelenng. Laat het dier om vrij te bewegen en bereiken alle hoeken van de doos. Voldoende tijd om een ​​dag gewennen vóór de eerste training (20 min) en vóór iedere zitting (3 min) gunstig.
   2. Na elke chirurgische behandeling, waarop het dier voldoende tijd om inclusief medicijnen herstellen indien nodig (zie boven 2,17) en begint om alleen de dieren leiden, indien dieren geen typische symptomen van lijdt of pijn (gesloten ogen, lethargisch fenotype, smerig fur tonen ^20).
   3. Zorg voor een goede elektrische aarding van de roostervloer. Aardlussen tussen opnamesysteem, shuttle-box en het dier worden vermeden. Gemalen het dier alleen via de gemeenschappelijke grond elektrode, het verlaten van de roostervloer op een drijvend spanning.
   4. Sluit de multichannel stimulator (MCS STG2000) aan het hoofd connector van het geïmplanteerde stimulatie-elektrode-array via afzonderlijke lijnen van de gemotoriseerde draaibare.
   5. Gebruik de gemeenschappelijke massa-elektrode van de opname als de grond of terug elektrode voor de ICMS, als goed.

5. histologische analyse van de elektrode posities

1. Na de volledige training set, de controle voor de stabiele positie van de stimulatie-elektrode-array door histologische analyse.
2. Verdoven dieren met ip injectie van een mengsel van ketamine (100 mg / kg) en xylazine (5 mg / kg) verdund in 0,9% steriel natriumchloride. Breng vervolgens monopolaire kathodestroom (30 uA 60 sec) geleverd door alle stimulatiekanalen ijzer afzetting in het weefsel te verkrijgen op de plaats van implantatie ^8.
3. Naar aanleiding van deze procedure, offeren het dier door een geschikte en goedgekeurde methode van euthanasie (bv intraperitoneale injectie van een overdosis van pentobarbital, 100 mg / kg).
4. Verwijder de hersenen van het dier onmiddellijk bevriezen in 2-methylbutaan afgekoeld tot -70 ° C in vloeibare stikstof.
5. Knip nu het gebied van de rente op een cryostaat microtoom in 50 micrometer horizontal secties.
6. Histologie: Nissl en "Pruisisch blauw" -staining
   1. Voor de identificatie van corticale lagen behandelen elke seconde slice met Nissl-kleuring. Ten eerste, baden schijfjes 5 min in 0,05 M natriumacetaat buffer (pH 4,0 -4,2).
   2. Baden plakken voor 5-10 min in 5% cresylviolet acetaat. Spoel plakjes met gedestilleerd water.
   3. Baden plakken voor 2 min achtereenvolgens in 0,05 M natriumacetaat buffer (pH 4,0 - 4,2) en in oplossingen van 50%, 70% en 90% ethanol, respectievelijk.
   4. Baden segmenten tweemaal in isopropanol: 96% ethanol (2: 1) gedurende 5 minuten elk.
   5. Tenslotte baden plakjes in Roticlear drie keer gedurende 5 min.
   6. Het verkrijgen van de locatie van de stimulatie kanalen door "Prussian Blue" -staining van elk ander stukje dat de ijzeren afzetting opgeroepen door lange monofasisch stromen na de experimenten zichtbaar maakt.
   7. Bereid een verse oplossing van 1% kalium hexacyanoferrat (II) trihydraat K ₄[Fe (CN) _6] door het mengen van 2 g K ₄ [Fe (CN) _6] in 200 ml van 1% HCl.
   8. Voeg 800 ml van 0,1 M fosfaatbuffer (pH 7,4).
   9. Baden hersencoupes gedurende 10 minuten met gedistilleerd water en vervolgens gedurende 10 min in hexacyanoferrat oplossing.
   10. Baden segmenten tweemaal gedurende 10 min in 0,1 M fosfaatbuffer en uiteindelijk gedurende 5 min in gedestilleerd water.

Resultaten

Deze sectie geeft een representatief voorbeeld van de shuttle-box leren in een Mongoolse gerbil. De proefpersoon werd opgeleid discrimineren de ICMS plaats tussen twee stimulatie-elektroden geïmplanteerd 700 urn uit elkaar in auditieve cortex (figuren 1 en 2). Stimulatie arrays kunnen worden aangepast in verschillende ruimtelijke ontwerpen (figuur 1). Hier, discriminatie van de twee locaties ICMS werd geleerd binnen 3 trainingen met de presentatie van 30 CS + en CS elk (figuur 3...

Discussie

Dit protocol beschrijft een methode van simultane site-specific ICMS en multi-channel elektrofysiologische opnames in een leren dier met behulp van een twee-weg aversieve voet shock-gecontroleerde shuttle-box systeem. Het protocol legt de nadruk technische kernbegrippen voor deze combinatie en wijst op het belang van de aarding van de dieren alleen via de gemeenschappelijke grond elektrode, het verlaten van de roostervloer op een drijvend spanning. Hier werd auditief shuttle-box leren toegepast op Mongoolse gerbils als-...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Teflon-insulated stainless steel wire	California Fine Wire		diam. 50µm w/ isolation
Pin connector system	Molex Holding GmbH	510470200	1.25 mm pitch PicoBlade
TEM grid Quantifoil	Science Services	EQ225-N27
Dental acrylic Paladur	Heraeus Kulzer	64707938
Hand-held drill OmniDrill35	WPI	503599
Ketamine 500mg/10ml	Ratiopharm GmbH	7538837
Rompun 2%, 25ml	Bayer Vital GmbH	5066.0
Sodium-Chloride 0.9%, 10ml	B.Braun AG	PRID00000772
Lubricant KY-Jelly	Johnson & Johnson
Shuttle-box E10-E15	Coulbourn Instruments	H10-11M-SC
Stimulus generator MCS STG 2000	Multichannel Systems
Plexon Headstage cable 32V-G20	Plexon Inc.	HSC/32v-G20
Plexon Headstage  32V-G20	Plexon Inc.	HST/32v-G20
PBX preamplifier 32 channels	Plexon Inc.	32PBX box
Multichannel Acquisition System	Plexon Inc.	MAP 32/HLK2
Cryostate CM3050 S	Leica Microsystems GmbH
Signal processing Card Ni-Daq	National Instruments
Lab StandardTM Stereotaxic Instruments	Stoelting Co.
Audio attenator g.pah	g.pah Guger technologies
Cresyl violet acetate	Roth GmbH	7651.2
Roticlear	Roth GmbH	A538.1
Sodium acetate trihydrate	Roth GmbH	6779.1
Potassium hexacyanoferrat(II) trihydrate	Roth GmbH	7974.2
Di-sodium hydrogen phospahte dihydrate	Merck	1,065,801,000
ICM Impedance Conditioning Module	FHC	55-70-0
Animal Temperarture Controler	World Precision Instruments	ATC2000