Methodenartikel

Onderzoek van Synaptic Tagging / Capture en Cross-capture met Acute hippocampus Plakjes van Knaagdieren

DOI:

10.3791/53008

⸱

4 september 2015

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Physiology, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore, 2Neurobiology/Aging Programme, Life Sciences Institute, National University of Singapore

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze video-artikel beschrijft experimentele procedures om langetermijnplasticiteit en de daarmee geassocieerde processen zoals synaptische tagging, capture en cross-tagging in de CA1-piramideneuronen te bestuderen met behulp van acute hippocampus-sneden van knaagdieren.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Synaptische tagging en capture (STC) en cross-tagging zijn twee belangrijke mechanismen op cellulair niveau die verklaren hoe synaps-specificiteit en associativiteit wordt bereikt in neuronen binnen een specifiek tijdsbestek. Deze langetermijn plasticiteit-gerelateerde processen zijn de leidende kandidaatmodellen om de basis van geheugenvorming en persistentie op cellulair niveau te bestuderen. Zowel STC als cross-tagging omvatten twee seriële processen: (1) het instellen van de synaptische tag als geactiveerd door een specifiek stimulatiepatroon, en (2) synaptische capture, waarbij de synaptische tag interageert met nieuw gesynthetiseerde plasticiteit-gerelateerde eiwitten (PRP's). Veel van het begrip van de concepten van STC en cross-tagging komt voort uit de studies die gedaan zijn in de CA1-regio van de hippocampus en vanwege de technische complexiteit zijn veel laboratoria nog steeds niet in staat om deze processen te bestuderen. Experimentele omstandigheden voor de bereiding van hippocampale slices en de registratie van stabiele late-LTP/LTD zijn uiterst belangrijk om synaptische tagging/cross-tagging te bestuderen. Dit videoartikel beschrijft de experimentele procedures om langetermijn plasticiteit processen zoals STC en cross-tagging te bestuderen in de CA1 pyramidale neuronen met behulp van stabiele, langetermijn veldpotentiaal registraties van acute hippocampale slices van ratten.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het coderen en opslaan van informatie in de hersenen blijft de meest belangrijke en intens bestudeerde uitdaging in de neurowetenschap. Door de jaren heen zijn langetermijnpotentiëring (LTP) en langetermijndepressie (LTD) opgekomen als de belangrijkste cellulaire correlaten van geheugen1,2. Deze activiteitsafhankelijke veranderingen, die inputspecificiteit en associativiteit vertonen, resulteren in de stabilisatie van geheugensporen in de neuronale netwerken 1,3,4. Het onderhoud van de twee vormen van synaptische plasticiteit vereist de synthese van plasticiteit-gerelateerde producten (PRPs)5-10. Synaapspecificiteit die de interactie van pas gesynthetiseerd proteïne alleen met specifiek geactiveerde synapsen die LTP of LTD uitdrukken, omvat, is cruciaal voor geheugen. Deze specificiteit wordt verklaard door het concept van ‘Synaptische Markering en Vastlegging’ (STC), waarbij de PRPs interageren met recent actieve, ‘gelabelde’ synapsen11,12. Het STC-proces biedt een raamwerk voor associatieve eigenschappen van herinneringen op cellulair niveau. Het biedt ons een conceptuele basis van hoe kortetermijnvormen van plasticiteit worden getransformeerd in langdurige vormen van plasticiteit op een associatieve en tijdsafhankelijke manier13.

Tijdens het proces van STC, resulteert een sterke tetanisatie in één input die leidt tot proteïnesynthese-afhankelijke late-LTP, in de versterking van een proteïnesynthese-onafhankelijke vroege-LTP geïnduceerd in een andere onafhankelijke input op dezelfde populatie neuronen in een persistente13. Het instellen van een lokale synaptische tag door een tijdelijke neurale activiteit en de synthese van de diffuusbare PRPs door de sterke neurale activiteit zijn de twee belangrijkste gebeurtenissen tijdens STC13,14. De vastlegging van de PRPs door de recentelijk gepotentieerde ‘gelabelde’ synapsen is fundamenteel voor het onderhoud van langetermijnpotentiëring. Veel studies zijn gedaan om de bestaansrecht van het STC-fenomeen te bevestigen15-17 en de kandidaat-‘tags’ 18 en ‘PRPs’19 te identificeren. Calcium/calmodulin-afhankelijke proteïnekinase II (CaMKII) en extracellulair signaal-gereguleerde kinase1/2 (ERK1/2); CaMKIV, Proteïne Kinase M (PKM) en hersenafkomstige neurotrofe factor (BDNF) zijn enkele van de kandidaat-moleculen voor respectievelijk ‘tag’ en ‘PRP’19-21. Het synaptische tagging-model is verder uitgebreid om de positieve associatieve interacties tussen LTP en LTD te omvatten - de “synaptische cross-tagging”22. In synaptische cross-tagging transformeert een late LTP/ LTD in één synaptische input de tegengestelde proteïnesynthese-onafhankelijke vroege-LTD/LTP in een onafhankelijke input in zijn langdurige vorm of vice versa22.

De hippocampale slice-voorbereiding is het meest gebruikte model in de studies van langetermijn synaptische plasticiteit23,24. Veel van het begrip over de concepten van synaptische tagging en cross-tagging komt voort uit de studies gedaan in CA1-regio van de hippocampus en vanwege de technische complexiteit zijn veel van de laboratoria nog steeds niet in staat om deze processen te bestuderen. Experimentele omstandigheden voor de voorbereiding van rattenhippocamplaire slices en de registratie van stabiele late-LTP/LTD gedurende langere tijd zijn uiterst belangrijk om synaptische tagging/cross-tagging te bestuderen23,25,26. Dit artikel beschrijft de gedetailleerde experimentele procedures voor het bestuderen van langetermijn plasticiteit processen zoals STC en cross-tagging in de CA1 piramidale neuronen met behulp van stabiele, langetermijn veldpotentiaalregistraties uit acute hippocampale slices van ratten.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle dierlijke procedures werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) van de National University of Singapore.

1. Voorbereiding van de kunstmatige cerebrospinale vloeistof (ACSF)

  1. Bereid de ACSF bestaande uit (in mM) 124 NaCl, 3,7 KCI, 1,0 MgSO .7H 4 2 O, 2,5 CaCl2 .2H 2 O, 1,2 KH 2PO 4, 24,6 NaHCO 3 en 10 D-glucose. Zorg ervoor dat de pH van de ACSF tussen 7,2-7,4 bij geborreld tot verzadiging met 95% O2 en 5% CO 2 mengsel (carbogen). 21 Gebruik deze ACSF zowel de dissectie, slice voorbereiding en perfusie tijdens de elektrofysiologische opnames.
    OPMERKING: Gebruik schone toestellen voor het meten en vasthouden van de ACSF. Met behulp van onreine apparaat kan leiden tot troebel oplossingen of de vorming van neerslag. Gebruik gedemineraliseerd water voor alle voorbereidingen.
  2. Bereid een 2 L 10x ACSF voorraad exclusief NaHCO3 en D-glucose in een volumetrische kolf. Reagentia Naar gedeïoniseerd water in deze volgorde: NaCl (144.96g), KCI (5,52 g), MgSO .7H 4 2 0 (4,92 g), CaCl .2H 2 2 0 (7,56 g), KH 2PO 4 (3,28 g) en vul tot een volume van 2 L. continu roeren gedurende ten minste 30 minuten met een magneetroerder te zorgen dat alle reagentia zijn opgelost. Bewaar de voorraad in 4 ° C en gebruik binnen 2 weken.
  3. Vóór de dissectie en de experimenten verdunnen ACSF voorraad in een maatkolf met toevoeging van de vereiste hoeveelheid NaHCO3 en D-glucose. 1 L oplossing, verdun 100 ml van de tot 1 L na het toevoegen van 2,07 g NaHCO3 en 1,802 g D-glucose. De ACSF moet een heldere oplossing vrij van neerslag of opgeloste deeltjes.
  4. Koele ongeveer 200-300 ml ACSF op ijs, om te worden gebruikt tijdens de dissectie. Zorg ervoor dat de ACSF gebruikt voor dissectie is tussen 2-4 ° C. Gebruik de resterende ACSF voor electrophysiological experimenten. Bubble alle ACSF oplossing tot verzadiging met carbogeen (5% CO2, 95% O2) continu. Tijdens het wachten op de ACSF om af te koelen, de voorbereiding van de dissectie gebied en de slice kamer.

2. Voorbereiding van de Interface Kamer

Opmerking: Een interface hersenplakje kamer, voor incubatie van de segmenten en het handhaven ervan tijdens elektrofysiologische opnames (figuur 2B), bestaat uit twee compartimenten. De onderste kamer bevat gedestilleerd water gehandhaafd op 32 ° C door een temperatuurregelaar en continu borrelen met carbogen.

  1. Zet de temperatuurregelaar en ingesteld in bij 32 ° C. Was de bovenste kamer 10 tot 15 minuten met stromend gedestilleerd water door de toevoer slang. Zorg ervoor dat de bovenste kamer schoon is voordat u het net. Controleer dat de waterstand in de onderste kamer is ongeveer 70% gevuld met gedestilleerd water.
  2. Plaats denet in de bovenste kamer van een steunvlak voor plakken (figuur 2C) te verschaffen. Stel de uitstroom buis zodat het vloeistofniveau voldoende het hele gebied van het net bevochtigen. Plaats het deksel boven het net om een ​​vochtige carbogen sfeer binnen de bovenste kamer te handhaven.
  3. Stel het debiet tot 1 ml / min. Handhaaf deze debiet gedurende de slice incubatietijd en het experiment. Start carbogenating de vers bereide 1x ACSF en dompel de instroom slang in de ACSF. Laat 20 min voor ACSF met carbogen en de bovenkamer te vullen ermee verzadigd.

3. Voorbereiding van de Acute hippocampus Plakjes

Opmerking: De dissectie protocol bestaat uit (1) Verwijdering van de hersenen van het dier in koud ACSF en (2) Isolatie en snijden van de hippocampus. Om neuronen om levensvatbaar te blijven, te isoleren en zet de hersenen in koude ACSF snel en completeren het geheelWerkwijze zoals snijden binnen 3-5 min.

  1. Verwijdering van de hersenen in koude ACSF
    1. Leg de dissectie-instrumenten op de wijze getoond in figuur 1A. Rangschik de gereedschappen volgens de volgorde van gebruik om de dissectie te vergemakkelijken. Voordat u begint, zorgen voor alle dissectie gereedschappen zijn klaar.
    2. Monteer een scheermesje, gereinigd met ethylacetaat, absolute ethanol en gedestilleerd water, op de handleiding weefsel chopper (Figuur 1B), zet hem stevig vast en zorgen dat de snijkant gelijkmatig wordt uitgelijnd. Test hakken een stukje filtreerpapier zodat het blad goed vastzit. Stel de glijdende Vernier micrometer zijn uitgangspositie.
    3. Euthanaseren van de dieren met behulp van kooldioxide (CO 2) in een inductie kamer en onthoofden met een bandage schaar of Guillotine. Met behulp van een Iris schaar, verwijder de huid en vacht boven de schedel. Maak een snede door het achterste van de brainstem.Make verwijderen van een kleine incisie langs the rechterzijde van de schedel en een langere incisie aan de linkerkant.
      LET OP! Maak slechts een kleine incisie aan de zijde die wordt gebruikt voor de experimenten om beschadiging te voorkomen. Bij het invoegen van de schaar, ervoor zorgen dat de toegepaste kracht omhoog om schade aan de hersenen voorkomen.
    4. Verwijder de schedel voorzichtig met een been rongeur vanaf de linkerkant naar de rechterkant van de schedel naar de cortex te onthullen. Een dunne laag dura kan ook worden gezien. Haal de frontale platen met de rongeur. Verwijder het meeste dura naast de frontale platen.
      LET OP! Zorg ervoor dat de dura niet snijden door het hersenweefsel.
    5. Verwijder het resterende dura eventueel name in de verbinding tussen cortex en cerebellum met het platte uiteinde van een spatel. Voor de stappen 3.1.5 en 3.1.6, te onderhouden druk naar boven wil zeggen, weg van de hersenen om beschadiging te voorkomen. De spatel voorzichtig schep de hersenen in een petrischaal gevuld met koud en carbogenated ACSF (2-4 ° C), placed op een aluminium koelblok.
  2. Isolatie van de hippocampus
    1. Met behulp van een scalpel, maak een rechte snede om de kleine hersenen en een andere cut te verwijderen om het voorste deel van de hersenen (ongeveer een kwart) te verwijderen. Maak een ondiepe snee over de middellijn.
    2. Haal de cortex met een sikkel scaler, vanaf de middellijn aan de dorsale hippocampus onthullen. Verwijder de laag boven de cortex hippocampus. Gebruik vingers of schuin tang om de hersenen te ondersteunen. Maak een kleine snee aan de hippocampus commissuur. Verwijder voorzichtig de hippocampus met de sikkel scaler vanaf de dorsale hippocampus met rollende bewegingen.
      LET OP! Wees voorzichtig om te voorkomen dat rekken en scheuren van de hippocampus.
    3. Verwijder eventuele cortex en bindweefsel rond de geïsoleerde hippocampus met de sikkel scaler.
  3. Het snijden van de hippocampus weefsel en het overbrengen van de plakjes op de interface kamer
    1. Leg een stuk ACSF-gedrenkt filtreerpapier (Grade 1, 30 mm) op het snijden fase van de handmatige snijmachine. Schep en plaats de hippocampus weefsel op het filter papier. Beweeg het filterpapier aan de hippocampus lijnen op een juiste oriëntatie ten opzichte van het blad van de snijmachine, zodat de hippocampus wordt gesneden onder een hoek van ongeveer 70 o de fimbria.
    2. Dep de overtollige oplossing rondom de hippocampus weefsel met een gevouwen papieren filter (Grade 1, 85 mm), het verlaten van de hippocampus beetje nat. Start snijden de hippocampus dwars. Slice en gooi weefsel uit het uiteinde van de hippocampus, waar het schijfje morfologie is niet duidelijk.
    3. Snijd de resterende weefsel in 400 micrometer dikke plakken. Pick-up hippocampus plakjes voorzichtig van het mes met een borstel met zachte haren met zachte vegen bewegingen en leg de plakken in een kleine beker gevuld met koud carbogenated ACSF. Voer de stappen 3.3.1-3.3.3 zo snel mogelijk omdat de hippocampus weefsel wordt blootgesteld aan lucht.
      OPMERKING: algemeen tweederde van de hippocampus gesneden, en 4-6 segmenten met duidelijke morfologie kunnen worden bereid.
    4. Breng de plakjes voorzichtig op het net in de slice kamer met een schone plastic Pasteur pipet met een brede punt (gemaakt door het wegsnijden van 2-3 cm van de tip). Zorgvuldig wordt de plaats van de plakjes op het net met een kleine spuit met een gebogen uiteinde. Plaats de plakjes op een manier die elektrode locatie en opname vergemakkelijkt. Controleer of de schijfjes voldoende door ACSF omgeven maar niet ondergedompeld of drijvende (figuur 2C-D). Bedek de kamer en incubeer de schijfjes voor 2-3 uur.
      OPMERKING: De piramidale cellaag in de gezonde plakjes moet enige transparantie te tonen.

4. Registratie van CA3-CA1 Synaptic Responses

Opmerking: De elektrofysiologische opstelling voor veldpotentiaal opname wordt getoond in figuur 2A. Een Faradag kooi wordt sterk aanbevolen als de elektrische storing is buiten de controle na de juiste aarding van de elektrische instellingen. Veel verschillende soorten ondergedompeld en de interface kamers zijn commercieel verkrijgbaar. Echter interface-kamers voorkeur als segmenten vertonen robuuster synaptische responsen in hen.

  1. Positionering van de elektroden
    1. Schakel de elektrische inrichting (stimulatoren en versterkers) te gebruiken. Mount en zet de stimulerende en opname elektroden in het plexiglas houders van de micromanipulators.
      LET OP: We maken gebruik van monopolaire, lak gecoat, RVS elektroden van 5 MQ weerstand voor zowel stimulerend en opname doeleinden.
    2. Voor het gebruik, plaatst u deze elektroden in het getrokken glas haarvaten en veilig met epoxy lijm bloot slechts klein deel van de elektrode (Figuur 2E). Dit geeft sterkte aan de andere smalle elektroden en helpt hen stevig vast in de elehouders ctrode.
    3. Geleide onder de microscoop, plaats de stimulerende elektrode (s) in het stratum radiatum van CA1 regio om de Schaffer collaterale vezels en de registratie-elektrode in de apicale dendritische regio CA1 stimuleren veld-EPSP (fEPSP) responsen opnemen.
      Opmerking: Het naderen het vloeistofoppervlak boven het segment met de electroden geeft een geluid dat helpt om snel het oppervlak van het segment (verschaft, is de versterker verbonden met een luidspreker).
    4. In synaptische tagging en opname experimenten, volgens de behoefte van het experiment positie twee of drie prikkelelektroden (S1, S2 of S3) aan weerszijden van de registratie-elektrode om twee of meer onafhankelijke maar overlappende ingangen stimuleren. Plaats de stimulerende en registrerende elektroden ongeveer 200 urn uit elkaar.
    5. Indien nodig, zoek een andere registratie-elektrode in het stratum pyramidale laag voor het opnemen van de bevolking spike (figuur 3A) .Wanneer zowel deelektroden hebben de slice aangeraakt, met behulp van de acquisitie software, geven een test stimulatie om een ​​goede fEPSP signaal te waarborgen.
      LET OP: We maken gebruik van bifasische, constante stroom pulsen (impuls duur 0,1 msec / half-wave) voor de test stimulatie.
    6. Zodra een goede fEPSP signaal wordt verkregen, kantel de elektroden ongeveer 200 micrometer diep met fijne bewegingen knoppen van de manipulatoren. Laat 20 min voor de plakjes om te herstellen. Test de route onafhankelijkheid met een gepaarde-puls facilitatie protocol 27,28.
  2. Input-output relatie
    1. Bepaal de input-output verhouding (afferente stimulatie vs fEPSP helling) voor elke ingang door het meten van de helling bij een bereik van stroomsterkten. Voer deze tussen 20 pA tot 100 uA. Stel vervolgens de stimulatie-intensiteit voor elke ingang tot 40% van de maximale helling fEPSP verkrijgen. Houd deze constant gedurende het experiment.
    2. Na 15-20 minuten, beginnen met het opnemen van de basislijn. Toezien op de fEPSP helling nauw in deze periode en reset de stimulus intensiteit als de helling fluctueert meer dan 10% van de ingestelde waarde en start een nieuwe baseline. Record tenminste 30 minuten of 1 uur stabiele basislijn voordat u verder gaat.
      LET OP: Voor de test of de basislijn stimulatie, maken we gebruik van vier sweeps van 0,2 Hz tweefasige, constante stroom pulsen (0,1 msec per polariteit) gegeven om de 5 min. Een gemiddelde hellingsgraad van deze vier antwoorden wordt dan beschouwd als een repeat. De signalen worden gefilterd en versterkt door een verschilversterker, gedigitaliseerd met behulp van een analoog-digitaalomzetter en online gevolgd met op maat gemaakte software.
  3. Inductie van LTP / LTD behulp stimulatieprotocollen
    OPMERKING: Zowel LTP en LTD zijn reeds geclassificeerd en late-LTP / LTD basis van de eisen van de eiwitsynthese; de laatste die vertaling en / of transcriptie voor zijn late onderhoud [zie voor een overzicht 4]. Een verscheidenheid van elektrische stimulatie paradigma kan specifically induceert de verschillende vormen van LTP en LTD.
    1. WTET: 100 Hz, 21 tweefasige constante stroom pulsen (0,2 msec per fase).
    2. STET: Drie uitbarstingen van 100 pulsen gedurende één seconde (100 Hz) elke 10 min (Pulse breedte 0,2 msec per fase).
    3. 900 bursts over een 15 minuten periode. 1 burst bestaat uit 3 pulsen (0,2 msec breed) met een interpuls interval van 50 msec (20 Hz). De inter salvointerval is 1 sec (totaal aantal pulsen 2700).

5. Reinigen van Slice Kamer en perfusiesysteem

  1. Nadat de opname is voorbij, het verzamelen van de hippocampus plakjes voor verdere biochemische analyse of anders weggooien adequaat. Schakel de carbogen aanbod en temperatuurregelaar. Was de carbogen bubbler in gedestilleerd water.
  2. Reinig het net grondig met een borstel en gedestilleerd water. Was het tuig voor 15-20 minuten met gedestilleerd water met een hogere stroomsnelheid. Eenmaal in 3-4 dagen, verander het gedestilleerd water in deonderste compartiment van de kamer en ook schoon de kamer regelmatig met 3% waterstofperoxide oplossing schimmelgroei te voorkomen.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De beschreven methode werd gebruikt om langdurige vormen van LTP / LTD en associatieve interacties zoals synaptische tagging en cross-vangt van acute hippocampus plakjes van volwassen rat model. 23 Deze techniek is effectief voor experimenten met zowel ratten aangetoond (Wistar) en diverse muizenstammen 30,31. De werkwijze is met succes gebruikt voor stabiele LTP opnames tot 8-12 uur. 32

De 'tag' van de zwakke tetanization één ingang (S1) in te stellen vangt het veroorzaakt door de sterke tetanization van een andere onafhankelijke maar overlappende input 'PV' (S2; Figuur 3B, gevulde cirkels), waardoor het transformeren van de anders rottende vorm van LTP (vroeg -LTP) in S1 een langdurige on (Figuur 3B, open cirkels) (Ter vergelijking vroege-LTP geïnduceerd door WTET zie 20,33). De PRP's gevangen genomen door de zwakketetanization set tag hoeft niet noodzakelijkerwijs afkomstig van de STET-geïnduceerde late-LTP, maar kan ook worden geleverd door de SLFS-geïnduceerde late-LTD. Dit soort positieve associatieve interactie tussen LTP en LTD wordt aangeduid als 'cross-tagging / capture'. De WTET-geïnduceerde vroege LTP in S1 wordt versterkt om late-LTP (figuur 3C, open cirkels) door het vastleggen van de PV die door de SLFS-geïnduceerde late LTD in S2 (figuur 3C, gevulde cirkels). Statistisch significante versterking of depressie werd gehandhaafd S1 en S2 in beide gevallen vergeleken met een eigen basislijn (Wilcoxon proef; P <0,05).

Voor de tag-PRP interactie voordoet, de tijdelijke volgorde van de twee events (weak eerder strong / strong eerder zwak) is niet essentieel zolang het tijdvenster tussen de twee gebeurtenissen binnen het bereik van 30-60 blijft minuten. Het zou verstandig zijn om een ​​derde, onafhankelijke maar overlappende synaptische in onderzet en deze als een basislijn controle om de stabiliteit van opnames te controleren. De elektrische stimulatie protocollen die worden gebruikt om vroegtijdige en late vormen van LTP / LTD veroorzaken moeten worden gevalideerd in een enkele ingang experimenten voor consistentie en betrouwbaarheid voordat u ze in STC experimenten. We willen ook het belang van de slice voorbereiding methodologie in het protocol beschreven benadrukken, omdat het succes van deze experimenten is sterk afhankelijk van de kwaliteit van de plakjes.

figure-results-1
Figuur 1. (A) Gereedschap gebruikt bij de dissectie van hippocampus: (a) verbandschaar (b) irisschaar (c) Bone rongeur (d) Thin spatel, (e) Scalpel nummer 11 (f) Sickle scaler (g) Soft -bristle kwast (h) Plastic Pasteur pipet (i) papieren filter (85mm) (j) filterpapier (30mm) (k) Glazen bekers (l) van het aluminium koelblokken op petrischaal en bekers passen(m) petrischaal. (B) Handmatige weefsel chopper. (a) Platform (b) snijden arm met blade-houder (c) Vernier micrometer, resolutie 10 micron. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2. Elektrofysiologie set-up voor field potentials opnames bestaande uit (A) stimulatoren (b) een differentiaalversterker (c) een analoog-digitaal omzetter (d) oscilloscoop (e) computer met acquisitie software (f) Trilling- resistente table-top (g) microscoop met> 4x vergroting (h) interface van de hersenen-slice kamer (i) een perfusie systeem voor ACSF en carbogen aanbod (j) temperatuurregelaar (k) een lichtbron (l) manipulatoren met elektrode houders. (B) Interface brain-slicekamer. (C) en (D) hippocampus plakjes in de interface kamer. (E) Roestvrijstalen elektrode verzegeld in een glazen capillair. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3. (A) Schematische weergave van een dwarse hippocampus slice en elektrode locatie gebied potentieel opname: In deze representatie twee prikkelelektroden (S1 en S2) zijn gepositioneerd in het stratum radiatum van CA1 regio te stimuleren twee afzonderlijke maar overlappende synaptische inputs naar CA1 pyramidale neuronen. Twee extracellulaire elektroden, een om veld-EPSP (excitatorische post-synaptische potentiaal) vanaf het apicale dendritische compartiment opnemen en andere somatische populatie spike nemen van de piramidecellenlichamen, bevinden zich in respectievelijk het stratum radiatum en stratum pyramidale. CA1- cornu Ammonis regio 1, CA3- cornu Ammonis regio 3, DG-dentate gyrus, SC Schaffer onderpand vezels, S1- stimulerende elektrode 1, S2-stimulerende elektrode 2. (B) Zwakke voordat sterke paradigma STC studeren: Zwak tetanization (WTET) toegepast op S1 (open cirkels) voor het induceren van vroege-LTP gevolgd door sterke tetanization (STET) S2 (dichte cirkels) en 30 min late-LTP induceren. De vroeg-LTP in S1 wordt versterkt late-LTP blijkt tagging en vastleggen interactie (n = 6) (C) zwak voor sterke paradigma cross-tagging bestuderen. Early-LTP geïnduceerd door WTET in S1 (open cirkels) gevolgd door de inductie van de late-LTD in S2 (gevulde cirkels) met SLFS na 30 min. In S1 wordt de vroeg-LTP omgezet in late-LTP durende 6 uur toont cross-tagging en capture (n = 6). Enkele pijl vertegenwoordigt zwak tetanization toegepast voor het induceren van vroege-LTP. Triplet pijlen vertegenwoordigtsterke tetanization voor het induceren van late-LTP. De gebroken pijl geeft het tijdstip waarop SLFS werd aangebracht op de representatieve synaptische input late LTD induceren. Fout balken geven de SEM. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Acute hippocampus slice is een uitstekend model voor de studie van LTP en andere functionele plasticiteit processen zoals STC en cross-capture. Het behoudt veel van de laminaire structuur netwerk van de hippocampus circuits, maakt nauwkeurige elektrodenlocaties biedt naast een open platform voor snelle neurofarmacologische manipuleren zonder bloed-hersenbarrière.

Dit artikel beschrijft de methode voor de bereiding van levensvatbare acute hippocampus plakjes van jonge volwassen ratten en ze te gebruiken om STC en cross-tagging te onderzoeken. Eerder onderzoek heeft benadrukt dat geslacht en leeftijd van de dieren zijn belangrijke factoren om te overwegen voor gebruik in elektrofysiologie studies. 27,28 Daarom jonge volwassen dieren met volledig tot uitdrukking volwassen receptor functies (mannelijke Wistarratten 5-7 weken oud) worden gebruikt. 23 Asymmetries in de verbindingen tussen de linker en rechter hippocampus zijn opgemerkt bij knaagdieren en 29grote verschillen in NMDA receptor expressie zijn gemeld en 34. We hebben het recht hippocampus gebruikt om in overeenstemming met onze eerdere LTP studies. 23,32 Maar een van de hippocampus kan zolang de consistentie wordt gehandhaafd worden gebruikt.

Zoals in elk protocol, is het zeer belangrijk om de isolatie en snijden procedures snel maar zorg dat het weefsel niet gerekt, beschadigd, droog of hypoxische voeren. De variaties in pH, temperatuur en ionische samenstelling van de oplossingen kan diepgaand effect op de levensvatbaarheid van de segmenten en de resultaten. Derhalve dergelijke variaties moeten worden vermeden. Er is waargenomen dat glutamaat receptor-afhankelijke calcium afgifte optreedt tijdens de bereidingsstappen irreversibel kunnen beïnvloeden eiwitsynthese in zenuwweefsel 35,36, 37. Handmatig weefsel snijmachines kan helpen om deze te minimaliseren door waardoor het proces zeer snel worden afgerond in vergelijking met vibraslicers. Echter, veel laboratoria ook effectief gebruiken vibraslicers met de nodige voorzorgsmaatregelen om slice levensvatbaarheid te behouden. Een andere belangrijke factor om te overwegen is de lange incubatietijd voordat de experimenten. Deze is opgemerkt erg belangrijk voor de stabiliteit in metabole toestand en kinase activatie niveaus in de plakken na de verstoring tijdens bereiding 23 veroorzaakt te bereiken zijn. Zoals stabiliteit is nodig voor de consistentie in de lange termijn opnames. We opnieuw te benadrukken van deze waarneming en suggereren de lange incubatietijd uren van ongeveer 3 uur.

Verschillende stimulatieparameters is bekend dat LTP induceert, maar de moleculaire mechanismen opgewekt telkens niet dezelfde (voor review zie 38) zijn. Dit kan de duurzaamheid en andere kenmerken van de LTP die op hun beurt invloed hebben op de resultaten van synaptische tagging en vastleggen experimenten beïnvloeden. Daarom is het belangrijk om de stimulatie paradigma en kenmerken validerenvan de uitgelokte LTP onder de voorwaarden van de uitvoerende laboratorium en consistentie.

We over het algemeen geen experimenten rekening met zeer grote presynaptische vezels volleys en met maximale fEPSPs minder dan 0,5 mV en de experimenten met substantiële veranderingen in de vezel volley tijdens de opnames ook worden afgewezen. Verder, tijdens het uitvoeren van twee-weg of drie-pathway experimenten, is het belangrijk om de route onafhankelijkheid. Dit kan met een gepaarde-puls facilitatie protocol 28 worden uitgevoerd.

Een nadeel van de interface registratiesystemen is condensvorming druppels op de elektroden tijdens de lange opname uren gevolg van de temperatuur en vochtigheid verschillen tussen de kamer en de omgeving. Deze druppeltjes moeten zorgvuldig worden uitgewist van tijd tot tijd. Anders de druppels kan druppelen op de plakjes en verstoring of zelfs verlies van signalen veroorzaken. We meestal pakken dit by vakkundig blotting de druppels geleid onder de microscoop met een slanke papieren filter lont, zonder het aanraken van de elektroden. Echter, zou de beste oplossing voor een centraal verwarmingssysteem te gebruiken, zoals het ETC-systeem ontwikkeld door de Universiteit van Edinburgh onderzoekers.

Op een afsluitende nota, diverse methoden bestaan ​​in onderzoekslaboratoria die worden gebruikt voor de bereiding van hippocampale plakken voor verschillende experimentele doeleinden. Elke procedure biedt een aantal voordelen boven de andere. Men moet de kleinste details van het protocol zorgvuldig optimaliseren om het doel van het experiment te passen. We hopen dat dit artikel helpt bij het verbeteren van een aantal aspecten van de methodologie voor het bestuderen van de late-associatieve processen zoals STC en cross-capture.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Open toegang voor deze video artikel wordt gesponsord door Cerebos Pacific Limited.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze video-artikel wordt gesponsord door Cerebos Pacific Limited. Dit werk wordt ondersteund door National Medical Research Council Collaborative Research Grant (NMRC-CBRG-0041/2013) en Ministry of Education Academic Research Funding (MOE AcRF- Tier 1 - T1-2012 Oct -02).

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
I. Dissectie-instrumenten
1. VerbandschaarKLS Martin, Duitsland21-195-23-07
B-Braun/Aesculap, DuitslandLX553R
2. Iris schaarB-Braun/Aesculap, DuitslandBC140R,
BC100R
3. BotenrondeerWorld Precision Instruments (WPI), Duitsland14089-G
4. ScalpelWorld Precision Instruments (WPI), Duitsland;500236-G
B-Braun/Aesculap, Duitsland
BB73
5. Scalpelblad#11B-Braun/Aesculap, DuitslandBB511
6. Sickle scalerKLS Martin, Duitsland38-685-00
7. Gedekte pincetB-Braun/Aesculap, DuitslandBD321R
8. Verdovings-/inductiekamerMIP Anesthesia Technologies (Nu, Patterson Scientific), OregonAS-01-0530-LG
II. ACSF-componentchemicaliën
1. Natriumchloride (NaCl)Sigma-AldrichS5886
2. Kaliumchloride (KCl)Sigma-AldrichP9541
3. Magnesiumsulfaatheptahydraat (MgSO4.7H20)Sigma-AldrichM1880
4. Calciumchloridedihydraat (CaCl2.2H2O)Sigma-AldrichC3881
5. Kaliumfosfaatmonobasis (KH2PO4)Sigma-AldrichP9791
6. Natriumbicarbonaat (NaHCO3)Sigma-AldrichS5761
7. D-Glucose anhydrous (C6H12O6)Sigma-AldrichG7021
III. Elektrofysiologische instrumenten
1. MicroscoopOlympus, JapanModel SZ61
2. TemperatuurregelaarScientific Systems Design Inc. CanadaPTC03
3. Differentiële AC-versterkerAM Systems, VSModel 1700
4. Geïsoleerde pulsstimulatorAM Systems, VSModel 2100
5. OscilloscoopRhode & SchwarzHM0722
6. Digitaal-analoog converterCambridge Electronic Design Ltd. Cambridge, VKCED-Power 1401-3
7. Interface Brain Slice ChamberScientific Systems Design Inc. CanadaBSC01
8. SlangenpompIsmatec, Idex Health & Science, DuitslandREGLO-Analog
9. Carbogen FlowmeterCole-Parmer03220-44
10. Fiber Light IlluminatorDolan-Jenner IndustriesFiber Lite MI-150
11. MicromanipulatorsMarzhauser Wetzlar, Duitsland00-42-101-0000 (MM-33)
00-42-102-0000 (MM-32)

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bliss, T. V. P., Collingridge, G. L. A synaptic model of memory: long-term potentiation in the hippocampus. Nature. 361, 31-39 (1993).
  2. Siegelbaum, S. A., Kandel, E. R. Learning-related synaptic plasticity: LTP and LTD. Current Opinion in Neurobiology. 1, 113-120 (1991).
  3. Martin, S. J., Grimwood, P. D., Morris, R. G. Synaptic plasticity and memory: an evaluation of the hypothesis. Annual review of neuroscience. 23, 649-711 (2000).
  4. Malenka, R. C., Bear, M. F. LTP and LTD: An Embarrassment of Riches. Neuron. 44, 5-21 (2004).
  5. Krug, M., Lossner, B., Ott, T. Anisomycin blocks the late phase of long-term potentiation in the dentate gyrus of freely moving rats. Brain research bulletin. 13, 39-42 (1984).
  6. Frey, U., Krug, M., Reymann, K. G., Matthies, H. Anisomycin blocks an inhibitor of protein synthesis, blocks late phases of LTP phenomena in the hippocampal CA1 region in vitro. Brain research. 452, 57-65 (1988).
  7. Otani, S., Marshall, C. J., Tate, W. P., Goddard, G. V., Abraham, W. C. Maintenance of long-term potentiation in rat dentate gyrus requires protein synthesis but not messenger RNA synthesis immediately post-tetanization. Neuroscience. 28, 519-526 (1989).
  8. Frey, U., Frey, S., Schollmeier, F., Krug, M. Influence of actinomycin D, a RNA synthesis inhibitor, on long-term potentiation in rat hippocampal neurons in vivo and in vitro. The Journal of physiology. 490 (3), 703-711 (1996).
  9. Nguyen, P. V., Kandel, E. R. A macromolecular synthesis-dependent late phase of long-term potentiation requiring cAMP in the medial perforant pathway of rat hippocampal slices). The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 16, 3189-3198 (1996).
  10. Manahan-Vaughan, D., Kulla, A., Frey, J. U. Requirement of translation but not transcription for the maintenance of long-term depression in the CA1 region of freely moving rats. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 20, 8572-8576 (2000).
  11. Frey, U., Morris, R. G. M. Synaptic tagging and long-term potentiation. Nature. 385, 533-536 (1997).
  12. Frey, U., Morris, R. G. Weak before strong: dissociating synaptic tagging and plasticity-factor accounts of late-LTP. Neuropharmacology. 37, 545-552 (1998).
  13. Redondo, R. L., Morris, R. G. Making memories last: the synaptic tagging and capture hypothesis. Nature reviews. Neuroscience. 12, 17-30 (2011).
  14. Martin, K. C., Kosik, K. S. Synaptic tagging -- who's it? Nature reviews. Neuroscience. 3, 813-820 (2002).
  15. Frey, U., Morris, R. G. Synaptic tagging: implications for late maintenance of hippocampal long-term potentiation. Trends in neurosciences. 21, 181-188 (1998).
  16. Martin, K. C. Synaptic tagging during synapse-specific long-term facilitation of Aplysia sensory-motor neurons. Neurobiology of learning and memory. 78, 489-497 (2002).
  17. Shires, K. L., Da Silva, B. M., Hawthorne, J. P., Morris, R. G., Martin, S. J. Synaptic tagging and capture in the living rat. Nature communications. 3, (2012).
  18. Ramachandran, B., Frey, J. U. Interfering with the actin network and its effect on long-term potentiation and synaptic tagging in hippocampal CA1 neurons in slices in vitro. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 29, 12167-12173 (2009).
  19. Sajikumar, S., Navakkode, S., Frey, J. U. Identification of compartment- and process-specific molecules required for 'synaptic tagging' during long-term potentiation and long-term depression in hippocampal CA1. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 27, 5068-5080 (2007).
  20. Sajikumar, S., Navakkode, S., Sacktor, T. C., Frey, J. U. Synaptic tagging and cross-tagging: the role of protein kinase Mzeta in maintaining long-term potentiation but not long-term depression. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 25, 5750-5756 (2005).
  21. Redondo, R. L., et al. Synaptic Tagging and Capture: Differential Role of Distinct Calcium/Calmodulin Kinases in Protein Synthesis-Dependent Long-Term Potentiation. The Journal of Neuroscience. 30, 4981-4989 (2010).
  22. Sajikumar, S., Frey, J. U. Late-associativity, synaptic tagging, and the role of dopamine during LTP and LTD. Neurobiology of learning and memory. 82, 12-25 (2004).
  23. Sajikumar, S., Navakkode, S., Frey, J. U. Protein synthesis-dependent long-term functional plasticity: methods and techniques. Current Opinion in Neurobiology. 15, 607-613 (2005).
  24. Villers, A., Ris, L. Improved preparation and preservation of hippocampal mouse slices for a very stable and reproducible recording of long-term potentiation. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2013).
  25. Pohle, W., Reymann, K., Jork, R., Malisch, R. The influence of experimental conditions on the morphological preservation of hippocampal slices in vitro. Biomedica biochimica acta. 45, 1145-1152 (1985).
  26. Reymann, K. G., et al. The duration of long-term potentiation in the CA1 region of the hippocampal slice preparation. Brain research bulletin. 15, 249-255 (1985).
  27. Sajikumar, S., Korte, M. Different compartments of apical CA1 dendrites have different plasticity thresholds for expressing synaptic tagging and capture. Learning & Memory. 18, 327-331 (2011).
  28. Li, Q., et al. Making Synapses Strong: Metaplasticity Prolongs Associativity of Long-Term Memory by Switching Synaptic Tag Mechanisms. Cerebral Cortex. 24, 353-363 (2014).
  29. Sajikumar, S., Frey, J. U. Anisomycin inhibits the late maintenance of long-term depression in rat hippocampal slices in vitro. Neuroscience Letters. 338, 147-150 (2003).
  30. Ishikawa, Y., Tamura, H., Shiosaka, S. Diversity of neuropsin (KLK8)-dependent synaptic associativity in the hippocampal pyramidal neuron. The Journal of physiology. 589, 3559-3573 (2011).
  31. Ishikawa, Y., Horii, Y., Tamura, H., Shiosaka, S. Neuropsin (KLK8)-dependent and -independent synaptic tagging in the Schaffer-collateral pathway of mouse hippocampus. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 28, 843-849 (2008).
  32. Sajikumar, S., Morris, R. G. M., Korte, M. Competition between recently potentiated synaptic inputs reveals a winner-take-all phase of synaptic tagging and capture. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111, 12217-12221 (2014).
  33. Navakkode, S., Sajikumar, S., Frey, J. U. The type IV-specific phosphodiesterase inhibitor rolipram and its effect on hippocampal long-term potentiation and synaptic tagging. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 24, 7740-7744 (2004).
  34. Kohl, M. M., et al. Hemisphere-specific optogenetic stimulation reveals left-right asymmetry of hippocampal plasticity. Nature. 14, 1413-1415 (2011).
  35. Frey, U., Huang, Y. Y., Kandel, E. R. Effects of cAMP Simulate a Late Stage of LTP in Hippocampal CA1 Neurons. Science. 260, 1661-1664 (1993).
  36. Erdogdu, G., Uto, A., Hossmann, K. -A. The effect of global ischemia and recirculation of rat brain on protein synthesis in vitro. Metab Brain Dis. 8, 199-206 (1993).
  37. Djuricic, B., Berger, R., Paschen, W. Protein synthesis and energy metabolism in hippocampal slices during extended (24 hours) recovery following different periods of ischemia. Metab Brain Dis. 9, 377-389 (1994).
  38. Park, P., et al. NMDA receptor-dependent long-term potentiation comprises a family of temporally overlapping forms of synaptic plasticity that are induced by different patterns of stimulation. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 369, 20130131(2014).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Cross Capture MechanismsLong Term PlasticityField EPSP RecordingHippocampal Slice PreparationStimulating Electrodes PlacementEarly LTP InductionLate LTP TransformationSynaptic Input Stimulation

Gerelateerde artikelen