Methodenartikel

Nervus Vagus Stimulatie als een Tool om plasticiteit te induceren in Pathways Relevant voor Extinction Learning

23.6K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/53032

⸱

21 augustus 2015

 ,  ,  , 
1School of Behavioral and Brain Sciences, The University of Texas at Dallas

In dit artikel

Samenvatting

Nervus vagus stimulatie (NVS) heeft ontpopt als een instrument om gerichte synaptische plasticiteit induceren in de voorhersenen tot een reeks van gedragingen te wijzigen. Dit protocol beschrijft hoe de uitvoering van VNS aan de consolidatie van de angst uitsterven geheugen te vergemakkelijken.

Samenvatting

Uitsterven beschrijft het proces van het verminderen van gedragsreacties op neutrale stimuli wanneer deze niet langer de versterking bieden die het gedrag heeft gehandhaafd. Er is een nauwe overeenkomst tussen angst en menselijke angst, en daarom kunnen studies van uitstervingsleren inzicht geven in de biologische aard van angststoornissen zoals posttraumatische stressstoornis, en kunnen ze helpen bij het ontwikkelen van strategieën om ze te behandelen. Preklinisch onderzoek heeft tot doel het uitstervingsleren te ondersteunen en gerichte plasticiteit in uitstervingscircuits te induceren om het nieuw gevormde geheugen te consolideren. Vaguszenuwstimulatie (VNS) is een krachtige aanpak die zorgt voor een strakke temporele en circuitspecifieke afgifte van neurotransmitters, wat resulteert in modulatie van neuronale netwerken die betrokken zijn bij een doorlopende taak. VNS verbetert geheugenconsolidatie bij zowel ratten als mensen, en het koppelen van VNS met blootstelling aan geconditioneerde signalen verbetert de consolidatie van uitstervingsleren bij ratten. Hier bieden we een gedetailleerd protocol voor de voorbereiding van op maat gemaakte onderdelen en de chirurgische procedures die nodig zijn voor VNS bij ratten. Met behulp van dit protocol laten we zien hoe VNS de uitsterving van geconditioneerde angstreacties kan vergemakkelijken in een auditieve angstconditioneringsopdracht. Bovendien leveren we bewijs dat VNS synaptische plasticiteit moduleert in de route tussen de infralimbische (IL) mediale prefrontale cortex en het basolaterale complex van de amygdala (BLA), die betrokken is bij de expressie en modulatie van uitstervingsgeheugen.

Inleiding

Klassieke vreesconditionering verschaft een veelgebruikt diermodel om de biologische basis van angststoornissen bestuderen. Tijdens vreesconditionering, wordt een aversieve stimulus (de ongeconditioneerde stimulus, US, bijvoorbeeld een footshock) dat in combinatie met een neutrale stimulus, zoals een toon en / of een context (de geconditioneerde stimulus, CS). Tijdens vreesconditionering, worden associaties tussen het CS en de Verenigde Staten gevormd. Uiteindelijk zal de presentatie van de CS alleen lokt een angstreactie (de geconditioneerde reactie; CR). In angst extinctie wordt de CS herhaaldelijk gepresenteerd in afwezigheid van de VS, waardoor de CR geleidelijk afnemen 1. Aldus uitsterven van geconditioneerde angst is een actief proces waarbij angstige gedragsreacties neutrale stimuli worden verzwakt wanneer ze niet meer aversieve resultaten te voorspellen. Uitsterven van geconditioneerde reacties vereist consolidatie van nieuwe herinneringen die concurreren met geleerd verenigingen. Een kenmerk van angststoornissen is ImpaIRED uitsterven 2-4. Aldus uitsterven van geconditioneerde vrees in diermodellen niet alleen een belangrijk paradigma zowel remmende leren en het gedragsmodel therapie voor menselijke angststoornissen 5,6.

Omdat er sterke overeenkomst tussen angst en menselijke angst, wordt gedacht dat deze studies inzicht in de biologische aard van angststoornissen zoals post-traumatische stress-stoornis verschaffen en helpen om strategieën te ontwikkelen voor de behandeling. Een belangrijk doel van het preklinisch onderzoek is tot uitsterven leermiddel en om gerichte plasticiteit in het uitsterven circuits induceren uitsterven leren consolideren. Nervus vagus stimulatie (NVS) is een minimaal invasieve neuroprosthetic aanpak die kunnen worden gebruikt om de strakke temporele en circuit-specifieke modulatie van hersengebieden en synapsen betrokken bij een lopende opdracht te verstrekken. Een reeks recente studies uit de groep Michael Kilgard's aan de Universiteit van Texas in Dallas hebbenaangetoond dat pairing VNS met discrete zintuiglijke of motorische prikkels (bijvoorbeeld een toon of een hefboom pull) is zeer effectief in het bevorderen van corticale plasticiteit aan tinnitus 7 te behandelen, of motorische stoornissen na een beroerte 8-10 overwinnen. Bovendien, non-contingent VNS die zich binnen een korte tijdsvenster na het leren eveneens bevordert corticale plasticiteit en verbetert geheugenconsolidatie bij ratten en bij de mens 11-13.

Gezien de rol van de nervus vagus van het parasympathische traject, is het niet verrassend dat het zou kunnen deelnemen moduleren geheugen en synaptische plasticiteit. Zeer emotionele gebeurtenissen hebben de neiging om sterker herinneringen dan niet-emotionele herinneringen te produceren. Dit is waarschijnlijk te wijten aan de invloed van stresshormonen geheugensverankering. Posttraining toediening van het stresshormoon adrenaline verbetert het geheugen consolidatie in menselijke en niet-menselijke dieren, maar adrenaline niet de bloed-hersen-barrière 14, 15 steken . Daarom moet stressgeïnduceerde adrenaline vrijkomen van de hersenen indirect invloed op het geheugen consolidatie te verbeteren. Sterke aanwijzingen dat de nervus vagus de koppeling tussen circulerende adrenaline en de hersenen kunnen zijn. Miyashita en Williams 16 vond dat systemische toediening van adrenaline toegenomen nervus vagus vuren, en verhoogde niveaus van noradrenaline in de amygdala 17. Systemische toediening van adrenaline niet verbeteren geheugenconsolidatie als β-adrenerge receptoren geblokkeerd in de amygdala 18 suggereert dat de nervus vagus speelt een rol in het traject dat emotioneel wekken ervaringen overgaat in langetermijnherinneringen.

Aldus koppelen VNS met training heeft het potentieel om de hersenen veranderingen geheugensverankering en blootstelling ondersteunen geconditioneerde signalen in afwezigheid van wapening versterkt de consolidatie van uitsterven leren bij ratten 19,20 bevorderen. Het gebruik van VNS een Hier beschrijven wesa tool om corticale plasticiteit bevorderen en het uitsterven van een geconditioneerde angstreactie vergemakkelijken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle procedures beschreven in dit protocol worden uitgevoerd in overeenstemming met de NIH Gids voor de Zorg en gebruik van proefdieren uitgevoerd en ze werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite van de Universiteit van Texas in Dallas.

1. De bouw van VNS manchetten

  1. Maak een boorgereedschap door af te zagen de scherpe einde van een 22 ½ G naald.
  2. Voer de nu stompe einde van de 22 ½ G naald over een metalen bestand meerdere malen om het te plat. Houd de naald in een hoek van 45º naar het bestand en voer het uit meerdere malen in de file terwijl draaien. Dit zal ertoe leiden dat het metaal dunner en Furl geworden binnen. VOORZICHTIG: Breng de tip van de scalpel op het afgesneden uiteinde van de naald en draai met enige neerwaartse kracht op het metaal ontplooien.
  3. Gebruik vergrootglas verrekijker voor de resterende stappen in paragraaf 1.
  4. Met behulp van een scalpel (10 of 15 mes) snijden 4 mm segmenten buis.
  5. Plaats een 4 mm segment over eenkleine boor of andere vergelijkbare vorm tool. Dit is om de slang op zijn plaats terwijl het wordt gemanipuleerd.
  6. Boor 4 gaten in de buis (figuur 1A). Gaten moeten de vier punten van een 2 mm te maken door 2 mm vierkante en schoon met geen ruwe randen moeten zijn.
    Opmerking: Het boorgereedschap moet worden geslepen (stap 1,2) om de 2 of 3 gaatjes. Moeite met deze stap is vrijwel zeker te wijten aan een boorgereedschap dat is niet scherp genoeg.
  7. Met de slang nog op de boorbeitel, een scalpel gebruikt om de slang lengte snijden tussen de gaten zodat twee gaten komen op beide zijden van de snede (figuur 1B).
  8. Met behulp van een naald en hechtdraad, langs hechtdraad door de gaten aan de rigging scheppen voor de uiteindelijke plaatsing van de manchet rond de nervus vagus. Begin met de naald in de manchet en doorgeven door een van de gaten, ga dan terug door de vulgaten van buitenaf (figuur 1C). Bind de thread tezamen ~ 2 cm uit de plastic zodat de buizen en thread een driehoek. Laat ~ 8 cm van de draad na de knoop en trim. Herhaal de werkwijze voor de gaten aan de andere kant van de snede. De buis is nu klaar om te worden aangesloten.
  9. Bereid draden voor manchetten.
    1. Knip platinum iridium draad in 70 mm segmenten.
    2. Met behulp van de beste tip voor de sieraden fakkel, maak een scherpe vlam met blauwe centrum, dat is zo verfijnd mogelijk en gebruik het om te strippen ~ 1 cm van de kunststof coating van de draad. Breng het blauw centrum van de vlam gestripte uiteinde van de draad maakt een kleine bal. Breng de blauwe centrum van de vlam tot een aantal punten van het gestripte deel aan de zeven onderdelen samen te smelten. De draad in deze plekken zal blijken te knikken.
    3. Aan het andere uiteinde van de draad, toepassen blauwe plaats van de vlam aan het einde het creëren van een kleine bal. Minimaliseren strippen van de plastic op daartoe.
  10. Draad de manchet (figuur 1D).
    OPMERKING: Steps in paragraaf 1.10 moet worden gedaan onder vergrootglas verrekijker.
    1. Tape de manchet naar beneden met de draden zodat deze wordt gericht met de gesneden die horizontaal. Trek de draden zo strak dat de manchet wordt opengetrokken en dan band naar beneden de draden.
    2. Pak de kluit einde van de gestripte kant van de voorbereide draad met # 5 pincet en duwen door onderaan rechts gat. Trek de tang uit het gat, waardoor het uiteinde van de draad in het midden van de manchet.
    3. Opnieuw grijpen de kluit einde van de gestripte kabel (nu in het midden van de manchet) aansluiten en het door de rechter opening. Trek de tang uit het gat, waardoor de kabel gevoerd volledig door de manchet en los op de bovenzijde van de manchet.
    4. Opnieuw grijpen de kluit einde van de gestripte kabel (nu buiten de manchet aan de bovenzijde) aansluiten en terug door de rechter opening van binnen. Blijven doen totdat de draad stevig op zijn plaats: test door trekken aan de andere kant van de draad.
      LET OP:Daarbij is het essentieel om de gestripte / geïsoleerde delen van de draad te onderscheiden. De draad die uiteindelijk is gelegen in het "dal" van de manchet moet verwijderd, maar alles onder de onderste gaten (buiten de manchet aan de onderkant) worden geïsoleerd. Hierdoor toediening van stroom alleen de nervus vagus.
    5. Pak de kluit uiteinde van de geïsoleerde kant en druk hem door het gat rechtsonder de binnenzijde van de manchet, een lus rond een keer.
    6. Herhaal stap 1.10.2 - 1.10.5 aan de linkerkant van de manchet, zodat twee draden uiteindelijk om de slang, een aan de rechterkant en één aan de linkerkant vast.
    7. Plaats een gouden speld in de arm van de helpende hand met het gat naar boven. Vul het gat met flux.
    8. Soldeer het geïsoleerde uiteinde van de draad (nu verbonden aan de manchet) in de pen.
    9. Laat het soldeer afkoelen en opnieuw smelten. Dit zorgt voor een goede verbinding tussen het uiteinde van de draad en de inside van de pin. Breng meer soldeer indien nodig. Herhaal dit voor de tweede draad.
    10. Met de draden loopt naar rechts, markeer de bovenkant van de manchet met permanente marker. Ook markeren de gouden speld aan de top leiden.

2. De bouw van headcap voor VNS Input Site

  1. Snijd 30 mm segmenten van 26 AWG koperdraad. Strip een klein gedeelte aan elk uiteinde.
  2. Snijd het smalle uiteinde uit losse goud pinnen en soldeer het gestripte uiteinde van de draad aan het afgesneden uiteinde van de gouden speld. Maak twee draad / pin verbindingen voor elke gewenste ingang website. Plaats een connector in de helpende handen en soldeer het draadeinde van een draad / pen verbinding aan elk van de twee vloeibaar gemaakte tanden van de connector (figuur 2G).
  3. Markeer een van de draden met Sharpie. Tijdens de operatie, de positie van het implantaat met de gemarkeerde draad rostraal van de ongemarkeerde draad.

3. VNS Surgery

  1. Maak aangepaste glazen hulpmiddelen voor het hanteren van Vagus zenuwen tijdens de operatie.
    1. Gebruik borosilicaatglas een micropipet te trekken, zodat het een lange taps toelopende tip. Als er geen pipet trekker beschikbaar is, breekt het glas om een ​​langere rand te creëren.
    2. Houd de niet-taps toelopende uiteinde van de pipet met een dikke doek (om brandwonden te voorkomen) en druk op de taps toelopende / gebroken uiteinde in een soepele brandwerende oppervlak, terwijl het toepassen van de blauwe vlam van de sieraden fakkel door aan de taps toelopende einde. Het glas zal buigen terwijl deze in het oppervlak wordt gedrukt. Van toepassing tot een haak of J vorm vormen vlam.
  2. VNS chirurgische procedures
    1. Verzamel en steriliseren alle gereedschappen. Bereid een sanitair, verwarmde chirurgische gebied.
    2. Verdoven dier met ketamine / xylazine (85 mg / kg, 5 mg / kg, IP). Beoordeel de diepte van de verdoving vliegtuig door het monitoren van geluiden van het dier en de terugtrekking-reflexen in reactie op teen en / of de staart knijpen.
    3. Scheer de bovenkant van het hoofd en linker kant van de hals dier. Bescherm ogen van het dier met een mijnwerkeral olie of oogzalf. Breng jodium reinigende oplossing met gaas en vervolgens alcohol met gaas aan de geschoren gebieden. Herhaal dit een keer.
    4. Injecteer 0,05 ml Marcaine subcutaan aan de bovenkant van het hoofd en kan de bolus te dispergeren tijdens het plaatsen van het dier in de stereotaxische apparaat.
    5. Gebruik een scalpel een insnijding in de huid van de schedel zowel lambda en bregma bloot. Bereid een pad voor de manchet met stompe tang om de subcutane tunnel incisie langs de linkerkant voor het oor aan de linkerzijde van de nek.
    6. Trek de incisieplaats geopend met hemostats. Met behulp van wattenstaafjes, van toepassing waterstofperoxide aan de blootgestelde schedel om alle resterende weefsel te verwijderen.
    7. Met behulp van een scalpel, boor twee ondiepe starter gaten in de schedel om het anker schroeven te plaatsen. Ze moeten ver genoeg om ruimte voor het implantaat mogelijk, maar mag niet te dicht aan het omringende weefsel. Vermijd het plaatsen van schroeven rechtstreeks op de middellijn.
      1. Met krachtps en schroevendraaier, rijden een bot schroef in beide gaten. De schroeven moeten stevig in de openingen, waarbij de kappen 2-3 mm boven het oppervlak van de schedel om ruimte voor acryl laten invullen onder en rond de schroeven.
    8. Vult de ruimte onder, rondom en tussen de schroeven met een kleine hoeveelheid acryl, het vermijden van de omringende weefsels. Plaats een grotere hoeveelheid acrylaat in het midden van de schedel tussen de beide schroeven.
    9. Pak het implantaat zodat de gemarkeerde draad is gericht rostraal van de ongemarkeerde draad en snel plaats het implantaat in de acryl, zorg ervoor dat u acryl krijgen in de gouden pinnen, de gesp gebied, of de input site op de top. Eenmaal gepositioneerd laten ~ 5 min stellen tot het droog. Dit kan ook worden gedaan met behulp van de arm van de stereotaxische voor ondersteuning. Vul eventuele scheuren of gaten tussen het implantaat en de schedel met een lage viscositeit mix van acryl. Laten drogen.
    10. Gebruik vergrootglas verrekijker voor de resterende stappen in paragraaf 3.2.
    11. Verwijder the dier uit de stereotaxische apparaat. Leg het dier op zijn rechterzijde, draaien lichtjes in de richting van het ventrale positie.
    12. Maak een kleine incisie ongeveer over de linker halsader. Het kaakbot en sleutelbeen moet ongeveer op gelijke afstand tot de incisie site. Verruim de incisie met stompe dissectie tot de spierlaag is bereikt. De sternocleidomastoideus, sternohyoid en omohyoid spieren moet zichtbaar zijn. Gebruik spier retractors om de site open te houden.
    13. Doorgaan stompe ontleden langs de natuurlijke groeven tussen de spieren. Kijk voor de pulserende van de halsslagader. Rubriek door de spieren in de richting van de pulserende zal de halsslagader te onthullen. Trek de spieren terug met de spier retractor. De huls met de halsslagader bevat ook de nervus vagus. Zorgvuldig stomp ontleden de schede met de schaar.
    14. Identificeer de nervus vagus. Het is de grootste zenuw van de carotis schede en is meestal opzij van de slagader van het diermaar kan worden gevonden op een kant. Schakel over naar de aangepaste glas gereedschappen en scheiden de nervus vagus van de halsslagader. De zenuw dient vrij van ander weefsel voor minimaal 5 mm.
    15. Uit de insnijding op de kop, met de schroefdraad van de zijde van de manchet tegenover de geleidingsdraden, trek de manchet door de eerder gemaakte subcutane tunnel met een tang of kleine vaatklemmen. Duw het door het weefsel in de incisie site op de hals.
    16. Til de zenuw met behulp van de glas gereedschappen en druk de schroefdraad aan de kant van de manchet tegenover de draden onder de zenuw. Trek de draden helemaal door, zorg niet te wrijven tegen de zenuw. De manchet moet onmiddellijk naast de zenuw.
    17. Zorg ervoor dat de manchet wordt georiënteerd met de gemarkeerde 'top' side superieur. Laat de zenuw in het midden van de manchet. De zenuw wordt nu over beide draden liggen in de trog van de manchet (Figuur 2B). Bind de draden samen om de manchet te sluiten.
    18. Op de headcap, steek de pennen aan de manchet in de gouden pennen op de stimulatie ingang website. Steek de gemarkeerde pin in de gouden speld verbonden aan de meest anterior tand op de simulatie-ingang plaats.
    19. Om te controleren of de manchet goed stimuleert de nervus vagus, het uitvoeren van een stopzetting van de ademhaling test door, het aansluiten van de stimulator aan de stimulering ingang site op het headcap and running stimulatie (0,2 mA, 60 Hz, tot 10 sec). Ademhaling moet kort stoppen en de hartslag moet laten vallen, het controleren van manchet functie.
    20. Bevestig de pinnen op de stimulatie ingang site met acryl. Dek de draden en controleer of blootgesteld pinnen en draden niet leiden tot kortsluiting. Gebruik acryl op glad over eventuele hobbels of in eventuele lacunes op te vullen. Laten drogen.
    21. Hechtdraad gesloten beide incisie sites. Injecteren 0,05 ml Marcaine subcutaan in de buurt van de nek incisie. Breng antibiotische zalf naar sites incisie. Optioneel, laat een mannelijke connector op zijn plaats op de stimulatie ingang sitebeschadiging of obstructie gedurende het genezingsproces te voorkomen.
    22. Behandelen met antibiotica en volg standaard post-operatieve zorg met inbegrip van passende pijnstilling. Terug dieren stallen faciliteit nadat ze te herwinnen mobiliteit. Laat 5 dagen voor herstel. Om maximale levensduur en de functie van de headcap, huis dieren zorgen afzonderlijk voor de rest van het experiment.
      OPMERKING: Sham-VNS ratten ondergaan dezelfde operatie, maar het circuit is ontworpen om een kort ter hoogte van de headcap (dwz als headcap geïmplanteerd en de nervus vagus wordt gescheiden van de halsslagader, maar geen electrode manchet is geplaatst rond het zenuw).

4. Auditieve vreesconditionering

LET OP: Deze angst conditionering protocol is intensiever dan de meeste 21 omdat het doel van deze experimenten is tot uitsterven te verbeteren. Met milde angst conditionering die gemakkelijk is gedoofd, kan een vloer effect deze verbetering te verdoezelen.

  1. Huis dieren op een 12 uur licht / donker cyclus met ad libitum toegang tot voedsel en water. Behandel dieren dagelijks tijdens het herstel van een operatie.
  2. Stel de conditionering en testapparatuur, bestaande uit een operante doos gehuisvest in een geluid verzwakt kamer (figuur 2C). De operante doos heeft doorzichtig plastic wanden, 20 x 20 x 20 cm, en heeft een roestvrij stalen roostervloer die is verbonden met een voetschok generator. Gebruik een wit huis-licht om de kamer voor video-opname te verlichten. Gebruik een 9 kHz, 85 dB SPL toon als de geconditioneerde stimulus.
  3. Record gedrag met behulp van een digitale camera zich in de kamer, boven de operante doos. Bekijk en bewaken van de sessie op een computer buiten het gedrag kamer gelegen. Sla video's voor latere analyse.
  4. Veeg kamers met 70% ethanol voor en na elke sessie om olfactorische signalen te elimineren.
  5. Angst-conditioneren de ratten gedurende 2 dagen (figuur 3A). Controleer of de ratten niet inNately bang voor de toon door de presentatie van 5 tonen (9 kHz, 85 dB, 30 sec) op de eerste dag. Zorg ervoor dat de bevriezing niveau zijn te verwaarlozen.
    1. Volg de eerste toon presentaties met 8 tone-footshock (1 sec, 0,5 mA) paren op elk van 2 opeenvolgende dagen. Herhaal de toon-footshock paringen weer op de tweede dag. Varieer de inter-stimulus-interval (ISI) tussen 2 en 4 minuten, een gemiddelde van 3 min voor elke proef. Willekeurig het punt waarop tijdens de toon de schok optreedt.
  6. Op de derde dag, het testen van de sterkte van de toon / shock vereniging. Speel 4 tinten met een ISI van 3, 4 of 5 min (4 min gemiddeld) in de afwezigheid van footshocks en noteer bevriezing gedrag van de dieren tijdens de toon presentaties en tijdens de inter-stimulus-intervallen maatregelen van de geconditioneerde angstreactie (CFR).
  7. Op dag 4, beginnen uitsterven training met VNS of Sham VNS.
    1. Steek de ratten in de stimulator door het invoegen van de mannelijke connectoren van de stimulator in de stimulatie ingang plaats. Plaats dieren in de kamer (Figuur 2A, 2C). Stel de stimulator tot 0,4 mA, 500 ps pulsbreedte bij 30 Hz. Stel kracht naar totale duur van 30,15 sec vanaf 150 msec voor het begin van de toon. Speel dieren 4 tonen (zoals in stap 4.6) en koppelen elke toon presentatie met VNS of Sham VNS.
  8. Periodiek testen van de elektrische integriteit van de manchet en input site met behulp van een oscilloscoop.
    1. Sluit het dier normaal en split de uitvoer van de stimulator naar de oscilloscoop.
    2. Stel het bereik op de oscilloscoop als -20 V tot +20 V en uitvoeren stimulatie. De golfvorm van de 30 Hz stimulatie moet zichtbaar zijn op de oscilloscoop. Stimulaties meer dan 10 V in grootte aangeven hoge impedantie en een niet goed functionerende cuff of aansluiting op het stimuleren ingang website.
  9. Om het effect van NVS op extinctie training testen uitvoeren van een tweede CFR proef (zoals in stap 4.6)op dag 5. Noteer de tijd bevriezen tijdens toon presentaties en te vergelijken met de baseline bevriezing opgenomen tijdens de eerste CFR-test (stap 4.6).
  10. Analyseer de video's met een onafhankelijke waarnemer die blind is voor de behandelingsomstandigheden. Meet tijd bevriezen tijdens toon presentaties met behulp van een stopwatch. Invriezen wordt gedefinieerd als complete immobiliteit, waarbij de rat vertoont snelle ademhaling, gebogen hoofd, en verspreid poten 22. Analyse van de bevriezing gedrag kan worden opgesplitst in twee fasen: tijdens de toon presentatie en tijdens de inter-stimulus interval.

5. In vivo Opnames van Opgeroepen gebied Potentials

Opmerking: Deze stap is optioneel. Evoked potentials veld (CFP) worden geregistreerd 24 uur na het testen van herstel (Dag 5) in isofluraan verdoofde ratten gemonteerd in een stereotaxische apparaat, volgens standaardprocedures 23,24.

  1. Verzamel en steriliseren alle gereedschappen.
  2. Induceren anesthesie met isofluraan (5% in 100% zuurstof, debiet 1l / min) in een doorzichtige plastic kamer. Beoordeel de diepte van de verdoving vliegtuig door het monitoren van geluiden van het dier en de terugtrekking-reflexen in reactie op teen en / of de staart knijpen. Gebruik minerale olie of oogzalf om de ogen te beschermen.
  3. Injecteer 0,05 ml Marcaine subcutaan aan de bovenkant van het hoofd en kan de bolus te dispergeren. Gebruik een scalpel en hemostats aan de headcap van de schedel te verwijderen. Gebruik zo weinig kracht mogelijk te vermijden verduistert bregma.
  4. Plaats het dier in de stereotaxische apparaat. Met een scalpel om de incisie zowel lambda en bregma bloot te verbreden. Handhaaf verdoving vlak met isofluraan (3% in 100% zuurstof, debiet 1 l / min) via een neuskegel.
  5. Boor gaten in de schedel boven de infralimbic prefrontale cortex (IL) en de basolaterale amygdala (BLA). Verlaag een glazen micro-elektroden (2 M KCl; 1-2 MOhms weerstand) in de BLA (D / V: 7.2, A / P: 2,7, M / L: 4,9 vanaf bregma) en een stimulation elektrode in de IL gebied van de mediale prefrontale cortex (D / V 4,6, A / P: 3,0, M / L: 0,7 van bregma) (Figuur 4A).
  6. Stimuleren van de IL om CFP in de BLA roepen. Uit figuur 4 werd verkregen met de volgende instellingen: Een stimulatiepuls van 0,3 msec, met een stimulatie-intensiteit die overeenkwam met 40% van de minimale stroomsterkte een maximum veld opgewekte respons (op basis van een input-output curve vastgesteld vóór verzamelen van basisgegevens), bezorgd om de 15 sec.
  7. Verzamel basisgegevens minimaal 10-15 min voor het induceren van synaptische plasticiteit.
    Opmerking: Het protocol dat synaptische plasticiteit oproepen zal variëren met de vereisten van de experimenten en zorgvuldig door elke experimentator worden geselecteerd. Gegevens in Figuur 4C toont veranderingen in het EFP volgende 3 uitbarstingen van 100 pulsen bij 50 Hz (2 sec), met 20 sec inter-uitbarsting intervallen op de minimale stroomsterkte die oproepend de maximale veld respons.
  8. Meet de amplitude van de EFP als het verschil tussen het gemiddelde van een 5 msec venster voordat de stimulatie artefact en het gemiddelde van een 5 msec venster ongeveer 20-25 msec na de stimulatie artefact, overeenkomend met de negatieve piek van het veldpotentiaal. Data normaliseren basislijn en stellen het gemiddelde van een 10 minuten basislijn als 100%. Gebruik de gemiddelde EFP amplitudes van nog 10 minuten periode na plasticiteit inductie (bijvoorbeeld 40-50 min na inductie) op lange termijn veranderingen in EFP amplitude bepalen.
  9. Na afloop van de opname onthoofden verdoofde dier en extraheer de hersenen. Bereid weefsel voor histologische verificatie van de plaatsing van de elektroden.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Dit gedeelte illustreert voorbeelden van resultaten die kunnen worden verkregen door VNS in combinatie met uitsterven leren de expressie van de geconditioneerde angstreactie bij ratten te verminderen. Voor Dagen 1 en 2 (Auditieve Fear Conditioning), werden ratten getraind op een auditieve vreesconditionering taak waarin footshocks werden gecombineerd met een toon. Op dag 3 (Voorbehandeling Test) werden gepresenteerd tonen in afwezigheid van footshocks invriezen te meten en afleiden geconditioneerde angstreactie verkrijg...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

We stellen hier een protocol dat wordt gebruikt om uitdoving van geconditioneerde angst tijdens een enkele sessie van blootstelling aan geconditioneerde signalen 19 vergemakkelijken en plasticiteit te moduleren in de signaalweg tussen de infralimbic cortex en de basolaterale amygdala die kunnen mediëren extinctie leren 20. Een cruciale stap voor het welslagen van dit protocol is de juiste levering van VNS tijdens uitsterven training. Daarom moet speciale aandacht worden besteed aan de constructie v...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen concurrerende belangen of conflicten.

Dankbetuigingen

Dit onderzoek werd ondersteund door het National Institute of Mental Health MH 086960-01A1 (Christa K. McIntyre).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Alcohol
AtropineFisherA0132-5G
BetadineHenry Schein69066950
Hydrogen peroxide CVS209478
KetamineHenry Schein 1129300
MarcaineHenry Schein6312615
Mineral OilCVS152355
NeosporinCVS629451
OxygenHome Depot304179
PennicillinFisherPENNA-10MU
PropaneHome Depot304182
XylazineHenry Schein4019308
Tools
Jewelery TorchSmith Equipment23-1001D
Sewing NeedleWalgreens441831
#5 Forceps (2)Fine Science Tools11254-20
Soldering IronHome Depot 203525863
AmScope SM-4TX-144A 3.5X-45X Circuit Board Boom Stereo Microscope + 144 LEDAmScopeSM-4TX-144A
Helping HandsA-M Systems 726200
Scalpel Blade HolderFine Science Tools10003-12
Metal FileHome Depot6601
RulerHome Deopt202035324
Curved Hemostats Fine Science Tools130009-12
Fine ScissorsFine Science Tools14058-09
SpatulaFine Science Tools
Small ScrewdriverHome Depot646507
Magnetic Fixator Retraction SystemFine Science Tools18200-04, 18200-01, 18200-05
Heating PadWalgreens30294
ClippersWalgreens277966
SharpieStaples125328
Ring ForcepsFine Science Tools11103-09
Custom Micropipette Glass Tools (J shape and Straight) - Borosilicate glassSutter InstrumentB150-110-10
Adson ForcepsFine Science Tools11006-12
Cuffs
TubingBraintree Scientific IncMRE-065
Platinum Iridium WireMedwire10IR9/49T
Gold PinsMill-Max1001-0-15-15-30-27-04-0
Suture ThreadHenry Schein100-5797
22 G needlesFisher 14-815-525
Paper TapeFisher 03-411-602
SolderHome Depot327793
Flux Home Depot300142
Scalpel Blade, 10 or 15Stoelting52173-10
Silastic Laboratory Tubing .51 mm ID x.94 mm ODFisher 508-002
Headcaps
Connector Pieces (male)Omnetics Connector CorporationA25001-004
Headcap pieces (female)Omnetics Connector CorporationA24001-004
Teets Dental Acrylic, Liquid and PowderA-M Systems525000, 526000
26 Gauge Solid Copper WireStaples1016882  
Surgery
Bone ScrewsStoelting+CB33:C6151457
Scalpel Blades, 10 or 15Stoelting52173-10
1 ml syringesFisher14-826-261
22 G NeedlesFisher 14-815-525
27 G NeedlesFisher14-826-48
2" x 2" GauzeFisher22-362-178
SwabsFisher19-120-472
Puppy PadsPetCo1310747
Kim WipesFisher06-666-A
Chamber and Behavioral Setting 
Husky Metal Front Base Cabinet (30WX19DX34H)Home Depot100607961
Quiet Barrier­ HD Soundproofing Material (Sheet) (PSA)soundproofcow.com10203041
Convoluted Acoustic Foam Panelsoundproofcow.com10432400
Isolated Pulse Stimulator Model 2100A-M Systems720000
Digital Camera - Logitech Webcam C210LogitechB003LVZO88
MatLabMathworks.com
Sinometer 10 MHz Single Channel OscilloscopeSinometerCQ5010C
OxyLED T-01 DIY Stick-on Anywhere 4-LED Touch Tap LightOXYLEDB00GD8OKY0
5k ohm potentiomterAlpha ElectronicsB00CTWDHIO
Extech 407730 40-to-130-Decibel Digital Sound Level MeterExtech InstrumentsB000EWY67W
DSCK-C Dual Output, scrambled shockerKinder Scientific Co

Referenties

  1. Quirk, G. J., Mueller, D. Neural mechanisms of extinction learning and retrieval. Neuropsychopharmacol. 33 (1), 56-72 (1038).
  2. Milad, M. R., Orr, S. P., Lasko, N. B., Chang, Y., Rauch, S. L., Pitman, R. K. Presence and acquired origin of reduced recall for fear extinction in PTSD: results of a twin study. J Psychiat Res. 42 (7), 515-520 (2008).
  3. Jovanovic, T., Norrholm, S. D., Blanding, N. Q., Davis, M., Duncan, E., Bradley, B., Ressler, K. J. Impaired fear inhibition is a biomarker of PTSD but not depression. Depress Anxiety. 27 (3), 244-251 (2010).
  4. Norrholm, S. D., et al. Fear extinction in traumatized civilians with posttraumatic stress disorder: relation to symptom severity. Biol Psychiat. 69 (6), 556-563 (2011).
  5. Phelps, E. A., LeDoux, J. E. Contributions of the amygdala to emotion processing: from animal models to human behavior. Neuron. 48 (2), 175-187 (2005).
  6. Pape, H. C., Paré, D. Plastic synaptic networks of the amygdala for the acquisition, expression, and extinction of conditioned fear. Physiol Rev. 90 (2), 419-463 (2010).
  7. Engineer, N. D., et al. Reversing pathological neural activity using targeted plasticity. Nature. 470 (7332), 101-104 (2011).
  8. Porter, B. A., et al. Repeatedly pairing vagus nerve stimulation with a movement reorganizes primary motor cortex. Cereb Cortex. 22 (10), 2365-2374 (2012).
  9. Hays, S. A., et al. Vagus nerve stimulation during rehabilitative training improves functional recovery after intracerebral hemorrhage. Stroke. 45, 3097-3100 (2014).
  10. Khodaparast, N., et al. Vagus nerve stimulation delivered during motor rehabilitation improves recovery in a rat model of stroke. Neurorehab Neural Re. 28 (7), 698-706 (2014).
  11. Clark, K. B., Krahl, S. E., Smith, D. C., Jensen, R. A. Post‐training unilateral vagal stimulation enhances retention performance in the rat. Neurobiol Learn Mem. 63 (3), 213-216 (1995).
  12. Clark, K. B., Smith, D. C., Hassert, D. L., Browning, R. A., Naritoku, D. K., Jensen, R. A. Posttraining electrical stimulation of vagal afferents with concomitant vagal efferent inactivation enhances memory storage processes in the rat. Neurobiol Learn Mem. 70 (3), 364-373 (1998).
  13. Clark, K. B., Naritoku, D. K., Smith, D. C., Browning, R. A., Jensen, R. A. Enhanced recognition memory following vagus nerve stimulation in human subjects. Nat. Neurosci. 2, 94-98 (1999).
  14. McGaugh, J. L. amygdala modulates the consolidation of memories of emotionally arousing experiences. Annu Rev Neurosci. 27, 1-28 (2004).
  15. McGaugh, J. L., Roozendaal, B. Role of adrenal stress hormones in forming lasting memories in the brain. Curr Opin Neurobiol. 12, 205-210 (2002).
  16. Miyashita, T., Williams, C. L. Epinephrine administration increases neural impulses propagated along the vagus nerve: Role of peripheral beta-adrenergic receptors. Neurobiol Learn Mem. 85 (2), 116-124 (2006).
  17. Williams, C. L., Men, D., Clayton, E. C., Gold, P. E. Norephinephrine release in the amygdala after systemic injection of epinephrine or escapable footshock: contribution of the nucleus of the solitary tract. Behavioral Neurosci. 112 (6), 1414-1422 (1998).
  18. Liang, K. C., Juler, R. G., McGaugh, J. L. Modulating effects of post-training epinephrine on memory: involvement of the amygdala noradrenergic system. Brain Res. 368 (1), 125-133 (1986).
  19. Peña, D. F., Engineer, N. D., McIntyre, C. K. Rapid remission of conditioned fear expression with extinction training paired with vagus nerve stimulation. Biol Psychiat. 73 (11), 1071-1077 (2013).
  20. Peña, D. F., Childs, J. E., Willett, S., Vital, A., McIntyre, C. K., Kroener, S. Vagus nerve stimulation enhances extinction of conditioned fear and modulates plasticity in the pathway from the ventromedial prefrontal cortex to the amygdala. Front Behav Neurosci. 8 (327), (2014).
  21. Maren, S. Overtraining does not mitigate contextual fear conditioning deficits produced by neurotoxic lesions of the basolateral amygdala. J Neurosci. 18 (8), 3088-3097 (1998).
  22. Blanchard, R. J., Blanchard, D. C. Crouching as an index of fear. J Comp Physiol Psych. 67 (3), 370-375 (1969).
  23. Maroun, M. Stress reverses plasticity in the pathway projecting from the ventromedial prefrontal cortex to the basolateral amygdala. Eur J Neurosci. 24 (10), 2917-2922 (2006).
  24. Moussawi, K., et al. N-Acetylcysteine reverses cocaine-induced metaplasticity. Nat Neurosci. 12, 182-189 (2009).
  25. Paintal, A. S. Vagal sensory receptors and their reflex effects. Physiol. Rev. 53 (1), 159-227 (1973).
  26. Aalbers, M., Vles, J., Klinkenberg, S., Hoogland, G., Majoie, M., Rijkers, K. Animal models for vagus nerve stimulation in epilepsy. Exp Neurol. 230 (2), 167-175 (2011).
  27. Ricardo, J. A., Koh, E. T. Anatomical evidence of direct projections from the nucleus of the solitary tract to the hypothalamus, amygdala, and other forebrain structures in the rat. Brain Res. 153, 1-26 (1978).
  28. Takigawa, M., Mogenson, G. J. A study of inputs to antidromically identified neurons of the locus coeruleus. Brain Res. 135 (2), 217-230 (1977).
  29. Groves, D. A., Bowman, E. M., Brown, V. J. Recordings from the rat locus coeruleus during acute vagal nerve stimulation in the anaesthetised rat. Neurosci Lett. 379 (3), 174-179 (2005).
  30. Manta, S., Dong, J., Debonnel, G., Blier, P. Enhancement of the function of rat serotonin and norepinephrine neurons by sustained vagus nerve stimulation. J Psychiatr Neurosci. 34 (4), 272-280 (2009).
  31. Manta, S., El Mansari, M., Debonnel, G., Blier, P. Electrophysiological and neurochemical effects of long-term vagus nerve stimulation on the rat monoaminergic systems. Int J Neuropsychoph. 16 (2), 459-470 (2013).
  32. Dorr, A. E., Debonnel, G. Effect of vagus nerve stimulation on serotonergic and noradrenergic transmission. J Pharmacol Exp Ther. 318, 890-898 (2006).
  33. Follesa, P., et al. Vagus nerve stimulation increases norepinephrine concentration and the gene expression of BDNF and bFGF in the rat brain. Brain Res. 1179 (7), 28-34 (2007).
  34. Biggio, F., et al. Chronic vagus nerve stimulation induces neuronal plasticity in the rat hippocampus. Int J Neuropsychoph. 12 (9), 1209-1221 (1017).
  35. Nichols, J. A., Nichols, A. R., Smirnakis, S. M., Engineer, N. D., Kilgard, M. P., Atzori, M. Vagus nerve stimulation modulates cortical synchrony and excitability through the activation of muscarinic receptors. Neuroscience. 189, 207-214 (2011).
  36. Peters, J., Kalivas, P. W., Quirk, G. J. Extinction circuits for fear and addiction overlap in prefrontal cortex. Learn Memory. 16, 279-288 (2009).
  37. Ji, J., Maren, S. Hippocampal involvement in contextual modulation of fear extinction. Hippocampus. 17 (9), 749-758 (2007).
  38. Roosevelt, R. W., Smith, D. C., Clough, R. W., Jensen, R. A., Browning, R. A. Increased extracellular concentrations of norepinephrine in cortex and hippocampus following vagus nerve stimulation in the rat. Brain Res. 1119 (1), 124-132 (2006).
  39. Hassert, D. L., Miyashita, T., Williams, C. L. The effects of peripheral vagal nerve stimulation at a memory-modulating intensity on norepinephrine output in the basolateral amygdala. Behav Neurosci. 118 (1), 79-88 (2004).
  40. Ura, H., et al. Vagus nerve stimulation induced long-lasting enhancement of synaptic transmission and decreased granule cell discharge in the hippocampal dentate gyrus of urethane-anesthetized rats. Brain Res. 1492, 63-71 (2013).
  41. Zuo, Y., Smith, D. C., Jensen, R. A. Vagus nerve stimulation potentiates hippocampal LTP in freely-moving rats. Physiol Behav. 90 (4), 583-589 (2007).
  42. Shen, H., Fuchino, Y., Miyamoto, D., Nomura, H., Matsuki, N. Vagus nerve stimulation enhances perforant path-CA3 synaptic transmission via the activation of β-adrenergic receptors and the locus coeruleus. Int J Neuropsychophl. 15 (4), 523-530 (2012).
  43. Fibiger, H. C., Mason, S. T. The effects of dorsal bundle injections of 6-hydroxydopamine on avoidance responding in rats. Bitr J Pharmacol. 64 (4), 601-605 (1978).
  44. Mason, S. T. Fibiger H.C. 6-OHDA lesion of the dorsal noradrenergic bundle alters extinction of passive avoidance. Brain Res. 152, 209-214 (1978).
  45. McGaugh, J. L. Memory consolidation and the amygdala: a systems perspective. Trends Neurosci. 25 (9), 456-461 (2002).
  46. LaLumiere, R. T., Niehoff, K. E., Kalivas, P. W. The infralimbic cortex regulates the consolidation of extinction after cocaine self-administration. Learn Memory. 17, 168-175 (2010).
  47. Mueller, D., Cahill, S. P. Noradrenergic modulation of extinction learning and exposure therapy. Behav Brain Res. 208 (1), 1-11 (2010).
  48. Smith, R. J., Aston-Jones, G. α(2) Adrenergic and imidazoline receptor agonists prevent cue-induced cocaine seeking. Biol Psychiat. 70 (8), 712-719 (2011).
  49. Buffalari, D. M., Baldwin, C. K., See, R. E. Treatment of cocaine withdrawal anxiety with guanfacine: relationships to cocaine intake and reinstatement of cocaine seeking in rats. Psychopharmacol. (Berl). 223 (2), 179-190 (2012).
  50. De Ridder, D., Vanneste, S., Engineer, N. D., Kilgard, M. P. Safety and efficacy of vagus nerve stimulation paired with tones for the treatment of tinnitus: a case series). Neuromodulation. 17 (2), 170-179 (2014).
  51. Hays, S. A., et al. The timing and amount of vagus nerve stimulation during rehabilitative training affect poststroke recovery of forelimb strength. Neuroreport. 25, 676-682 (2014).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Auditieve angstconditioneringinfralimbische cortexbasolaterale amygdalasynaptische plasticiteitelektrodenimplantatiechirurgische proceduregedragstraininggeheugenconsolidatie

Gerelateerde artikelen