Moleculaire Probe Optimization to Cell Sterfte Bepaal in een fotosynthetische organisme ( Microcystis aeruginosa) Met behulp van flowcytometrie

Samenvatting

Microbiële populaties bevatten aanzienlijke cel heterogeniteit, die de algehele gedrag kan dicteren. Moleculaire probe analyse door middel van flowcytometrie kan fysiologische staten van cellen te bepalen, maar de toepassing ervan varieert tussen soorten. Deze studie geeft een protocol naar cel sterfte binnen een cyanobacterie bevolking nauwkeurig bepalen, zonder onderschatten of opname vals positieve resultaten.

Samenvatting

Microbiële subpopulaties in veld en laboratoriumstudies bleek een hoge heterogeniteit in morfologische en fysiologische parameters weergegeven. Het bepalen van de actuele toestand van een microbiële cel overstijgt levende of dode categorieën, zoals microben kan voorkomen in een slapende toestand, waarbij celdeling en metabolische activiteiten verminderd. Gezien de noodzaak voor detectie en kwantificering van microben flowcytometrie (FCM) met moleculaire probes verschaft een snelle en nauwkeurige methode om te bepalen algemene levensvatbaarheid populatie. Door het gebruik van SYTOX Groen en SYTOX Oranje in het model cyanobacterie Microcystis aeruginosa te membraanintegriteit ontdekken, ontwikkelen we een overdraagbare methode voor een snelle indicatie van enkele cel sterfte. De moleculaire probes die in dit tijdschrift worden genoemd groen of oranje nucleïnezuur probes respectievelijk (hoewel er andere producten met gelijke excitatie en emissie golflengten die vergelijkbare functies hebben action, we specifiek naar de voorgrond genoemde sondes). Protocollen met behulp van moleculaire probes verschillen tussen soorten verschillen voornamelijk in concentratie en incubatietijd. Na dit protocol beschreven op M.aeruginosa de groene nucleïnezuurprobe geoptimaliseerd in concentraties van 0,5 uM na 30 min incuberen en de oranje nucleïnezuurprobe bij 1 uM na 10 min. In beide sondes concentraties lager dan hier vermeld geleid tot onder rapportage van cellen met membraanschade. Omgekeerd 5 uM concentraties en hoger in beide probes vertoonden een type niet-specifieke kleuring, waarbij 'levende' cellen die een doel fluorescentie, wat leidt tot een oververtegenwoordiging van "niet-levensvatbaar" celaantallen. De positieve controles (warmte gedode) die toetsbaar dode biomassa, hoewel de geschiktheid van controle generatie blijft onderwerp van discussie. Door het aantonen van een logische opeenvolging van stappen voor het optimaliseren van de groene en oranje nucleïnezuurprobes we demonstrate hoe een protocol dat kan worden gebruikt voor cyanobacteriën fysiologische toestand effectief te analyseren creëren.

Inleiding

De cel is een complex systeem dat continu reageert op het milieu door beïnvloeding van de fysiologische parameters en de functie ervan te veranderen. De populatie dynamica van isogene microbiële populaties zowel qua aard als het laboratorium worden beïnvloed door de ontwikkeling van subpopulaties, optredende zelfs onder betrekkelijk constante milieuomstandigheden ^{1 - 3.} De variabiliteit van natuurlijke microbiële gemeenschappen ontstaat als gevolg van de sterk variabele aard van omgevingsomstandigheden. Deze soms stochastische processen vervolgens produceren subpopulaties die zijn heel anders dan de gemiddelde bevolking. Recent bewijs is gebleken dat deze fysiologische subpopulaties verschillend reageren op milieu-omstandigheden en kan het signaal verbindingen of remmers die drastisch beïnvloeden en invloed hebben op de totale ^3,4 bevolking te produceren.

De oprichting van een methode om heterogeniteit binnen een populatie te definiëren is de sleutel tot understanding de ecologie van microben in verschillende omgevingen en is essentieel bij het ​​bouwen kennis overlast cyanobacteriën, zoals toxische Microcystis, die grote gevolgen hebben voor de menselijke waterzekerheid. Soorten zoals Anabaena morfologische heterogeniteit weergegeven in reactie op omgevingschommelingen ontwikkelen gespecialiseerde cellen zoals heterocysten en akinetes ^2. In tegenstelling, doe Microcystis cellen niet duidelijk morfologische heterogeniteit tonen tijdens een reactie op stress. Het onderscheid tussen levensvatbare en niet-levensvatbare cellen is het belangrijkste fysiologische differentiatie en maakt een beter begrip van microbiële populatie. Echter, de conceptuele probleem van de bacteriële levensvatbaarheid zelf blijft moeilijk en slecht gekenmerkt ^1,5,6.

Flowcytometrie (FCM) is een betrouwbare en snelle werkwijze voor het analyseren van afzonderlijke cellen. Om het begrip van enkele cel fysio verhogenlogie met FCM, zijn moleculaire probes werden gebruikt voor een aantal metabolische en biochemische processen ⁷ onderscheiden. Dit heeft geleid tot een grotere kennis van de soorten op cellulair en populatieniveau en op zijn beurt hielp waterbeheer ^8,9. Echter organismen verschillen in moleculaire opname en efflux probe vanwege de poriën en pompen in celwanden en membranen, die hebben geleid tot een aantal moleculaire ontwerp probe en protocolimplementatie ^6,10,11. Moleculaire probes beschikbaar voor commerciële en onderzoeksdoeleinden worden vaak voorzien van een generiek protocol die van toepassing kunnen zijn voor een heel ander celtype. Men moet zeer voorzichtig overdracht protocollen ontwikkeld één celtype tot een ander ^6, is het daarom een essentiële taak moleculaire probes optimaal effectief voor gebruik.

De groene en oranje nucleïnezuur probes binden aan zowel dubbel- en enkelstrengs nucleïnezuren met minimale base selecterentiviteit en worden gebruikt om de plasma membraan integriteit van de cellen te beoordelen. De groene nucleïnezuur probe een duidelijk verbeterde cel labeling fluorescentiesignaal vergeleken met andere moleculaire probes, zoals propidium-jodide gebaseerde verbindingen ^12, die ook kan fungeren als een indicator van de levensvatbaarheid van de cellen. De term "cell rentabiliteit" Hier neemt aan dat DNA degradatie optreedt na het verlies van plasmamembraan integriteit. De nucleïnezuurprobes zijn asymmetrisch cyaninekleurstoffen met drie positieve ladingen en kan niet cellen met intacte membranen te voeren onder gekenmerkt concentraties in zowel eukaryotische ^11,13 en ^14,15 prokaryotische organismen. De binding van een nucleïnezuur probe nucleïnezuren kunnen leiden tot een> 500-voudige toename van fluorescentie-emissie van endogene signalen in cellen die hun membraan integriteit aangetast. Hoewel moleculaire probes zoals de groene nucleïnezuurprobe een goede indicator van de enkelvoudige celfysiologie kan zijn, is er behoefte to optimaliseren elke sonde met het beoogde doel organisme, zoals incubatietijd hebben varieerden van 7 min - 30 min en concentratie varieert van 0,1 uM - 0,5 micrometer in Microcystis experimenten alleen ^15-19.

Hier presenteren we een protocol om de cytometrische analyses van groen en de relatief nieuwe oranje nucleïnezuurprobes (die tot op heden niet getest op de cyanobacteriën soort M.aeruginosa) te optimaliseren. De volgende ontwikkelde methodologie kan worden overgedragen naar andere soorten en gebruikt als een platform voor het optimaliseren van protocollen in andere moleculaire probes, waardoor het begrip van microben en ecologische gedrag verhogen.

Protocol

1. Bereiding van de Molecular Probe en Flow Cytometer

1. Verdunde voorraadoplossingen van de nucleïnezuur probes, die worden geleverd als een 5 mM oplossing in dimethylsulfoxide (DMSO) tot hoeveelheden van gewenste concentraties in ultrazuiver gefiltreerd H ₂ O.
2. Bewaar de nucleïnezuur probes in het donker tussen -5 ^{° C} en - 25 ^{° C} tot gebruik.
3. Schakel de flowcytometer en de belasting softwarepakket (zie tabel van Materialen / Apparatuur voor FCM specificaties).
4. Plaats een lege hemolyse buis (12 x 75 mm) op het monster injectiesonde (SIP), klik ontstoppen en dan terug spoelen naar de FCM reinigingsproces te starten.
   OPMERKING: Sommige monster podia voor het SIP is geschikt voor verschillende soorten slangen, waaronder microcentrifugebuisjes. De moleculaire sonde verdunner en schede vloeistof gebruikt in de FCM apparaat is van een analytische kwaliteit "type 1" 0,22 pm membraan gefilterd bron.
5. Plaatseen frisse hemolyse buis met 2 ml ultrapuur gefilterd H _{2 O} op het SIP, een tijdslimiet voor 10 - 15 min en een fluïde snelheid te snel (of een debiet van> 66 pl / min).
6. Selecteer een nieuwe data cel, op relevante drempels voor fluorescentie en lichtverstrooiing kanalen om ruis te verminderen en klik op 'run'.
7. Als de totale gebeurtenissen per seconde, zijn niet onder de aanbeveling van de fabrikant, vervolgens een 2 ml monster van decontaminatie-oplossing gedurende 2 minuten op een snelle en herhaal de stappen 1.4 en 1.5.
   LET OP: Controleer aanbevelingen van de fabrikant voor FCM start-up reiniging protocollen, omdat ze kunnen variëren tussen de modellen. Testen op specifieke drempels moet ook in overeenstemming met de FCM model zoals bepaalde apparatuur kan de gebruiker spanningen krijgt de fotomultiplier buizen (PMT's) verhogen of verlagen van het elektrische signaal geregistreerd vanaf de optische detectors toepassen. De FCM-model gebruikt in deze ervament heeft PMT voltage vast en gebruikt een drempel van 80.000 naar voren lichtverstrooiing (FSC-H) tot deeltjes kleiner dan 2,0 micrometer en elektronische ruis uit te sluiten.

2. Voorbereiding van Culturen en Initial celtellingen

1. Autoclaaf 98 ml ultrazuiver gefilterde _H2O en 2 ml algen media (x50 concentratie) in een bekerglas van 250 ml gedurende 20 minuten bij 120 ^oC
2. Uit een eerste monocultuur van M.aeruginosa (PCC 7806) in een hoge steady state dichtheid plaats 2 ml van het monster in een buis onder de SIP. Disaggregeren elke kolonievorming door vortexen of sonificatie ²⁰ en bevestig gelijkmatig verspreid cellen door lichtmicroscopie.
   OPMERKING: Overmatige blootstelling aan ultrasone golven kunnen leiden tot cellysis en moet met voorzichtigheid worden gebruikt. Sinds ultrasoonapparaat gasblaasjes kan instorten (zoals gevonden in soorten zoals M.aeruginosa) uitgangen, zoals kant lichtverstrooiing (SSC-H) intensiteit kan meer se gewordennsitive.
3. Binnen de FCM-software, selecteer een histogram plot gegevens van voorwaartse lichtverstrooiing (FSC-H) registreren en configureren van de plot specificaties door te klikken op "log" te bekijken in een log-schaal op de as.
4. In een aparte uitgang, selecteer een ander histogram (log-as) naar natuurlijke fluorescentie op te nemen, zoals de accessoire fotosynthetische pigment fycocyanine (FL4-H, 675 ± 12,5 nm), gevonden in M.aeruginosa.
5. Gebruik een lichtbron die phycocyanine en een detector die de emissies van de resulterende fluorescentie kunt een filter kunnen prikkelen.
   OPMERKING: Fotosynthetische pigment zoals chlorofyl kan enthousiast met de meest gebruikte 488 nm blauwe laser, terwijl phycocyanine is enthousiast meer dan 600 nm en zal alleen worden gedetecteerd met een rode lichtbron ^21. Neem contact op met de flowcytometers fabrikant voor excitatie lichtbronnen en de spectra van de emissie detectoren, hier zowel een 488 nm en 640 nm laser werden gebruikt samen meteen 675 ± 12,5 nm optische filter.
6. Voor het opnemen van de hoogste resolutie instellingen selecteren die het dichtst bij de kern grootte van het doelorganisme (10 pm) en een relatief lage stroomsnelheid (14 pl / min).
   OPMERKING: Voor de beste resolutie monsters moet worden uitgevoerd volgens de fabrikanten aanbeveling van de gebeurtenissen per seconde.
7. Alvorens gegevens te gebruiken een drempel naar gate uit lichtverstrooiing en / of fluorescentie signalen die worden veroorzaakt door elektronische ruis of celmonster puin.
8. Selecteer een nieuwe data cel, maken een dichtheid perceel met FSC-H en SSC-H parameters op een log schaal en op Uitvoeren.
9. Als monster dichtheid leidt tot een overmatige incidentie, kan verdunning maatregelen worden genomen om de nauwkeurigheid en precisie te verhogen.
10. Van de dichtheid perceel van toepassing software poorten van de vorige histogram te laag niveau scatter signalen, geproduceerd door achtergrondgeluiden of vuil (FSC <320.000) sluiten. Omgekeerd is de poort van de hogere relatieve fluorescentiephycocyanine signalen van cellen en alleen onder deze gebeurtenissen (FL4, 56.000 - 1.950.000).
11. Met het aantal cellen die in de afgesloten ruimtes delen door het totale volume van het monster dat is gepasseerd door de FCM te werken hoeveel cellen per ml.
    Opmerking: De FCM model hier gebruikt heeft een microprocessor gestuurde peristaltische pompsysteem waardoor monstervolume te bepalen. Andere FCM apparatuur kan een gekalibreerde kralensuspensie of een berekening van H ₂ O gewicht / volume verschillen totale monstervolume vereist verifiëren.
12. Voeg de vereiste hoeveelheid cellen aan de vers bereide media om een batch groeicyclus (250.000 cellen / ml) van M.aeruginosa starten.
    OPMERKING: Species verschillen in groei, afhankelijk van hun in-situ omgeving parameters en de beschikbaarheid van voedingsstoffen, zodat een batch cyclus moet vooraf opgenomen op life cycle fasen vast te stellen.

3. Optimordening der Molecular Probe Cel Opname

1. Oogst de helft van de M.aeruginosa kweek bereid in stap 2 van een exponentiële fase en als een 'live' control.
   Opmerking: De monsters verdund uit een hoge dichtheid kweek rechtstreeks naar een exponentiële fase kan beïnvloeden optimalisatie resultaten door dode celvernieuwing, vergeleken met die van culturen geïnoculeerd vanuit een aanvankelijke vertraging / inductiefase.
2. Bereid de andere helft als een "dode" controle door gebruik van werkwijzen zoals 70% ethanol, verwarming monsters bij 60 ^{° C} gedurende 1 uur, of paraformaldehyde 4% formaldehyde gedurende 30 min ^6,11,22. Controleer variaties in de micro monsters (bijv., PH).
   LET OP: De positieve, warmte-gedood 'dode' controle M.aeruginosa wordt onderscheiden van een 'live' monster door de daling van de phycocyanine signalen. Inducerende sterfte door andere methoden kunnen veroorzaken dezelfde output en zal vary in soorten.
3. Instellen gemengde monsters met verschillende verhoudingen van 'levende' en 'dode' samples (bijvoorbeeld 0%, 25%, 50%, 100%).
4. Disaggregeren kolonievorming door vortexen of sonificatie en controleer de pH.
5. Selecteer een 488 nm laser naast detectoren fluorescentie kunt opnemen van de groene (FL1, 530 ± 15 nm) en oranje (VT2, 585 ± 20 nm) nucleïnezuurprobes en de 640 nm laser om fycocyanine signalen op te nemen via haar respectieve detector.
   OPMERKING: Bij gebonden aan DNA, de groene nucleïnezuur probe heeft een geschatte fluorescentie excitatie golflengte van 504 nm en emissie maxima van 523 nm, terwijl de oranje nucleïnezuur probe heeft een excitatiegolflengte van 547 nm en emissie maxima van 570 nm. Een 488 nm argon ion solid state laser kan worden gebruikt voor zowel moleculaire probes wekken echter een groene laser (tot 547 nm) een hogere fluorescentie te produceren.
6. Als uitgangspunt, de invoering van demoleculaire sonde met fabrikanten aanbevolen concentratie tot de 50% 'live' en 50% 'dode' cultuur en incubeer in het donker.
7. Selecteer een nieuwe data cel, plaatst het monster onder het SIP met drempels en triggers die achtergrondgeluiden (FSC-H 80.000) zal verminderen.
8. Maak een dichtheid perceel met FSC-H en SSC-H parameters, en drie histogrammen. Een histogram met de desbetreffende moleculaire probe optische detector kanaal (FL1 of 2), een om fycocyanine emissies (FL4-H) en de andere FSC-H, allemaal op een logaritmische schaal detecteren.
9. Incubeer de monsters van M.aeruginosa met het nucleïnezuur probes in het donker voor 60 min, opnemen in afzonderlijke datacellen op verschillende tijdstippen (1, 5, 10, 15, 30 en 60 min).
   OPMERKING: Bij het ​​aanpassen van parameters zoals pH controle met produceert voor potentiële reacties van bepaalde chemische stoffen (voor de geteste nucleïnezuursondes een buffer kan niet fosfaten of hoge niveaus van monovalente of diva bevattengeleend kationen, zoals de binding met DNA wordt gereduceerd).
10. Breng een software-poort alleen de FSC-H histogram (320.000 - 1.500.000) voor de doelorganismen cel grootte, in de respectievelijke fluorescentie sonde kanaal histogram.
    Opmerking: De concentraties die in dit protocol waren 0,05, 0,1, 0,5, 1, 5, 10, 50 en 100 uM, die kan worden veranderd door ofwel verhogen of verlagen van het volume van M.aeruginosa monster of initiële voorraadoplossing van nucleïnezuur probes.
11. In de fluorescentie sonde kanaal gelden andere inclusief software poort naar de hoogste piek in het histogram (groen FL1-H, 240.000 - 1.650.000, oranje FL2-H, 30.000 - 165.000) en vervolgens de poort die positieve probe fluorescentie in de dichtheid plot.
12. Run stappen 3,1 - 3,11 bij 100% "live", 100% 'dode' en al mengcultuur monsters, het aanpassen van de concentraties moleculaire probe (bijvoorbeeld x 0,1 tot x 10) en / of de temperatuur en pH indien nodig.
13. Vergelijk het aantal positieve moleculaire probe fluorescentiesignalen de oorspronkelijke celdichtheid van "dode" cellen (uit half totale FSC-H of 100% 'dode' cultuur) om het totale percentage cellen gekleurd met het nucleïnezuur vinden probes.
14. Doe dit voor elke periode in elke concentratie om de optimale protocol voor het hoogste percentage van de cel nu- sonde opname vinden zonder dat niet-specifieke kleuring (gebruik van de middelen in een One-Way ANOVA of Kruskal-Wallis one-way variantie-analyse, als de gegevens niet-parametrische).

4. Molecular Probe Fluorescentie Discriminatie

1. Voor het testen van de fluorescentie interferentie / overlap van intrinsieke of niet-specifieke cel kleuring selecteer de 50% 'live' en 50% 'dode' gemengde cultuur data en verwijder alle poorten.
2. Breng een software-poort alleen de FSC-H histogram (320.000 - 1.500.000) voor de doelorganismen cel grootte, in de phycocyaninekanaal histogram.
3. Poort de hoogste piek en phycocyanine label 'live', met toevoeging van de laagste piek aangeduid als "dood".
4. Voer een verdere poort stap in de respectieve moleculaire probe fluorescentie histogram kanaal, via een op een moment, het 'live' en vervolgens 'dode' phycocyanine (FL4) signalen, waarop zowel de gemiddelde golflengtes.
   OPMERKING: De modus voor het induceren van sterfte in dit experiment werd gedaan door een warmtebehandeling, die op grond van dit protocol duidelijk afneemt phycocyanine signalen. Andere methoden voor het produceren van populaties van 'dode' cellen kunnen verschillende uitgangen op in de verworven runs.
5. Verhouding van de gemiddelde golflengte van de positieve moleculaire probe fluorescentie ("dode") en de intrinsieke / niet-specifiek signaal ("levende") protocol gevoeligheid te bepalen.
   OPMERKING: Om de fluorescentie van discriminatie van 'live' en 'dood' Popul verbeterenaties, verhoging van de koolstofbron actieve vlek opname van nutriënten uitgeputte cellen of ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) aan celwand permeabiliteit en verkregen fluorescentiesignalen ⁶ verbeteren. Limited compensatie bepaalde FCM modellen spectrale overlap kan worden uitgevoerd door de gebruiker gemanipuleerd paarsgewijze correctie tijdens monsterverzameling (PMT voltage verandert) of uit post-analytische gespecialiseerde software.
6. Selecteer de geoptimaliseerde protocol, waar het hoogste bedrag van de 'dode' cellen is gekleurd zonder het optreden van niet-specifieke kleuring. Als een aantal test vergelijkbare resultaten te aanvaarden van het protocol met de laagste concentratie en de incubatietijd, samen met een goede discriminatie fluorescentie signaal. Volg de instructies van de fabrikant voor de cytometer shutdown procedure.

Resultaten

Voorwaartse lichtverstrooiing (FSC) en kant lichtverstrooiing (SSC) uitgangen van een M.aeruginosa batch cultuur in exponentiële fase geeft informatie over de grootte cel (diameter) en de interne granulariteit respectievelijk (Figuur 1A). FSC kunnen cellen die te groot en / of klein M.aeruginosa te onderscheiden zijn. Deze discriminatie of gating kan door raffinage van gegevens tussen bepaalde punten van FSC uitgang (figuur 1C). Phycocy...

Discussie

Het toegenomen aantal publicaties behulp van moleculaire probes aangeeft dat betrouwbare en informatieve gegevens kunnen worden verkregen ^{5,6,8 - 15,19,22,23.} Tot nu toe is er geen perfecte vlek voor de levensvatbaarheid van de cellen die effectief kan zijn in alle soorten met dezelfde concentratie en incubatietijd ^6,10. Zelfs hetzelfde type probe met gewijzigde fluorescentie-emissie blijkt het nodig de juiste concentratie en incubatietijd (tabellen 1 en 3) va...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Cyanobacteria Media	Sigma-Aldrich	C3061-500ML	BG-11 Zoetwater geconcentreerde oplossing (x50 verdunning)
Decontaminatievloeistof	BD Biosciences	653155	Loop gedurende 2 min wanneer de uitvoer meer dan 12 gebeurtenissen per seconde op snel of een stroomsnelheid van 66 µl/min.  Gevolgd door 2 min van omhulsel H2O.
Flow Cytometer	BD Biosciences	op verzoek	BD Accuri C6
SYTOX Green	Life Technologies	S7020	Nucleinzuurvlek – 5 mM oplossing in DMSO
SYTOX Orange	Life Technologies	S11368	Nucleinzuurvlek – 5 mM oplossing in DMSO