Moleculaire Probe Optimization to Cell Sterfte Bepaal in een fotosynthetische organisme (<em&gt; Microcystis aeruginosa</em&gt;) Met behulp van flowcytometrie

Samenvatting

Microbiële populaties bevatten aanzienlijke cel heterogeniteit, die de algehele gedrag kan dicteren. Moleculaire probe analyse door middel van flowcytometrie kan fysiologische staten van cellen te bepalen, maar de toepassing ervan varieert tussen soorten. Deze studie geeft een protocol naar cel sterfte binnen een cyanobacterie bevolking nauwkeurig bepalen, zonder onderschatten of opname vals positieve resultaten.

Samenvatting

Microbiële subpopulaties in veld en laboratoriumstudies bleek een hoge heterogeniteit in morfologische en fysiologische parameters weergegeven. Het bepalen van de actuele toestand van een microbiële cel overstijgt levende of dode categorieën, zoals microben kan voorkomen in een slapende toestand, waarbij celdeling en metabolische activiteiten verminderd. Gezien de noodzaak voor detectie en kwantificering van microben flowcytometrie (FCM) met moleculaire probes verschaft een snelle en nauwkeurige methode om te bepalen algemene levensvatbaarheid populatie. Door het gebruik van SYTOX Groen en SYTOX Oranje in het model cyanobacterie Microcystis aeruginosa te membraanintegriteit ontdekken, ontwikkelen we een overdraagbare methode voor een snelle indicatie van enkele cel sterfte. De moleculaire probes die in dit tijdschrift worden genoemd groen of oranje nucleïnezuur probes respectievelijk (hoewel er andere producten met gelijke excitatie en emissie golflengten die vergelijkbare functies hebben action, we specifiek naar de voorgrond genoemde sondes). Protocollen met behulp van moleculaire probes verschillen tussen soorten verschillen voornamelijk in concentratie en incubatietijd. Na dit protocol beschreven op M.aeruginosa de groene nucleïnezuurprobe geoptimaliseerd in concentraties van 0,5 uM na 30 min incuberen en de oranje nucleïnezuurprobe bij 1 uM na 10 min. In beide sondes concentraties lager dan hier vermeld geleid tot onder rapportage van cellen met membraanschade. Omgekeerd 5 uM concentraties en hoger in beide probes vertoonden een type niet-specifieke kleuring, waarbij 'levende' cellen die een doel fluorescentie, wat leidt tot een oververtegenwoordiging van "niet-levensvatbaar" celaantallen. De positieve controles (warmte gedode) die toetsbaar dode biomassa, hoewel de geschiktheid van controle generatie blijft onderwerp van discussie. Door het aantonen van een logische opeenvolging van stappen voor het optimaliseren van de groene en oranje nucleïnezuurprobes we demonstrate hoe een protocol dat kan worden gebruikt voor cyanobacteriën fysiologische toestand effectief te analyseren creëren.

Inleiding

De cel is een complex systeem dat continu reageert op het milieu door beïnvloeding van de fysiologische parameters en de functie ervan te veranderen. De populatie dynamica van isogene microbiële populaties zowel qua aard als het laboratorium worden beïnvloed door de ontwikkeling van subpopulaties, optredende zelfs onder betrekkelijk constante milieuomstandigheden ^{1 - 3.} De variabiliteit van natuurlijke microbiële gemeenschappen ontstaat als gevolg van de sterk variabele aard van omgevingsomstandigheden. Deze soms stochastische processen vervolgens produceren subpopulaties die zijn heel anders dan de gemiddelde bevolking. Recent bewijs....

Protocol

1. Bereiding van de Molecular Probe en Flow Cytometer

1. Verdunde voorraadoplossingen van de nucleïnezuur probes, die worden geleverd als een 5 mM oplossing in dimethylsulfoxide (DMSO) tot hoeveelheden van gewenste concentraties in ultrazuiver gefiltreerd H ₂ O.
2. Bewaar de nucleïnezuur probes in het donker tussen -5 ^{° C} en - 25 ^{° C} tot gebruik.
3. Schakel de flowcytometer en de belasting softwarepakket (zie tabel van Materialen / Apparatuur voor FCM specificaties).
4. Plaats een lege hemolyse buis (12 x 75 mm) op het monster injectiesonde (SIP), klik ontstoppen en dan terug spoelen naar de FCM reinigings....

Resultaten

Voorwaartse lichtverstrooiing (FSC) en kant lichtverstrooiing (SSC) uitgangen van een M.aeruginosa batch cultuur in exponentiële fase geeft informatie over de grootte cel (diameter) en de interne granulariteit respectievelijk (Figuur 1A). FSC kunnen cellen die te groot en / of klein M.aeruginosa te onderscheiden zijn. Deze discriminatie of gating kan door raffinage van gegevens tussen bepaalde punten van FSC uitgang (figuur 1C). Phycocy.......

Discussie

Het toegenomen aantal publicaties behulp van moleculaire probes aangeeft dat betrouwbare en informatieve gegevens kunnen worden verkregen ^{5,6,8 - 15,19,22,23.} Tot nu toe is er geen perfecte vlek voor de levensvatbaarheid van de cellen die effectief kan zijn in alle soorten met dezelfde concentratie en incubatietijd ^6,10. Zelfs hetzelfde type probe met gewijzigde fluorescentie-emissie blijkt het nodig de juiste concentratie en incubatietijd (tabellen 1 en 3) va.......

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Cyanobacteria Media	Sigma-Aldrich	C3061-500ML	BG-11 Zoetwater geconcentreerde oplossing (x50 verdunning)
Decontaminatievloeistof	BD Biosciences	653155	Loop gedurende 2 min wanneer de uitvoer meer dan 12 gebeurtenissen per seconde op snel of een stroomsnelheid van 66 µl/min.  Gevolgd door 2 min van omhulsel H2O.
Flow Cytometer	BD Biosciences	op verzoek	BD Accuri C6
SYTOX Green	Life Technologies	S7020	Nucleinzuurvlek – 5 mM oplossing in DMSO
SYTOX Orange	Life Technologies	S11368	Nucleinzuurvlek – 5 mM oplossing in DMSO