Studeren Eiwit functie en de rol van veranderde eiwitexpressie door Antibody Interferentie en driedimensionale Reconstructies

Samenvatting

Het regelen van eiwitexpressie is niet alleen essentieel voor elk levend organisme, maar ook een belangrijke strategie om eiwitfuncties in cellulaire modellen te onderzoeken. Het gepresenteerde protocol toont de toepassing van antilichaaminterferentie in zoogdiercellen, inclusief primaire hippocampale neuronen, en demonstreert het gebruik van driedimensionale reconstructies bij het bestuderen van eiwitfuncties.

Samenvatting

Een strikt beheer van eiwitexpressie is niet alleen van belang voor elk organisme leven, maar ook een belangrijke strategie om proteïnefuncties onderzoeken in cellulaire modellen. Daarom recente onderzoek bedacht verschillende instrumenten om eiwitexpressie in zoogdierlijke cellijnen of diermodellen, waaronder RNA en interferentie antilichaam targeten. Terwijl de eerste strategie veel aandacht heeft verzameld gedurende de laatste twee decennia peptiden mediëren een translocatie antilichaam ladingen in celmembranen en in cellen, verkregen veel minder belang. In deze publicatie geven we een gedetailleerd protocol hoe een peptidedrager genoemd Chariot in humane embryonale niercellen en primaire hippocampale neuronen gebruiken antilichaam interferentie experimenten en de toepassing van driedimensionale reconstructies illustreren het analyseren eiwitfunctie. Onze resultaten suggereren dat Chariot is, waarschijnlijk door zijn nucleaire lokalisatiesignaal, particularly goed geschikt voor eiwitten die in de soma en de kern te richten. Opvallend bij de toepassing Chariot primaire hippocampale kweken, het reagens bleek te zijn verrassend goed door gedissocieerde neuronen aanvaard.

Inleiding

Een strakke controle van eiwitexpressie is essentieel voor elk levend organisme om haar ontwikkeling commando en te reageren op omgevingssignalen. Derhalve is een veelheid van mechanismen uitgevonden tijdens evolutie naar het expressieniveau van elk eiwit wordt gecodeerd door de applicatie nauwkeurig regelen. 20.000 genen bestaan ​​in eukaryotische cellen op elk moment van zijn leven. Die op verschillende stadia van eiwitproductie, regulerende mechanismen variëren van het beheer van chromatinestructuur, transcriptie en RNA hanteren richting posttranslationele eiwit modificaties, transport en degradatie.

Het is dan ook niet verwonderlijk dat storingen in de onderliggende moleculaire machines en veranderde eiwit expressie niveaus zijn in verband gebracht met diverse ziekten zoals kanker of een verstandelijke beperking. Inderdaad, kijkend naar de uitstaande complexiteit van neuronale ontwikkeling en zoogdier hersenfunctie, de Sensiteit van deze geavanceerde systemen om veranderingen in eiwitexpressie manifesteert zich in een aantal bekende intellectuele tekorten, waaronder de ziekte van Alzheimer en de ziekte van Parkinson (AD en PD) evenals autisme spectrum stoornissen (ASS), zoals het fragiele X syndroom (FXS). Laatstgenoemde ziekte wordt gekenmerkt door een uitgebreide misexpression van een verscheidenheid van eiwitten, die door het verlies van een enkele translatie regelende proteïne, FMRP (fragile X mental retardation proteine) ^1-4. Bovendien chromosomale herschikkingen die de variabele kosten X-gebonden eiwit A (VCXA), een eiwit dat mRNA stabiliteit en de vertaling door het modificeren van mRNA aftopping ⁵ beheert, zijn onlangs in verband gebracht met een mentale achterstand, terwijl puntmutaties niet bij patiënten die werden geïdentificeerd met cognitieve beperkingen vanaf nu ^{6, 7,} wat erop wijst dat de waargenomen mentale stoornissen afkomstig VCXA veranderde expressie en ontregelde expressie van het doelwit proteins. In lijn met deze bevindingen van een onderzoek naar de vraag of de novo copy number variations genen geassocieerd zijn met ASS vastgesteld dat nieuw gen duplicaties en deleties zijn een belangrijke risicofactor voor ASD ^8, dus het idee dat verhoogde of verminderde eiwit expressie niveaus kan leiden tot het ondersteunen van intellectuele tekorten.

Opmerkelijk is verder recent onderzoek aangetoond dat het expressieniveau van een bepaald eiwit nauwkeurig aangepast zijn aggregatie als gevolg van grote hoeveelheden eiwit voorkomen vrijwel zonder veiligheidsmarges ^9. Daarom is voorgesteld dat zelfs kleine stappen volstaan ​​om ziekten zoals AD en PD ⁹ induceren. Hoewel de verscheidenheid van de moleculaire machines die bijdragen aan eiwit expressie controle suggereert een complexe regelgeving systeem in het licht van deze bevindingen, een onderzoek naar de expressie van meer dan 5.000 zoogdiergenen ¹⁰ aangetoond datde natuur de voorkeur aan een meer spaarzame regeling: De cellulaire overvloed aan eiwitten werd aangetoond dat voornamelijk worden geregeld op het niveau van de vertaling ^10, dus illustreren dat het beheer van RNA beschikbaarheid dient voornamelijk te fine-tunen eiwitexpressie.

Het bestuderen van de dosis van proteïnen (POI's) is dus niet alleen belangrijk voor het begrip van de endogene functie van een eiwit, maar ook om het onderzoek van vele ziekten en de ontwikkeling van therapieën. Zo hebben de laatste decennia is de opmars van verschillende strategieën door middel van RNA interferentie om POI dosering te manipuleren gezien. Hoewel RNA interferentie veel gebruikt om eiwitfunctie te bestuderen en zelfs in klinische proeven worden toegepast voor de behandeling van kanker of oculaire ziekten en antivirale therapie bij patiënten ^11-13 oefenen, kan een aantal problemen voordoen die de strategie onmogelijk zouden maken. Bijvoorbeeld, het zaad sequentie die de knockdown aandrijft door homologie vergelijkbaarheidble kort, dus het bevorderen van off-target effecten. Aangezien zeer efficiënt sequenties zijn zeldzaam en moeten worden gevonden tussen duizenden opties (besproken in ^14), het identificeren van de juiste volgorde kan tijdrovend en kostbaar, maar de resultaten kunnen nog steeds teleurstellend.

Een andere mogelijkheid is direct gericht op de NP op antilichamen. Hier illustreren we het gebruik van de eiwitdrager Chariot (geproduceerd door Active Motif) om cellulaire beschikbaarheid eiwit te verminderen, en de tewerkstelling van driedimensionale reconstructies eiwit functie na knock-down te bestuderen.

De actieve motief van Chariot, zelf een 2,8 kDa peptide wordt gebruikt shuttle peptiden, eiwitten en antilichamen in membranen van zoogdiercellen ^15. Het peptide associeert met POI's door het vormen van niet-covalente wijze gekoppeld macromoleculaire complexen met behulp van hydrofobe interacties, waarna Chariot-POI complexen worden geïnternaliseerd in cellen in een endosoom-independent manier. Belangrijker Chariot werd aangegeven geen invloed op de intracellulaire lokalisatie van shuttled eiwitten, noch cytotoxische effecten uitoefenen of de biologische activiteit van de lading ¹⁵ beïnvloeden.

Protocol

1. Voorraadoplossingen

1. Resuspendeer de gevriesdroogde actieve motief poeder in steriel H ₂ O tot een eindconcentratie van 2 ug / ul. Tik zorgvuldig te mengen.
2. Bereid kleine hoeveelheden (bijvoorbeeld 12 pi elk 2 pl vereist per reactie) en bewaar ze bij -20 ° C.

2. Bereiding van Cellen

1. Seed zoogdiercellen zoals HEK293 cellen of primaire neuronen op een plaat met 24 putjes in 500 ul groeimedium waaronder antibiotica.
   LET OP: Bij het gebruik van neuronen, het zaad van de cellen bij lage dichtheid en alleen gebruik maken van de twee middelste rijen van de 24 wells plaat. Elk goed zal dus een lege tegenhanger van het medium haven tijdens incubatie (stap 4.2). Bij het hanteren van neuronen, er altijd voor zorgen dat de cellen niet buiten de incubator worden gehouden voor meer dan een paar minuten.
2. Kweken van de cellen bij geschikte omstandigheden (bevochtigd, 5% _CO2 en 37 ° C) tot de cellen app. 50%confluent.
   NB: Bij gebruik van neuronen, de cultuur van de cellen tot het gewenste ontwikkelingsstadium wordt bereikt en app te wijzigen. 25-50% van het medium tweemaal per week. Medium: Neurobasal medium (bestaande uit 1x B27, 5 mM L-glutamine en 1x penicilline en streptomycine; vergelijken met ref 16).

3. Chariot Complex Formation

1. Per reactie verdund 0,1-2 ug van de POI of de overeenkomstige antilichaam en het controle-eiwit of controle antilichaam, respectievelijk in 50 pl PBS.
   LET OP: De techniek werkt ook met macromoleculaire complexen, bestaande uit pre-gebonden primaire en secundaire antilichamen (cp 'Representatieve resultaten ", figuur 1.). Mix en spin.
2. Voor elk monster, verdund 2 pi Chariot voorraadoplossing in 50 pl PBS gebruik van afzonderlijke buizen om zelfassociatie van Chariot voorkomen. Mix en spin.
3. Breng de verdunde POI of antilichaam (stap 3.1) naar de Chariot verwatering door pipetTing. Mix en spin.
4. Incubeer het mengsel gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur (Chariot POI-complexen zullen vormen).

4. Transfectie van cellen

1. Verdun de Chariot complexen (stap 3,4) in 100 ul voorverwarmde groeimedium (37 ° C, zonder toevoegingen). Verwijder het medium en de cellen eenmaal te wassen met behulp voorverwarmd 1x PBS.
   OPMERKING: Bij het gebruik van neuronen, hoeft het medium niet weg, zal het worden hergebruikt. Houd het bij 37 ° C. Voor het wassen Gebruik PBS bevattende 0,5 mM _MgCl2 en _CaCl2.
   Suggestie: houd het medium in lege putten, terwijl incubatie van de plaat (stap 4.5).
2. Breng de Chariot complexoplossing (stap 4,1) aan de cellen en rock de cellen zachtjes te zorgen voor een gelijkmatige verdeling van de oplossing. Kweek de cellen onder standaardomstandigheden (stap 2,2) gedurende 1 uur. serum aan een eindconcentratie van 10%. Bij gebruik neuronen, voeg het medium van stap 4,1. Groeien de cellen gedurende 1 tot 2 uur.
   Merk opoptimale incubatietijd afhankelijk van de grootte en de eigenschappen van de lading en moet deze empirisch worden aangepast. De volgende suggesties kunnen als leidraad dienen: Voor peptiden, 1 uur is meestal voldoende, voor eiwitten 1-2 uur worden aanbevolen, op antilichamen 2 uur, en voor de transfectie van neuronen met antilichamen 4 uur.
3. Werkwijze cellen voor analyse zoals gebruikelijk. Let op: de techniek is compatibel met experimenten met fixatie-protocollen en live imaging.

5. Imaging

1. Met behulp van een laser scanning microscoop neemt z-stapels van cellen en / of celcompartimenten plaats via circa 0,25-0,5 urn afstand. De precieze afstandslaag afhankelijk van de grootte van de structuur te reconstrueren en moet individueel bepaald.

6. Wederopbouw

1. In de volgende stappen, gebruik maken van de Esc bodem om te schakelen tussen Select en Navigeren, Cntr om meerdere objecten te selecteren door te klikken on hen en Shift-toets ingedrukt te snijden objecten (cp. stap 6.10).
2. Open het LSM-bestand in Imaris.
3. Met behulp van de aanpassing van de weergave voor elk kanaal, het contrast van de foto tot de helderste structuren te bereiken verzadiging. Houd er rekening mee dat deze aanpassing heeft geen invloed op het oppervlak bouw, het alleen dient om de onderzoeker te helpen bij drempelvorming het beeld.
4. Klik op het icoon toevoegen Surfaces. Een wizard wordt geopend.
5. Selecteer: Segment slechts een Region of Interest. Ga door naar de volgende stap.
6. Stel de marge van de selectie box om uw object van belang past. Gelieve er rekening mee dat het beeld heeft 3 dimensies en dat de selectie moet worden aangepast aan de z vliegtuig ook. Als de rechthoekige vorm van de selectie box het voorwerp van belang niet goed zou overeenkomen, zet het object en / of vergroten van de doos totdat alle vereiste structuren zijn ingebed. Ongewenste voorwerpen kunnen later worden verwijderd (cp. Stap 6.10). Doorgaan.
7. Selecteer de juiste chAnnel. De oppervlakte Detailniveau of bol diameter moet worden ingesteld op overeenkomen met de structuren wordt gereconstrueerd. Afhankelijk van het signaal kenmerken, kan zowel Absolute Intensity of Local Contrast worden gebruikt. In het algemeen, Local Contrast werkt beter voor diffuse signalen. In elk geval moeten de instellingen worden afzonderlijk voor elk signaal of de structuur van belang respectievelijk aangepast.
8. Met behulp van de Thresholding gereedschap, reconstrueren de structuur van belang.
9. Voltooi de reconstructie door te klikken op de groene pijl onderaan.
10. Pas het object verder met behulp van het potlood te snijden en oppervlakken te verwijderen indien nodig. Het is alleen mogelijk om de afbeelding in noord-zuid richting gesneden, dus kantelen om het gewenste object te snijden.
11. Het verkrijgen van metingen van volume, oppervlakte en intensiteiten voor elk oppervlak door het selecteren van Statistiek, gedetailleerde statistieken en gemiddelde waarden.
12. (Optionele stap) Om kleurcode statistieken observeren (cp. Figuur 2E en F), selecteert u het tabblad kleur van het betreffende oppervlak en markeer 'Statistiek Coded' in plaats van 'Base'. Verschillende opties worden weergegeven.

Resultaten

In de volgende paragrafen, voorbeeldige resultaten ter illustratie van een functionele knock-down van een POI (Simiate, voor meer informatie zie ^{16, 17)} met behulp van Chariot reagens en interferentie antilichaam worden gepresenteerd. De resultaten tonen aan dat verminderde expressie van Simiate schaadt transcriptionele activiteit en, in een dosering afhankelijke wijze induceert apoptose, culminerend sterftecijfer van meer dan 99% of hoger antilichaam hoeveelheden (> 1 ug antilichaam)...

Discussie

Hier presenteren we een protocol om het belang van proteïne expressieniveaus bestuderen regelen cellulaire functies in een dosis aangedreven wijze. De beschreven protocol zorgt voor een verfijnde manipulatie van eiwitexpressie in zoogdierlijke verschillende celtypen, waaronder hippocampale neuronen, dus het vergemakkelijken van gedetailleerde studies eiwitfunctie op celniveau.

Hoewel RNA interferentie een bekende strategie om neerwaarts reguleren POI vertegenwoordigt, heeft zijn nadelen (cp....

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Chariot	Active Motif	30025	bewaar bij -20 °C
Neurobasal medium	Life technologies	21103-049	opwarmen tot 37 °C voor gebruik
1x B27	Life technologies	17504044	bewaar bij -20 °C
L-glutamine	Life technologies	25030-149	bewaar bij -20 °C
Penicillin en Streptomycin	Life technologies	15140-122	bewaar bij -20 °C
Imaris software	Bitplane	n.v.t.	duur, maar ongeëvenaard
Laser Scanning Microscope	Zeiss	n.v.t.