Traditionele hoofdfixatietechnieken hebben metalen frames gebruikt die aan de schedel zijn bevestigd als een interface voor hoofdfixatieapparatuur. Dit protocol demonstreert een frameloze, op acrylhars gebaseerde hoofdfixatietechniek voor gedragstaken bij knaagdieren.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Acrylhars Molding Based Head Fixatie Techniek in Knaagdieren
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Hoofdfixatie is een techniek om het hoofd van een dier te immobiliseren door een hoofdpost op de schedel te bevestigen voor stijve klemming. Traditionele hoofdfixatie vereist chirurgische bevestiging van metalen frames op de schedel. De bevestigde frames worden vervolgens geklemd op een stationair platform, wat resulteert in immobilisatie van het hoofd. Echter, metalen frames voor hoofdfixatie zijn technisch moeilijk te ontwerpen en te implementeren in een algemene laboratoriumomgeving. In deze studie bieden we een nieuwe methode voor hoofdfixatie. Met behulp van een op maat gemaakte hoofdfixatiebar wordt de hoofdmontage tijdens de implantatiechirurgie geconstrueerd. Na het aanbrengen van acrylhars voor het bevestigen van implantaten zoals elektroden en canule op de schedel, worden extra harsen erop aangebracht om een mal te bouwen die overeenkomt met de poort van de fixatiebar. De gevormde hoofdmontage dient als geleidingsrails, onderzoekers fixeren het hoofd van het dier gemakkelijk door de hoofdmontage in de poort van de fixatiebar te plaatsen. Deze methode kan gemakkelijk worden toegepast als implantatiechirurgie met tandheelkundig acryl noodzakelijk is en kan nuttig zijn voor laboratoria die geen CNC-bewerkte metalen hoofdposten gemakkelijk kunnen fabriceren.
Inleiding
Head fixatie of het hoofd fixeren is een techniek immobiliseren kop van het dier door het bevestigen van een frame of plaat op de schedel voor starre klemmen. De techniek is aangenomen voor een nauwkeurige zintuiglijke prikkeling, gedrags detectie met of zonder neurale opname in wakkere dieren 1-3 en voor juxtacellular etikettering tijdens de slaap-waak cyclus 4. Het wordt ook gebruikt voor in vivo beeldvorming van de hersenen 5,6. Nu hoofd fixatie techniek is een veel gebruikt instrument in de neurowetenschappen en gedragsonderzoek.
Kortom, de traditionele hoofd fixatie vereist chirurgische bevestiging van metalen kop-berichten op de top van de schedel 6-8. De bijlagen worden vervolgens geklemd aan een vast platform, resulterend in immobilisatie van de weg. Neurofysiologische onderzoek in wakkere dieren zoals neurale en / of optische registratie, hersenenschakelschema interventie wordt brain imaging gepaard met implantatiechirurgie behulp tandheelkundige acrylics. Daaromhet lijkt een eenvoudige taak uit te voeren het hoofd fixatie in deze laboratoria als het experimenteel noodzakelijk. De frames moet worden ontworpen om lichtgewicht en klein genoeg zijn natuurlijke gedrag van dieren is niet te storen in hun kooien. Het biedt ook de mechanische stijfheid als vastgeklemd aan de stationaire platform. Het heeft verder biocompatibiliteit afhankelijk experimentele doeleinden. Daarom is het technisch moeilijk te ontwerpen en fabriceren zoals head-berichten in algemene laboratoriumuitrusting.
In deze studie wordt een nieuwe hoofd fixatie methode beschreven, die mechanische stijfheid via handige klemming zonder metalen kop-berichten. Met de werkwijze kan het hoofd fixatie worden uitgevoerd onder algemene laboratoriumomstandigheden, waarbij implantatiechirurgie meestal uitgevoerd in knaagdieren hersenen studie. De metalen kop-berichten worden vervangen door acrylhars cement gedeeltelijk gevormd door een op maat gemaakt hoofd fixatie bar en het gietproces wordt gedaan tijdens Implantatie chirurgie. De fixatie bar biedt een hoge ruimtelijke compatibiliteit met andere implantaten zoals neurale opname probes, stimulatie-elektroden. Ook vereenvoudigt stappen vastklemmen hoofd van het dier op de bevestiging platform door het verwijderen van de schroef-bevestiging. We gebruikten deze methode in het eerder gedragsonderzoek en concludeerden wij dat deze werkwijze gemakkelijk te implementeren en geschikte praktische experimenten 9.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Ethiek Verklaring:
Dit experiment werd goedgekeurd door de Kyungpook National University Institutional Animal Care en gebruik Comite, en werd uitgevoerd volgens de Gids voor de Zorg en gebruik van proefdieren (National Institute of Health, 1996). Na het experiment werden de dieren opgeofferd onder kooldioxide euthanasie.
1. Ontwerp van het hoofd-fixatie Bar voor ratten
OPMERKING: Deze stap is een algemene richtlijn voor een fixatie bar design. Elke wijziging van de afmeting en materiaal mogelijk afhankelijk van dieren of implantaten. Het ontwerpen van een head-fixatie bar met behulp van CAD-software wordt aanbevolen maar niet noodzakelijk.
- Gebruik CAD-software naar een fixatie bar te ontwerpen.
- Ontwerp een fixatie bar een rechthoekige vorm (123 x 35 x 6 mm) (Figuur 1A). Voeg een rechthoekige inkeping (16 × 20 mm; poort) in het midden van de fixatie bar. Hellingen of inkepingen toevoegen which dienen als een geleiderail aan de grenzen van de haven (figuur 1A-a, Figuur 1B -arrows).
OPMERKING: Zorg ervoor dat het gebied van de haven heeft betrekking op de geschatte rechthoek van de schedel rat over de hersenen om verticale toegangen staan met behulp van een stereotaxische manipulator om de meeste van de hersenen gebieden via een craniotomie. - Bevestig platen (50 x 20 x 6 mm) met twee langwerpige gaten verankering aan beide zijden van de fixatie bar. Zorg ervoor dat deze openingen passen schroeven van 6 mm diameter (figuur 1A-d). Een gat met een diameter van 3 mm voor de poort voor een grendelhaak (Figuur 1A-B).
- Voeg een doos met een bodem (135 x 305 mm) en zijwanden (305 x 76 mm). Boor twee gaten 6 mm diameter zoals getoond in Figuur 1A (inzet). Voeg ondersteunende muren op de fixatie balk (Figuur 1A-e).
- Ontwerp een fixatie bar een rechthoekige vorm (123 x 35 x 6 mm) (Figuur 1A). Voeg een rechthoekige inkeping (16 × 20 mm; poort) in het midden van de fixatie bar. Hellingen of inkepingen toevoegen which dienen als een geleiderail aan de grenzen van de haven (figuur 1A-a, Figuur 1B -arrows).
- Vervaardigen de ontworpen bar en doos en assembleren van elk van hen met behulp van cyanoacrylaat alsfiguur 1A (inzet). Monteer de bar op de doos met behulp van schroeven van 6 mm diameter. Solliciteer helling door het aanpassen van de schroef positie van de bar voor een ergonomische hoofd fixatie (Figuur 1A-inzet).
Opmerking: Voor muizen, de afmeting van de fixatie balk 60 × 20 × 4 mm (bestaande uit twee lagen van 2 mm dik acrylpanelen). De poort is vierkant van 8 mm breedte (boven) en 9 x 10 mm (lager) zoals getoond in figuur 1C. Verankering platen zijn van dezelfde grootte van de ratten '. De doos plaat en de zijwanden zijn respectievelijk 100 × 72 mm en 100 × 50 mm,.
2. Hoofd Mounter Bouw tijdens implantatiechirurgie
LET OP: Wees voorzichtig bij het omgaan met tandheelkundige acryl. Vloeistof kan huidirritatie veroorzaken. Zet op een masker en handschoenen dragen. Werk in een goed geventileerde ruimte.
- Voorbereiding voor de operatie
- Wikkel de grens van de haven van de fixatie bar met aparaffin film om de hechting van de toegepaste acrylhars de lat te voorkomen (zie Figuur 1B en Figuur 2A). Coat de grens van de poort waarop het paraffine film met een dunne laag kunsthars.
- Gebruik gesteriliseerd chirurgische instrumenten. Grondig desinfecteren stereotaxische frame en de omliggende met 70% ethylalcohol.
- Voeren stereotaxische implantatie chirurgie
- Verdoven een dier door intraperitoneale injectie van een cocktail mengsel (2 ml / kg) van 10 ml ketamine (50 mg / ml), xylazine hydrochloride 1,5 ml (23,32 mg / ml) en zoutoplossing 2,5 ml. Bevestigen dat het dier volledig verdoofd en niet reageert op de staart en teen knijpt. Injecteer cocktail mengsel van 1 ml / kg tijdens de operatie indien nodig.
- Fix het dier aan de stereotaxische apparaat. Breng oogzalf op de ogen tot droog tijdens een chirurgische ingreep. Scheren en reinigen van de hoofdhuid met 70% ethanol. Geef subcutane injectie van 2% lidocaïne en incise de SCAlp langs de middellijn van de schedel. Volledig afschrapen beenvlies. Spoel met een zoutoplossing meerdere malen.
- Maak braam gat boren in de buurt van de rand van de schedel. Implantaat schroeven 4-5 bochten (tot 1 mm diepte) van de schedel oppervlak om een schending van de dura mater te voorkomen. Zorg ervoor dat er geen lekken van CSF en bloed op de schedel oppervlak nadat schroef implantatie. Spoel met een zoutoplossing en droog de schedel oppervlak met lucht-puff, vooral rond de schroeven.
- Coat schedel oppervlak met een dunne laag "dental lijm (Super-Bond C en B)". Niet volledig bedekken het oppervlak van de schedel, inclusief de bregma als extra elektrode implantatie is gepland. Gebruik de bregma voor het markeren craniotomy coördinaten. Implantaat elektroden en / of microdrive en bevestig het op de schedel door het aanbrengen van kunsthars omheen.
- Breng extra acrylhars bovenop het tandheelkundig cement. Gebruik de juiste hoeveelheid kunsthars om voldoende fill-out ruimte tussen-bar gecoate hars een verlatend eerste montage hars wanneer fixeren van de schroeven en / of elektroden (Figuur 2A).
- Plaats het hoofd-fixatie bar 5 mm of meer boven de schedel oppervlak en lijn het midden (Figuur 2A -Links).
- Breng acrylhars in de spleet tussen de basis van de schedel en de eerste montage harsen. (Figuur 2A -Center). Wacht totdat de hars moeilijk geworden.
- Verwijder oor-bar en trek de gevormde mounter uit de fixatie bar poort. (Figuur 2A -Right). Gelden aanvullende acrylhars zorgvuldig rond de rand van de rails gevormde mounter indien nodig.
- Spoel het wondoppervlak van de hoofdhuid met steriele zoutoplossing. Injecteer een antibioticum (enrofloxacine, 5 mg / kg sc) en een analgeticum (butorphanoltartraat, 2 mg / kg sc) onmiddellijk na de operatie. Huisvesten het dier individueel in één kooi.
3. habituating Dieren naar Head-fixatie
Opmerking: deze stap deschriftgeleerden gewenning schema gebaseerd op empirisch succesvolle evaluaties auteurs. Voor een overzicht van gewenning procedure voor head-fixatie, zie Schwartz 10 of Guo's 11 werk.
- Geef voldoende herstelperiode (een week of meer) dieren. Op dag 1, Handvat dieren vaak op verdeelde korte sessies.
- Op de volgende dag (dag 2), bloot het dier naar de fixatie milieu (kader). Steek nooit het hoofd mounter in de haven van de fixatie bar. Verlaat dieren om te wennen aan de omgeving te krijgen. Stevig pak het hoofd mounter met de hand voor 1 tot 2 seconden en laat het onmiddellijk. Herhaal korte termijn fixatie hand-grab meerdere malen.
- Op dag 3, wennen dieren hoofd-fixatie.
- Breng dieren uit het huis kooien en vestigen ze in het vak regisseren hoofden naar de haven van de fixatie bar. Pak het hoofd mounter en steek deze in de haven van de fixatie bar.
- Bind de mounter (dierhoofd) naar de vergrendeling haak van de fixatie bar met een rubberen band. Staan voor 5 min.
OPMERKING: de stam of de staart van het dier na fixatie, die het dier leidt tot piepen en strijd toenemende spanning dier niet aan. Als het dier blijft worstelen meer dan 1 min, laat hem los en probeer het later. Vanaf deze stap, dieren tonen urine en ontlasting uitgescheiden wanneer blootgesteld aan het hoofd fixatie maar dit geleidelijk wordt verlaagd als gewenning verloopt. - Haal de vergrendeling rubberen band en uitwerpen van de mounter uit de haven. Zet de dieren terug naar de kooi en een stuk van graan of een zonnebloemzaad in de kooi als een beloning. De volgende proef begint in 30 min. Herhaal 3.4.1 naar 3.4.4 vijf of meer binnen een dag.
- Op dag 4 tot 7, bloot het dier aan het hoofd fixatie zoals beschreven in protocol 3,4. Geleidelijk verhogen van de duur van het hoofd fixatie (10 min, 20 min, 30 min en 50 min als gewenning opbrengsten).
LET OP: Als dieren doen geent voeden de voedsel beloning, het kan een teken zijn van een hoog niveau van stress. Niet verhogen de fixatie tijd. Als dieren herhaalde worstelen gedrag, wennen ze voor een langere periode. - Controleer dagelijks lichaamsgewicht dier. Beschouw mislukte gewenning bij lichaamsgewicht afneemt. Overgaan tot gedragsproblemen taken met hoofd fixatie na een succesvolle gewenning.
OPMERKING: Succesvolle gewenning faciliteert daaropvolgende gedragstraining (figuur 3E en F).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Deze kop fixatie methode is van toepassing op zowel ratten en muizen. Total acht ratten kregen bilaterale implantatie van het stimuleren van elektroden in het mediale voorhersenen bundel. Voor vier van hen werden op maat gemaakte wolfraam draad elektroden (microdrives) bovendien geïmplanteerd in de M1 voorpoot gebied (figuur 2C). Voor muizen (n = 2), vier roestvrij stalen elektroden werden geïmplanteerd in frontale / occipitale corticale gebieden. Tijdens de operatie werden head mounters gevormd voor he...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Dit protocol toont een eenvoudige en handige methode voor hoofdfixatie met behulp van materialen die ter beschikking zijn. Voor een fysiek succesvolle hoofdfixatie zijn de eerste cruciale stappen tijdens de chirurgie om het schedeloppervlak duidelijk te spoelen en te drogen voordat de tandheelkundige adhesieve harscement wordt aangebracht. Ten tweede maakt deze methode geen gebruik van schroeven die onder de temporale spieren worden geïmplanteerd en is alleen afhankelijk van de schroeven op de schedel, hun loodrechte imp...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Dit onderzoek werd ondersteund door het Basic Science Research Program via de NRF, gefinancierd door het Ministerie van Onderwijs, Wetenschap en Technologie (2010-0022362) en (2012R1A2A2A02046812).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Dental acrylhars | Lang Dental Manufacturing | Ortho-Jet | om gegoten bevestiging te maken |
| Paraffine film | Bemis | Parafilm | om hechting van acrylhars aan de staaf te voorkomen |
| Tandheelkundig kleefmiddel | Sun Medical | Super-Bond C&B | om te hechten tussen acrylhars en schedel |
| Plexiglas of andere acrylplaat | om bevestigingsstaaf en doosplatform te maken | ||
| Cyanoacrylaat | om acrylplaten te hechten |
Referenties
- Mayrhofer, J. M., et al. Novel two-alternative forced choice paradigm for bilateral vibrotactile whisker frequency discrimination in head-fixed mice and rats. J Neurophysiol. 109, 273-284 (2013).
- Bryant, J. L., Roy, S., Heck, D. H. A technique for stereotaxic recordings of neuronal activity in awake, head-restrained mice. J Neurosci Methods. 178, 75-79 (2009).
- Ollerenshaw, D. R., et al. Detection of tactile inputs in the rat vibrissa pathway. J Neurophysiol. 108, 479-490 (2012).
- Lee, M. G., Manns, I. D., Alonso, A., Jones, B. E. Sleep-wake related discharge properties of basal forebrain neurons recorded with micropipettes in head-fixed rats. J Neurophysiol. 92, 1182-1198 (2004).
- Lutcke, H., et al. Optical recording of neuronal activity with a genetically-encoded calcium indicator in anesthetized and freely moving mice. Front Neural Circuits. 4, 9(2010).
- Dombeck, D. A., Khabbaz, A. N., Collman, F., Adelman, T. L., Tank, D. W. Imaging large-scale neural activity with cellular resolution in awake, mobile mice. Neuron. 56, 43-57 (2007).
- Kimura, R., et al. Reinforcing operandum: rapid and reliable learning of skilled forelimb movements by head-fixed rodents. Journal of neurophysiology. 108, 1781-1792 (2012).
- Hadlock, T., Kowaleski, J., Mackinnon, S., Heaton, J. T. A novel method of head fixation for the study of rodent facial function. Experimental neurology. 205, 279-282 (2007).
- Roh, M., Jang, I. S., Lee, M. G. Push-in Head Restraining Apparatus for Intracranial Self Stimulation Tasks in Rats. Korean J Physiol Pharmacol. 18, 103-108 (2014).
- Schwarz, C., et al. The head-fixed behaving rat--procedures and pitfalls. Somatosensory & motor research. 27, 131-148 (2010).
- Guo, Z. V., et al. Procedures for Behavioral Experiments in Head-Fixed Mice. PLoS ONE. 9, (2014).
- Osborne, J. E., Dudman, J. T. RIVETS: a mechanical system for in vivo and in vitro electrophysiology and imaging. PLoS One. 9, e89007(2014).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
