Micro-elektrode Begeleide Implantatie van elektroden in de nucleus subthalamicus van Rats naar Lange termijn Deep Brain Stimulation

Samenvatting

Er wordt een methode beschreven voor het implanteren van elektroden in de subthalamische nucleus (STN) van ratten. Betere lokalisatie van de STN werd bereikt door het gebruik van een micro-opnamesysteem. Verder wordt een stimulatie-opstelling gepresenteerd die wordt gekenmerkt door langdurige verbindingen tussen het hoofd van het dier en de stimulator.

Samenvatting

Diepe hersenstimulatie (DBS) is een veel gebruikte en effectieve therapie voor verschillende neurologische aandoeningen zoals idiopathische ziekte van Parkinson, dystonie of tremor. DBS is gebaseerd op de afgifte van elektrische stimuli specifieke diepe anatomische structuren van het centrale zenuwstelsel. Echter, de mechanismen die ten grondslag liggen aan het effect van DBS blijft raadselachtig. Dit heeft geleid tot een interesse in het onderzoeken van het effect van DBS in diermodellen, met name bij ratten. Omdat DBS is een langdurige behandeling, moet het onderzoek worden toegespitst op moleculair-genetische veranderingen van neurale circuits die enkele weken optreden na DBS. Langdurig DBS bij ratten is een uitdaging omdat de ratten bewegen in de kooi, die problemen houden in plaats van de draad die van de kop van het dier op de stimulator veroorzaakt. Voorts doelstructuren voor stimulatie in de rattenhersenen zijn klein en daarom elektroden moeilijk kan worden geplaatst op de gewenste positie. Dus een set-up voor een langdurige stimulatie ratten gebruikt platinum / iridium elektroden een impedantie van ongeveer 1 MQ ontwikkeld voor deze studie. Een elektrode met deze specificaties maakt niet alleen voldoende stimulatie ook de opname van diepe hersenstructuren het doelgebied DBS identificeren. In onze set-up, een elektrode met een stekker voor de draad was ingebed in de tandheelkundige cement met vier verankering schroeven bevestigd op de schedel. De draad van de stekker in de stimulator werd beschermd door een roestvrij stalen veer. Een draaibaar is verbonden met het circuit te voorkomen dat de kabel verward raakt. Kortom, deze stimulatie opstelling biedt een hoge mate van mobiliteit van de rat en maakt de kop stekker, alsmede de draadverbinding tussen de plug en de stimulator, om langdurige sterkte behouden.

Inleiding

Diepe hersenstimulatie (DBS) een behandeling op basis van de afgifte van elektrische impulsen via geïmplanteerde elektroden specifieke hersenstructuren, zoals de interne globus pallidus ^1, de nucleus subthalamicus (STN) ^{2 - 4} of ventrale tussenliggende thalamus ^5. In de laatste twee decennia is deze behandeling is vastgesteld als een krachtig therapeutisch middel voor de ziekte van Parkinson ^{1 - 4,} dystonie ⁶ en tremor ^7, en wordt ook gebruikt om chronische pijn ^7, psychiatrische stoornissen (moduleren ie, obsessieve-compulsieve stoornis ^8, zware depressie ^{9) of} hardnekkige epilepsie ^10,11. Bovendien DBS zou in de toekomst, wordt een behandelingsoptie voor vuurvaste arteriële hypertensie of orthostatische hypotensie ^{12 13.}

De fysiologische mechanismen die ten grondslag liggen aan de gevolgenvan DBS blijven slecht begrepen. Studies bij verdoofde knaagdieren hebben inzicht gegeven in de neurale reacties op hoogfrequente stimulatie na te bootsen die klinisch toegepast DBS ^14. Echter, deze studies niet alleen verlies behavioral bevestiging van de DBS effect, maar ook leiden tot aanzienlijke variabiliteit naargelang de stimulatieparameters toegepaste ^14.

Om de gedragseffecten en de onderliggende mechanismen van DBS in de bewuste knaagdieren meer bondig onderzoeken, wordt een stimulatie set-up nodig die specifieke eisen voldoet. DBS wordt meestal gebruikt als langdurige therapie (bijvoorbeeld de ziekte van Parkinson, chronische pijn). Aldus zullen stimuleren opstelling in knaagdieren worden ontworpen dat het apparaat bestaat uit een elektrode met een plug, en een draad van de kabel met een externe stimulator; en dit apparaat moet lichtgewicht maar onbreekbaar wanneer bevestigd op de schedel. Bovendien bewegingsvrijheid is onmisbaar voor ratten tijdens stimulatie over een langere periode. Het doel structuren van DBS zijn klein; bijvoorbeeld de STN bij ratten heeft een lengte van 1,2 mm en een volume van 0,8 mm ^3,15. Daarom moeten de elektroden zodanig zijn uitgevoerd dat de kern niet laesie tijdens het inbrengen en richten behoefte om precies te zijn. Aangezien de meeste DBS studies bij knaagdieren landmark gebaseerde stereotactische inbrengen van de elektrode naar de beoogde structuur gebruikt, kan het foutenpercentage relatief hoog zijn, zelfs bij gebruik van de coördinaten volgens Paxinos en Watson ^16. Dit resulteert in een groter aantal dieren nodig zijn om een ​​statistisch betekenisvolle resultaten te bereiken.

In het onderhavige onderzoek een elektrode implantatie techniek geïntroduceerd, dat de STN met hoge nauwkeurigheid richt via een microregistratie systeem bevordert tegelijk de elektrode. Daarnaast wordt een stimuleringssysteem geleverd dat niet alleen laten een hoge mate van mobiliteit van de gestimuleerde dier maar garandeert ook continu stimulatiop via veilige fixatie van de stimulatie draad (die wordt beschermd door een roestvrij stalen veer) op de kop van de rat.

Protocol

Dierproeven werden goedgekeurd door de Universiteit van Würzburg en de gerechtelijke overheden (Neder-Franken, goedkeuringsnummer: 54-2531.01-102 / 13) en uitgevoerd volgens de aanbevelingen voor onderzoek in de experimentele beroerte bestudeert ^{17 en} de huidige dier Onderzoek: Melding In vivo experimenten Guidelines (http://www.nc3rs.org.uk/arrive-guidelines).

1. Anesthesie

1. Controleer de anesthesiesysteem voldoende hoeveelheden toevoer gas (zuurstof) en isofluraan zorgen voor de duur van de procedure. Sluit de neuskegel van de snijtand bar van het stereotaxische instrument en zet de snijtand bar op -3,3 mm.
2. Zet de gastoevoer (2 l / min). Plaats de rat in een doos en sluit de top. Zet de isofluraan vaporizer tot 3,5%.
3. Wanneer de rat ligfiets, schakelt het systeem waardoor het verdovingsmiddel gas stroomt naar de neuskegel die is bevestigd aan de snijtand bar.
4. Verwijder de rat uit de doos kamer en scheren het gebied tussen de oren en de ogen; met behulp van een wattenstaafje gedrenkt in Jodosept PVP, zwabberen het geschoren gebied om eventuele losse haren te verwijderen.
5. Plaats de rat in de neuskegel (figuur 1) en verder de anesthesie met isofluraan 2,5% in O ₂ (1 l / min). Controleer het niveau van de anesthesie door knijpen het interdigitale gebied. Als de rat voldoende is verdoofd, worden de defensieve reflexen afgeschaft (dat wil zeggen, de intrekking van de voet).
6. Monitor ademhaling en respons op stimulatie tijdens procedure en pas de verdamper indien nodig.
7. Breng vet zalf op de ogen tot droog voorkomen terwijl onder narcose. Monitoren en onderhouden van de lichaamstemperatuur bij 37 ± 0,5 ° C door een feedback-gecontroleerde verwarmingssysteem.

2. Chirurgie

1. Houd het operatiegebied steriele gedurende de gehele operatie. Zodra de surgeon's handen zijn steriel en het operatiegebied is steriel, bewegen alleen carefully en vergeet niet om de steriliteit te breken. Dit omvat ook een steriel veld (dwz steriel waterdichte gordijnen) waarop men kan neergezet instrumenten.
2. Injecteer 0,2 ml mepivacaïne subcutaan in het midden van het geschoren gebied. Mepivacaïne is een lokaal verdovingsmiddel dat een werkingsduur van maximaal 3 uur heeft. Het zal verder verdoven van het chirurgische gebied.
3. Met behulp van een scalpel een middellijn incisie die tussen de oren en zich uitstrekt naar 2 cm. Zorg ervoor dat de periosteum (glimmende membraan onder de huid) ook wordt ingesneden. Expose de schedel met vier klemmen (figuur 2).
4. Met behulp van een wattenstaafje, verwijder voorzichtig het beenvlies totdat de coronale en sagittale hechtingen worden blootgesteld; daarna, stelpen van het bloed met watten.
5. Bepaal de coördinaten van de bregma behulp van een naald in een houder sonde vast, en markeer het punt van de naald met een zwarte viltstift. Met behulp van de anterieure / posterieure (AP), middellijn / laterale(ML) en dorsoventral (DV) rijden schroeven, plaats de punt van de naald direct over de bregma.
6. Neem de AP en ML nonius schaal metingen: trek 3,6 mm van de AP lezen en 2,5 mm van de ML lezing elektrode implantatie in de rechter STN, of voeg 2,5 mm voor de elektrode implantatie in de linker STN. Deze positie wordt door de kleurstof van de viltstift gemarkeerd na verlaging van de punt van de naald naar het oppervlak van de schedel.
7. Klem de tandheelkundige boor op de grote probe houder van de stereotaxische instrument. Verplaats de tandheelkundige boor om de berekende gebied - dat wil zeggen, het gemarkeerde punt op de schedel. Kijkend door de microscoop, boor een gat (diameter van ongeveer 1 mm) door de schedel tot de dura zichtbaar is (de schedel is ongeveer 1 mm dik). Trek de dura met behulp van micro-dissectie pincet of een steriele naald. De dura is sterk genoeg om het uiteinde van de elektrode te vernietigen.
8. Boor een gat met de tandheelkundige boor in elke frontale squama en de interparietal squama tegenover de elektrodeopening. Koppel de sonde houder van de stereotaxische instrument. Boor niet op een schedel hechtdraad als veneuze vaten volg de hechtingen onder de schedel.
9. Schroef een bot schroef in elk van de vijf gaten. Vermijd threading de schroeven te diep. Roestvrij-stalen schroeven (M1.6), 2-3 slagen van de schroef zal de schroef voldoende te houden zonder dat de druk op de hersenen. Het aantal windingen is afhankelijk van de spoed van de schroef. Klem de sondehouder met de elektrode in de micromanipulator (figuur 3).
10. Met behulp van de AP, ML en DV-aandrijving schroeven, bewegen de sonde houder met de elektrode totdat de tip is bijna bregma raken. Let op de AP, ML en DV nonius schaal lezingen aan de bregma. Als de metingen worden gedaan, verhogen de elektrode enkele millimeters om te voorkomen dat de elektrode schrapen de schedel tijdens beweging. De coördinaten van de positie te bepalen waar de elektrode in te voegenhet gat, voeg 3,6 mm aan de AP lezen en voeg (of aftrekken) 2,5 mm naar ML lezen.
11. Met behulp van de AP en ML rijden schroeven, verplaats de elektrode naar de berekende positie. Op dit punt moet de elektrode direct gesitueerd boven het geboorde gat elektrode. Dan, door te kijken door de microscoop, laat de elektrode het niveau van de dura (figuur 4). Dit niveau dient als nulniveau in het DV richting. Daarna, breng dan het uiteinde van de elektrode in de hersenen door te kijken door de microscoop.
12. Sluit de elektrodepen de connector van het opnamesysteem. Zet een kooi van Faraday (of vervangen met aluminiumfolie) via rat in de stereotaxische apparaat (figuur 5). Aard de stereotaxische instrument met het tegenwicht van de ruimte die wordt gewerkt.
13. Start het opnamesysteem. Indien beschikbaar, een luidspreker ook gebruiken om een ​​akoestisch signaal van de lozingen / zalven van enkele eenheden krijgen tijdens advancing de elektrode.
14. Langzaam steek de elektrode in de hersenen door het opnemen van de elektrische activiteit tijdens voortbewegen van de elektrode. Op een diepte van tussen 7,5 en 8,1 mm vanaf de dura, de specifieke elektrische activiteit van het STN gewoonlijk detecteerbaar (Figuur 6). De typische activiteit van neuronen in de STN wordt gekenmerkt door een onregelmatig patroon afvuren en een hoge vuursnelheid (gemiddelde frequentie: 40,9 ± 12,9 Hz) ^18.
15. Tijdens de opname verminderen anesthesie zoveel mogelijk (bijvoorbeeld tot 0,8-1,0%); low-verdoofde dieren vertonen een duidelijker elektrische hersenactiviteit.
16. Zwabber weg geen bloed of cerebrospinale vloeistof die werd verplaatst naar het oppervlak van de schedel bij het verlagen van de elektrode.
17. Meng een kleine hoeveelheid tandheelkundig cement en toe te passen rondom de elektrode en rond vier van de vijf schroeven met een kleine spatel (figuur 7). De vijfde schroef wordt gebruikt om de aarddraad van de plug vast.
18. Koppel de elektrode pen uit de houder van de elektrode en de connector van de opname systeem wanneer de tandheelkundige cement is bevestigd.
19. Draai de schroef die niet door tandheelkundige cement werd vastgesteld. Steek de stekker op de elektrode pin. Fix de grond draad van de stekker met de vijfde schroef (figuur 8).
20. Meng tandheelkundige cement en toe te passen om de stekker. Als het cement dikker, schimmel rond de stekker in een kap vormen. Vermijd scherpe randen van de tandheelkundige cement dat het dier kunnen schaden en verwijder ze tijdens het uitharden (Figuur 9A en B).
21. Debride wondranden en sluit ze met een hechting aan de voorkant en achter de kap. Ontsmet de wond randen.
22. Sluit de kop stekker aan de draad die is bevestigd op een draaibare. Haal de rat uit de stereotaxische apparaat.
23. Breng tramadol (12,5 mg / kg, intraperitoneaal) aan het einde van de ingreep en daarna eenmaal per dag gedurende 2-3 dagen. Plaats de rat in een schone kooi met Thermal ondersteuning, bevestig de swivel op deze kooi (Figuur 10) en inspecteer zorgvuldig gedurende 1 uur.
24. Heeft een dier niet onbeheerd verlaten totdat het voldoende bewustzijn heeft herwonnen om borstligging handhaven. Heeft een dier dat een operatie heeft ondergaan om het gezelschap van andere dieren tot volledig hersteld niet meer terug.

3. Stimulatie

1. Bepaal de weerstand in het dier voordat stimulatie via een impedantie meter.
2. De stekker van de wartel met een draad en de stekkers aan het andere uiteinde van de draad met de stroomuitgang en de uitgang van de aarddraad van de stimulator. Sluit de stimulator met een computer om de stimulator programmeren.
3. Kies de parameters van de stimulatie in het programma; bijvoorbeeld de parameters in de ziekte van Parkinson zijn pulslengte: 60 psec; frequentie: 130 Hz. Het stimuleren van de rat met een toenemende stroom amplitude totdat dyskinesie worden erkend. Verminderen the elektrische intensiteit met 10-20% onder de intensiteit die dyskinesie opgewekt of tot neurologische symptomen verdwijnen en het dier is comfortabel. Monofasige rechthoekige pulsen werden gebruikt in deze studie.
4. Nadat het experiment inslapen het dier met isofluraan: Stel het isofurane debiet of concentratie 5% of meer. Blijven isofluraan blootstelling tot 1 min na de ademhaling stopt.

Resultaten

Het implanteren van een elektrode in de STN van een rat met een opnamesysteem - zoals hier weergegeven - is een doeltreffende en nauwkeurige wijze van DBS dat ongeveer 1 uur per dier neemt. Dit model is een vrij kleine ingreep: van de 10 ratten onderworpen aan een operatie, de ingreep overleefd. Vierentwintig uur na interventie van de staat van elke rat werd gecontroleerd en geen dierlijke bereikt meer dan 1 op de 3 punten op basis van de ernst code. Gedurende de periode van voortdurende stimulatie (14 dagen, 24 uur per...

Discussie

Deze studie geeft een stap-voor-stap reeks instructies voor het implanteren van een chronische monopolaire elektrode in de STN ratten. Hoewel wolfraamelektroden met lage impedantie wordt vaak gebruikt voor DBS ^18,19, een monopolaire elektrode van platina / iridium (Pt / Ir) werd gebruikt die een impedantie van ongeveer 1 MQ hadden. Pt / Ir-elektroden worden ook gebruikt bij patiënten met de ziekte van Parkinson vanwege hun gunstige eigenschappen: ze aantonen erosie minimaal ²⁰ en produceren g...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Pt/Ir elektrode	FHC Inc.	UE	Op maat gemaakt: Specificatie: UEPSEGSECN1M
Plugs	GT Labortechnik (Arnstein/Germany)		Op maat gemaakt
Pin header	DISTRELEC	143-95-324	enkelrijig, 90° 1x3 datamate, Type M80-8420342
Socket	DISTRELEC	143-95-621	enkelrijig, recht 2 mm pool nr. 1 x 3 datamate, Type M80-8400342
Roestvrijstalen veer	Plastics ONE	SS0102	Onderdeelnummer: .120 X.156 Spring ID (mm): 3,0  Spring OD (mm): 4,0
Tandartsencement/Paladur	Heraeus Kulzer	64707938	Vloeibaar, 500 ml
Tandartsencement/Paladur	Heraeus Kulzer	64707954	Poeder, roze, 500 g
Hoofdverschroeving	Hummer & Reiss	V2ADIN84 M1.6x3
Jodosept PVP	Vetoquinol		435678/E04
Mepivacaine 1%	AstraZeneca		PZN03338515
Epinefrine	Sanofi-Aventis		PZN00176118
Tramadolhydrochloride	Rotexmedica		38449.00.00