Methodenartikel

Biomembraan Fabrication door de Solvent-geassisteerde lipidedubbellaag (SALB) Methode

16.8K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/53073

⸱

1 december 2015

 ,  ,  ,  ,  , 
1School of Materials Science and Engineering, Nanyang Technological University, 2Centre for Biomimetic Sensor Science, Nanyang Technological University, 3School of Chemical and Biomedical Engineering, Nanyang Technological University

In dit artikel

Samenvatting

We presenteren een experimenteel protocol naar een ondersteunde lipidebilaag op vaste substraten te vormen zonder gebruik van lipide blaasjes. We tonen een eenstaps werkwijze op een lipide dubbellaag op siliciumdioxide en goud en ondersteunde membranen met cholesterol verrijkte domein voor verschillende biologische toepassingen te vormen.

Samenvatting

Om celmembranen na te bootsen, de ondersteunde lipidedubbellaag (SLB) is een aantrekkelijk platform waarmee in vitro onderzoek van membraan-gerelateerde processen, terwijl het verlenen van biocompatibiliteit en biofunctionality aan vaste substraten. De spontane adsorptie en breuk van fosfolipide vesicula is de meest gebruikte methode om SLBs vormen. Echter, onder fysiologische omstandigheden, vesicle fusie (VF) is beperkt tot slechts een deel van lipidesamenstellingen en vaste dragers. We beschrijven hier een eenstaps algemene procedure genaamd de oplosmiddelvrije ondersteunde lipide dubbellaag (SALB) de vorming methode om SLBs die geen vesicles vormen vereist. De SALB werkwijze omvat de afzetting van lipide moleculen aan een vast oppervlak in de aanwezigheid van met water mengbare organische oplosmiddelen (bijvoorbeeld isopropanol) en daaropvolgende solvent-uitwisseling met waterige bufferoplossing teneinde SLB vorming veroorzaken. De continue oplosmiddel stap uitwisseling maakt de toepassing van deWerkwijze in een doorstroom configuratie geschikt voor bewaking dubbellaagsformatie en daaropvolgende wijzigingen via uiteenlopende oppervlakte-gevoelige biosensoren. De SALB werkwijze kan worden gebruikt om SLBs fabriceren op uiteenlopende hydrofiele vaste oppervlakken, zoals die welke hardnekkig vesikel fusie zijn. Bovendien maakt fabricage van SLBs samengesteld lipidesamenstellingen die niet kunnen worden bereid met de vesicle fusiemethode. Hierin vergelijken we de resultaten verkregen met de SALB en conventionele blaasjes fusiemethoden twee illustratieve hydrofiele oppervlakken, siliciumdioxide en goud. Om de experimentele omstandigheden voor de bereiding van hoogwaardige bilagen bereid via de SALB werkwijze te optimaliseren, is het effect van verschillende parameters, waaronder het type organisch oplosmiddel in de depositiestap de snelheid van uitwisseling van oplosmiddel en de lipide concentratie besproken met probleemoplossingstips . Vorming van ondersteunde membranen die hoge fracties van cholesterol is ook demonencentreerde de SALB methode, aandacht voor de technische mogelijkheden van de SALB techniek voor een breed scala van membraan configuraties.

Inleiding

De vaste drager lipide bilaag 1 (SLB) is een veelzijdig platform dat de basiskenmerken van biomembranen behoudt zoals de dubbellaag dikte, tweedimensionale lipide diffusievermogen, en de mogelijkheid om membraangebonden biomoleculen gastheer. Vanwege de complexiteit van natuurlijke celmembranen, heeft deze eenvoudige platform getoond gefunctioneerd als efficiënt platform in vitro studies membraan processen zoals raft vorming 2, eiwitbinding 3, virussen en virusachtige deeltje bindende 4,5 en cell signaling 6. Gevormd in de nabijheid van een vaste drager, de SLB platform is compatibel met een reeks oppervlak-gevoelige meettechnieken als totale interne reflectie microscopie (TIRF), kwartskristalmicrobalans-dissipatie (QCM-D) en impedantiespectroscopie.

Verschillende werkwijzen zijn ontwikkeld om verschillende soorten SLBs, waaronder luchtbel producereninstorting 7 en dip-pen nanolithografie 8 voor submicron-sized lipide vlekken, spin-coating 9 voor tweelaags stacks en Langmuir-Blodgett (LB) 10 en blaasje fusion (VF) 11 voor full-spanning, enkel lipidedubbellaag coatings. De VF werkwijze omvat de adsorptie van kleine unilamellaire vesicles een vaste drager en daaropvolgende spontane breuk en fusie met een continu lipide dubbellaag vormen. Echter, onder fysiologische omstandigheden, spontane breuk vesikel is voornamelijk bedoeld silicium gebaseerde materialen zoals siliciumdioxide, glas en mica. Bovendien is vesicle breuk niet spontaan blaasjes voor complexe lipide samenstellingen zoals die met hoge fracties van cholesterol of negatief geladen lipiden. Afhankelijk van het systeem kan vesicles scheuren worden geïnduceerd door verdere afstemming van de experimentele condities zoals temperatuur 12, 13 oplossing pH en zoutgehalte 14, osmotische shock 15 of druk 16 of toevoeging van bivalente ionen, zoals Ca2 + 17. Alternatief kan het membraan-actieve peptide AH worden ingevoerd om een laag geadsorbeerd blaasjes destabiliseren, waardoor scheuren en vesikel bilaag vorming op een reeks oppervlakken 18-22.

Bovendien vereist een succesvolle dubbellaagsformatie bereiding van een goed gecontroleerde populatie van kleine unilamellaire vesicles die tijdrovend en moeilijk te bereiken voor bepaalde membraan preparaten kunnen worden. Daarom, ondanks het hoge rendement optimaal gevallen (bijvoorbeeld na uitgebreide vries-dooi voorbehandeling van vesicles 23), de algemene toepassing van vesikel fusie wordt beperkt door de reikwijdte van geschikte substraten en membraan preparaten.

Werkwijze 24-28-oplosmiddel ondersteunde lipide dubbellaag (SALB) is een alternatieve fabricagetechniek die lipide vesicles niet vereist. De werkwijze berust op de afzetting of lipide moleculen aan een vast oppervlak in aanwezigheid van een water mengbaar organisch oplosmiddel, gevolgd door geleidelijke uitwisseling van deze oplosmiddelen met een waterige bufferoplossing teneinde SLB vorming veroorzaken. Tijdens het oplosmiddel-uitwisselingsstap, het ternaire mengsel van lipiden, organisch oplosmiddel en water ondergaat een serie faseovergangen met toenemende water fractie, wat leidt tot de vorming van lamellaire fase structuren in de bulk oplossing en een SLB op het vaste substraat. Belangrijk is dat deze zelfassemblage route omzeilt de noodzaak van vesicles scheuren, gewoonlijk de beperkende stap voor de transformatie van geadsorbeerde vesicles in een SLB. Het protocol is toepasbaar op diverse oppervlakken zoals siliciumdioxide, aluminiumoxide, chroom, indium tinoxide, en goud. In dit document en de bijbehorende video, wordt de vergelijking van lipideafzetting de SALB en vesicle fusiemethoden gepresenteerd. Met name de invloed van de experimentele criteria zoals lipideconcentratie, Stroomsnelheid, en de keuze van water mengbaar organisch oplosmiddel, de kwaliteit van de bilaag gevormd door de SALB methode besproken. Analytische karakterisering van de vervaardigde SLBs wordt uitgevoerd door de QCM-D, fluorescentiemicroscopie en fluorescentieherstel na fotobleken (FRAP) technieken. QCM-D bewaking is een oppervlakte-gevoelige massa meettechniek die sinds het pionierswerk uitgevoerd door Keller en Kasemo 29, is uitgebreid gebruikt om kwantitatief onderzoek dubbellaagsformatie. Fluorescentie microscopie maakt controle van membraan homogeniteit en de visualisatie van membraandomeinen. De FRAP techniek is een standaard hulpmiddel om de laterale beweeglijkheid van lipide moleculen in een SLB, hetgeen een essentiële eigenschap van vloeibare membranen te bepalen.

Het eerste deel van deze studie omvat QCM-D analyse van de SALB en vesikel fusie methoden toegepast dubbellaagsformatie op siliciumdioxide en goud proberen. In het tweede deel,de bereiding en karakterisering van ondersteunde membranen met verschillende soorten cholesterol concentraties met SALB methode gedemonstreerd en de resultaten vergeleken met die verkregen door het blaasje fusie methode.

Protocol

1. Vorming van Ondersteunde lipidebilaag op een Hydrofiel Solid Ondersteuning

  1. Bereid lipide-voorraadoplossingen van 10 mg / ml 1,2-dioleoyl- sn-glycero-3-fosfocholine (DOPC) en 1 mg / ml 1,2-dioleoyl- sn-glycero-3-phosphoethanolamine- N - (lissamine rhodamine B sulfonyl) (Rh-PE) door het oplossen van de respectievelijke lipide poeders (adequaat vooraf gewogen met een analytische massabalans) in isopropanol oplossing.
  2. Verdun en meng de voorraadoplossingen in isopropanol om het gewenste lipide mengsel te bereiden op de eindconcentratie. Voor fluorescentie microscopie en FRAP experimenten dient 0,5 gew% Rh-PE worden opgenomen in het lipidemengsel.
  3. Injecteer het lipide mengsel in isopropanol in het microfluïdische kanaal totdat deze gevuld is.
  4. Incubeer het lipide mengsel op het glas gedurende 10 min.
  5. Geleidelijk vervangen lipideoplossing met water of bufferoplossing met behulp van een peristaltische pomp bij een zeer lage stroomsnelheid(10-50 pl / min). Als alternatief, vervang de lipidemengsel door herhaalde pipetteren.
  6. Spoel het kanaal grondig met overmaat buffer om het residuele isopropanol te verwijderen.

2. Vorming van-cholesterol verrijkt Ondersteunde Membranen

Opmerking: de stevige ondergrond (SiO 2) ondersteunt blaasje fusie, maar het membraan samenstelling (hoge cholesterol) remt blaasje fusie omdat cholesterol verrijkt blaasjes hebben hoge buigstijfheid 30.

  1. Bereid een voorraadoplossing van 10 mg / ml lipide DOPC, 10 mg / ml cholesterol en 1 mg / ml Rh-PE door eerst de respectieve poeders in isopropanol.
  2. Herhaal stap 1,2-1,6 met behulp van de voorraad oplossingen bereid in stap 2.1.

3. Membraan Fluidity Assay

  1. Dompel het glaasje in natriumdodecylsulfaat (SDS) oplossing (1%) gedurende 10 min.
  2. Was de dia's grondig met gedemineraliseerd water en spoel with ethanol.
  3. Föhn dia's met behulp van een zachte stroom van stikstof.
  4. Maak de objectglaasjes zuurstofplasma gedurende 30 seconden bij maximum vermogen in radiofrequentie zuurstof plasmakamer.
  5. Verwijder de beschermende film coating van de bodemloze commerciële microfluïdische kamer (figuur 1A) met behulp van een pincet en bevestig het glaasje op de kleverige kant van de kamer (Figuur 1B).
  6. Monteer de connectoren en slangen in de inlaat en uitlaat posities van de kamer en plaats de microfluïdische kanaal op de microscooptafel (figuur 1C).
  7. Vorm een fluorescent-gelabelde ondersteunde lipide dubbellaag in de microfluïdische kanalen [herhaal stap 1 met de gewenste lipidensamenstelling (bijvoorbeeld 0,5 mg / ml DOPC) met 0,5 wt% Rh-PE in organisch oplosmiddel].
  8. Zoek de bilaag vliegtuig met een 60X olie-immersie objectief (NA 1,49) om beelden vast te leggen.
  9. Neem twee pre-bleekmiddel afbeeldingen, dan foto-bleken 301; m breed ronde plek met een 532 nm, 100 mW laserstraal. Voordat photobleaching, warmen de laser totdat de intensiteit stabiel is geworden. Direct na fotobleken, Een reeks beelden elke 1 sec gedurende 2 min teneinde het herstel van de fluorescentie-intensiteit zich ter gebleekte vlek.

4. Cholesterol kwantificering Assay

  1. Expose siliciumdioxide beklede kwartskristal sensorchip met zuurstofplasma gedurende 30 seconden bij maximum vermogen in radiofrequentie zuurstof plasmakamer. Verwijder de chip uit de kamer en onmiddellijk monteer de chip in de meetkamer.
  2. Voordat experiment, eerst de frequentie en de afvoer van de sensor chip in de lucht om een ​​goede montage zorgen te verwerven.
    1. Voor de commerciële Q-Sense E1 of E4 QCM-D instrument, voert u de Q-Soft programma en klik op "Acquisition" en selecteer "Setup Measurement".
    2. In het nieuwe venster dat verschijnt, controleer dan de 3, 5, 7, 9, 11 en 13 boventonen en klik op zoeken en uitvoeren om de resonantiespectra controleren. Stel de temperatuur op 24 ° C. Indien één of meer resonantie frequenties niet eens met de verwachte waarden, check de chip montage en opnieuw uitvoeren van deze stap totdat een akkoord is bereikt.
  3. Start de peristaltische pomp en stroming bufferoplossing (10 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 7,5) in de meetkamer met een stroomsnelheid van 100 pl / min.
  4. In het programma, klik op "Acquisition" en selecteer "Restart Measurement" om de resonantiefrequentie en energie dissipatie signalen opnemen. Herhaal deze stap tot een stabiele basislijn wordt verkregen voor de frequentie en de dissipatie verschuivingen. Opmerking: voor de stappen hierna, maar aanvullende frequentie en dissipatie verschuivingen die kunnen worden geregistreerd als functie van de tijd.
  5. Injecteer isopropanol (zonder lipiden) gedurende 10 min.
  6. Injecteer het mengsel van DOPC lipiden / cholesterol in hetgewenste molverhouding met een totale lipide concentratie van 0,5 mg / ml in isopropanol gedurende 10 min.
  7. Injecteer buffer gedurende 20 min bij een stroomsnelheid van 100 pl / min.
  8. Injecteer 1 mM oplossing van methyl-β-cyclodextrine (MβCD) bereid in buffer (debiet 100 ul / min) totdat het signaal een stabiele waarde bereikt.
  9. Meet de relatieve positieve frequentieverschuivingen die wordt veroorzaakt door de MβCD behandelingsstap en bereken de massa van cholesterol en DOPC lipiden door omzetting van de Af cho en Af DOPC waarden massawaarden met de Sauerbrey vergelijking [Δm = - (C / N) x Af, waarbij C = 17,7 ng / cm2, n: ondertoon].
  10. Bereken de molfractie van cholesterol in de SLB, rekening houdend met de molecuulgewichten van DOPC lipide (786,1 g / mol) en cholesterol (386,6 g / mol).

Resultaten

Fabricage van ondersteunde lipide dubbellagen op hydrofiele substraten.

De VF en SALB vorming methoden geprobeerd op siliciumdioxide en goud en de vorming processen in real-time de QCM-D meettechniek. De QCM-D instrument meet veranderingen in de resonantiefrequentie (Δ f) van een oscillerende piëzo-elektrisch kwartskristal bij massa adsorptie aan het oppervlak van het kristal. Bovendien, de QCM-D instrument meet de dissipatie van de trillingsenergie om de visco-elastische eigenschappen (stijfheid en zachtheid) van de adlayer karakteriseren. Vesikel fusie-experimenten werden uitgevoerd zoals eerder beschreven 31. In het kort werd een basislijn eerst voor de frequentie en dissipatie signalen in waterige bufferoplossing [10 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 7,5; (Figuur 2A en B)]. Vervolgens, kleine unilamellaire DOPC lipide vesicles in dezelfde buffer was injected bij t = 10 min (pijl 1) op siliciumdioxide (figuur 2A) en goud (figuur 2B). Voor blaasje fusie op siliciumdioxide, werden in twee stappen adsorptiekinetiek waargenomen met de definitieve veranderingen in de frequentie en energie dissipatie van -26 (± 1) Hz en 0,3 (± 0,2) x 10-6, respectievelijk. Deze waarden komen overeen met de vorming van een ondersteunde lipide dubbellaag 29.

Zoals getoond in figuur 2B, de toevoeging van de vesicle oplossing van het goud oppervlak tot een gelijktijdige afname en toename Δ f en Δ D signalen, respectievelijk, tot hun waarden bereikt -150 (± 10) Hz (7,5 ± 2) × 10 - 6 resp. Deze waarden komen overeen met de vorming van een geadsorbeerde laag vesicle. Dus, zoals verwacht, een SLB was niet gevormd op goud via het blaasje fusiemethode.

QCMD analysis for dubbellaagsformatie op siliciumdioxide en goud door de SALB werkwijze wordt getoond in Figuur 2C en D. Op siliciumdioxide, laatste Δ f en Δ D verschuivingen -25,6 (± 0,55) Hz en 0,4 (± 0,27) x 10 - 6 respectievelijk werden bereikt en deze waarden duiden vorming van een SLB. Gelijkaardige reeksen van Δ f en Δ D (Δ f Au: -27,3 ± 2,7 Hz, Δ D Au: 0,48 (± 0,26) × 10-6) werden waargenomen op goud. Deze resultaten ondersteunen dat de SALB methode maakt vorming van ondersteunde lipide dubbellagen op oppervlakken waarop vesicles scheuren te voorkomen.

Effect van oplosmiddel-uitwisseling debiet op de kwaliteit van de ondersteunde lipidendubbellagen.

Om de optimale omstandigheden vast te stellen voor de productie van hoge kwaliteit ondersteund lipidendubbellagen vieen SALB de werkwijze, de invloed van lipide concentratie, oplosmiddel-koers en de keuze van organische oplosmiddelen onderzocht.

Figuur 3 toont de verandering in QCM-D frequentie tijdens de laatste stap van de SALB protocol, zoals uitgevoerd op siliciumdioxide op twee verschillende debieten (100 en 600 ul / min) en twee verschillende lipide concentraties (0,125 en 0,5 mg / ml) .

Wanneer 0,5 mg / ml DOPC lipide werd gebruikt (figuur 3A), werd dubbellaagsformatie niet beïnvloed door de stroomsnelheid en een definitieve Af verschuiving van ongeveer -26 Hz werd verkregen op beide debieten.

Wanneer daarentegen een lagere lipide concentratie werd gebruikt, de hoeveelheid geadsorbeerde lipiden na volledige oplosmiddeluitwisseling werd significant beïnvloed door de stroomsnelheid (Figuur 3B). Bij een gemiddelde stroomsnelheid van 100 pl / min, dubbellaagsformatie was voltooid (ongeveer Af -26 Hz). Echter, bij een 6-voudige hogere debiet (600 ul / min), werd een volledige bilaag niet gevormd (ongeveer Af -17 Hz). Deze resultaten verschaffen een richtlijn voor het kiezen van de juiste experimentele condities voor een succesvolle dubbellaagsformatie met de SALB methode isopropanol als organisch oplosmiddel gekozen.

Karakterisering van ondersteunde lipide bilagen gevormd uit verschillende lipide concentraties in verschillende alcoholoplossingen.

Lipidenconcentratie is een parameter die de kwaliteit van SLBs verkregen met de werkwijze SALB beïnvloedt. Fluorescentie microscopie onthulde dat op 0,05 mg / ml lipide concentratie, alleen geïsoleerde, submicroscopische lipidestructuren gevormd (Figuur 4A). Met toenemende concentratie aan lipiden die in de SALB procedure, de fluorescentie-intensiteit van de lipidestructuren werd homogeen. Bij 0,1 mg / ml lipide concentratie waren microscopische lipide pleisters hoewel de structuren niet uitstrekken over de gehele field gezien (Figuur 4B). Wanneer echter 0,25 mg / ml lipide concentratie werd gebruikt, een homogene lipide bilaag werd gevormd (Figuur 4C). Daarom is er een minimale concentratie aan lipiden vereist om een ​​volledige, full-spanning SLB vormen.

De invloed van de lipideconcentratie op het eindresultaat van de SALB experimenten werd eveneens onderzocht over een groter concentratiegebied lipiden (0,01-5 mg / ml) en in verschillende organische oplosmiddelen (isopropanol, ethanol en n-propanol). De Δ Δ f en D die overeenkomen met de laatste stap in het SALB procedure zijn weergegeven in figuur 5.

We gedefinieerd dubbellaagsformatie uit de finale veranderingen in frequentie en energiedissipatie tussen -25 en -30 Hz en minder dan 0,5 x 10 -6 resp. Op basis van deze criteria, de optimale lipide concentratiebereik vorming van een ondersteunde lipide dubbellaag werd bepaald op tussen 0,1 en 0,5 mg/ ml grotendeels onafhankelijk van het type organisch oplosmiddel. De afwijkingen in de verworven Δ f en Δ D verschuift buiten het bovengenoemde bereik te wijten aan de aanwezigheid van additionele massa (bijv bilaag stacks), de aanwezigheid van niet-bilaag morfologieën (bijvoorbeeld blaasjes, wormachtige micellen) en de aanwezigheid van gefragmenteerde bilayer eilanden met onvolledige morfologie over het substraat.

Terwijl de SALB procedure verkregen ondersteunde lipide bilagen relatief robuust kan de optimale lipide concentratie hoogwaardige dubbellaagsformatie tuning nodig afhankelijk van de specifieke experimentele configuratie. In principe is er niet alleen een minimale lipide concentratie, maar ook een maximale concentratie aan lipiden vereist voor optimale vorming dubbellaag via SALB methode. De optimale concentratie is afhankelijk van de stroom en kunnen ook beïnvloed worden door het substraat en lipiden. Empirisch in veel gevallen hebben we found dat een lipide concentratie van 0,5 mg / ml en een stroomsnelheid van 100 pl / min is de optimale reeks voorwaarden voor de vorming van een homogene ondersteunde lipide dubbellaag. Afhankelijk van de lipide samenstelling en stroom cel geometrie laatstgenoemde is waarvan het stromingsprofiel in oplosmiddeluitwisseling-verdere optimalisatie van het lipide concentratie nodig zijn. Dus, adviseren wij het uitvoeren van proefprojecten SALB experimenten met behulp van een 0,5 mg / ml lipide concentratie en beoordeelt de bilaag kwaliteit met behulp van de QCM-D of fluorescentie microscopie technieken. Als de dubbellagen onvolledige verschijnen, dan is de lipide concentratie dient te worden verhoogd in stappen van 10% tot bevredigende resultaten worden bereikt. Als de bilaag blijkt te bestaan ​​naast extra lipidestructuren dan de lipideconcentratie moet worden verlaagd in stappen van 10% tot bevredigende resultaten worden bereikt.

Fabricage van ondersteunde lipide bilagen met verschillende lipidesamenstellingen en different cholesterol fracties.

Vervolgens werden de SALB en VF methoden toegepast om cholesterol verrijkte SLBs vormen. Figuur 6 toont representatieve fluorescentie beelden (100 x 100 urn) van cholesterolbevattende ondersteund membranen bereid door de werkwijze SALB. De membranen bestaan ​​uit cirkelvormige kleurstof uitgesloten domeinen omgeven door een continue fase die een uniforme fluorescerende helderheid. De donkere gebieden verhoogd met toenemende cholesterol fractie van de precursor lipidemengsel. Vervolgens werden FRAP metingen uitgevoerd om de vloeibaarheid van de lipide bilaag films te onderzoeken. De FRAP metingen bleek bijna volledig fluorescentieherstel in de omringende fase, waarin de laterale beweeglijkheid van lipiden en daarmee de vorming van een enkele lipide bilaag. Aangezien Rh-PE wanden bij voorkeur in de vloeibare fase worden de donkere gebieden waarschijnlijk bestaande uit dichte cholesterol verrijkte structuren.

Ter vergelijking werd de fabricage van DOPC / Chol dubbellagen met de VF werkwijze ook geprobeerd. DOPC blaasjes met toenemende cholesterol fracties (10 - 40 mol%) werden bereid door het blaasje extrusiewerkwijze. Rh-PE lipiden (0,5 gew%) werd gebruikt als fluorescent label voor beeldvorming. Figuur 7 toont representatieve fluorescentie beelden (100 x 100 um) van structuren na incubatie van de glassubstraten met cholesterol-bevattende vesicles. FRAP analyse toonde de vorming van een vloeibare lipide dubbellaag vesicles die gebruikt bevatte 20 mol% Chol of minder. Echter, de monsters bereid door het gebruik van blaasjes met een hogere cholesterol fracties vertoonden geen herstel, met vermelding van de aanwezigheid van geadsorbeerd maar unruptured blaasjes.

De fractie van cholesterol die uiteindelijk werd opgenomen in de ondersteunde lipide dubbellagen werd gekwantificeerd als functie van de cholesterol fractie die was opgenomen in het precursor lipid mengsel in organisch oplosmiddel in SALB methode of in de vesicles in waterige oplossing in de VF werkwijze. Met behulp van de QCM-D techniek werd dubbellaagsformatie gevolgd en vervolgens MβCD werd om specifiek te extraheren Chol van de ondersteunde lipidebilagen 32 toegevoegd. Het massaverlies als gevolg van het verwijderen van cholesterol tot een daling van de absolute waarde van de frequentieverschuiving (| A f |) gekoppeld aan de SLB. De relatieve positieve frequentieverschuiving veroorzaakt door de MβCD behandelingsstap worden getoond in Figuur 8A. De molaire fractie van cholesterol werd berekend op basis van de frequentieverschuiving, zoals aangegeven in figuur 8B.

De cholesterol fractie verwerkt in ondersteunde lipide bilagen bereid volgens de werkwijze SALB bijna lineair proportioneel met de inhoud van cholesterol in het precursor lipidemengsel. Interessant is dat de cholesterol fractie bilagen bereid volgens de werkwijze VF (blaasjes met maximaal20 mol% Chol) was aanzienlijk lager dan die welke in het precursor vesicles. In feite, het grootste percentage cholesterol verkregen met de werkwijze VF slechts ongeveer 10 mol%.

Observatie streep bovenbouw β-tweefase coëxistentie regio cholesterol-fosfolipiden ondersteunde lipide dubbellagen.

SALB experimenten werden verder uitgevoerd met een lipide mengsel met een nog grotere fractie van cholesterol. Wanneer een 4: 6 mengsel van DOPC en cholesterol werd gebruikt, geleidelijk ontmenging van een gelijkmatige vloeibare fase in twee naast elkaar bestaande fasen gevisualiseerd als lichte streepvormige domeinen op een donkere (kleurstof exclusief) achtergrond werd waargenomen (Figuur 9). Er is vastgesteld dat Rh-PE wordt uitgesloten van cholesterol-rijke domeinen 33, en dus de overheersende donkere gebieden die verscheen als achtergrond worden met cholesterol verrijkte gebieden. De vorming van micronafmetingen lichte domeinen op een donkere achtergrond bij high cholesterol fractie (> 50 mol%) is consistent met de β gebied in de monolaag fasediagram van cholesterol / fosfolipiden mengsels 34,35. Bovendien is de vorming van stripe domeinen die vrijkomt door zwakke lijnspanning suggereert dat het mengsel bij een mengbaarheid kritisch punt.

figure-results-1
Figuur 1. Microfluïdische kamer voor SALB formatie in een geschikte configuratie voor epifluorescentiemicroscopie. (A) Commerciële microfluïdische kamer, (B) Glas dekglaasje bevestigd op de klevende kant van de kamer, (C) Complete setup op een microscoop houder met slangen aangesloten op de inlaat en uitlaat poorten van de kamer, en (D) peristaltische pomp gebruikt om de snelheid van het oplosmiddel uitwisseling te regelen. Lipiden opgelost in isopropanol worden geïnjecteerd in de meting chamber met de hulp van de peristaltische pomp. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2. QCM-D analyse van vesikel fusie en SALB experimenten op siliciumdioxide en goudsubstraten. QCM-D frequentie (Af, blauw) en dissipatie (AD, rood) responsen van de derde boventoon (n = 3) werden geregistreerd als functie van de tijd gedurende lipide-adsorptie aan (A en C) siliciumdioxide, (B en D) goud. Panelen a en b presenteren vesikel fusiemethode. DOPC lipide vesicles werden geïnjecteerd op t = 10 min (pijl 1). Panelen c en d overeen met de SALB vorming methode. Pijlen geven de injectie van buffer (1), isopropanol (2), lipidemengsel [0,5 mg / ml DOPC lipide in isopropanol; (3)] ​​en buffer uitwisseling (4). De gestippelde curve in panel B correspondeert met een controle-experiment waarin lipide niet geïnjecteerd. De eindwaarden van Af en AD per oppervlak aangegeven. De schema's tonen de voorgestelde samengestelde lipidestructuren zoals blijkt uit het uiteindelijke frequentie en dissipatie verschuift. Aangepast van referentie 24 en worden met toestemming van de American Chemical Society. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3. Invloed van het oplosmiddel-wisselkoers op de SALB vorming proces. QCM-D frequentieverschuivingen (Af) overeenkomend met de laatste stap (zie pijl 4 in figuur 2C) in de SALB methode gemeten op siliciumdioxide op twee verschillende wisselkoersen, 100 en 600 pl / min, u zing (A) 0,5 mg / ml en (B) 0,125 mg / ml DOPC lipide in isopropanol. De uiteindelijke Af waarden worden gespecificeerd, vergeleken met de basislijn gemeten in waterige bufferoplossing. Aangepast van referentie 24 en worden met toestemming van de American Chemical Society. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-4
Figuur 4. Drempel Lipidenbioch concentratie voor complete SALB Vorming epifluorescentiemicroscopie lipide lagen siliciumdioxide bereid met behulp SALB (A) 0,05 mg / ml.; (B) 0,1 mg / ml; en (C) 0,25 mg / ml lipide concentratie. Aangepast van referentie 26 en worden met toestemming van de American Chemical Society./files/ftp_upload/53073/53073fig4large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-5
Figuur 5. Invloed van lipideconcentratie en organische oplosmiddelen ondersteunde lipide bilaag door SALB methode. De uiteindelijke veranderingen in QCM-D (A) en frequentie (B) energieabsorptie voor SALB experimenten met verschillende organische oplosmiddelen, als een functie van lipide concentratie. De gestippelde groene lijnen overeen met de verwachte frequentie en dissipatie verschuift voor een volledige dubbellaag (-30 Hz -6). Aangepast van referentie 26 en worden met toestemming van de American Chemical Society. Klik hier om een grotere versie van deze fi bekijkenguur.

figure-results-6
Figuur 6. fluorescentieherstel na fotobleken analyse ondersteunde lipide bilagen met verschillende fracties van cholesterol bereid met de SALB methode op een glazen substraat. (AE) fluorescentie microfoto bilagen bereid onder toepassing van verschillende fracties cholesterol in het precursor mengsel. Beelden werden onmiddellijk na fotobleken (boven) en 1 min (middelste) geregistreerd. De donkere vlek in het beeld midden komt overeen met de photobleached regio. De schaal bars zijn 20 urn. Oppervlakte histogrammen van afzonderlijke kleurstof uitgesloten domeinen in elk monster worden ook voorgesteld (onderaan). Aangepast van referentie 36 en worden met toestemming van de American Chemical Society. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-7
Figuur 7. FRAP analyse van cholesterolbevattende ondersteund bilagen bereid met de vesikel fusie methode. (AD) fluorescentie microfoto bilagen bereid onder toepassing van verschillende cholesterol fracties (10-40 mol%), in het precursor vesicles. Beelden werden onmiddellijk na fotobleken (boven) en 1 min (onderste) geregistreerd. De donkere vlek in het beeld midden komt overeen met de photobleached regio. De schaal bars zijn 20 urn. Aangepast van referentie 36 en worden met toestemming van de American Chemical Society. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-8
Figuur 8. Quantification van cholesterol fractie ondersteund lipidendubbellagen. (A) De positieve QCM-D frequentieverschuiving bij injectie van 1 mM MβCD op ondersteunde lipide bilagen met verschillende molfracties van cholesterol in het precursor mengsel (tussen 0 en 50 mol%). (B) molprocent cholesterol uitgeput van de SALB en vesikel fusie methoden bereid als functie van de fractie cholesterol in het precursor mengsel of vesicles bilagen. Aangepast van referentie 36 en worden met toestemming van de American Chemical Society. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-9
Figuur 9. Tijdsafhankelijke ontwikkeling van fluorescentie microstructuur in een ondersteunde bilaag van DOPC / Chol (4: 6 molverhouding containing 0,5% Rhodamine-PE), opgesteld door de SALB methode. Een uniforme fase geleidelijk fase scheidt in een vloeistof-vloeistof coëxistentie regio op volledige oplosmiddel uitwisseling. Aangepast van referentie 37 en worden met toestemming van de American Chemical Society. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

In dit werk, wordt een oplosmiddel-uitwisseling protocol voorgesteld waarin lipiden alcohol (isopropanol, ethanol of n-propanol) worden geïncubeerd met een vaste drager en daarna de alcohol geleidelijk vervangen door een waterige bufferoplossing teneinde een reeks drijven van faseovergangen uiteindelijk produceren lamellaire fase lipidendubbellagen 24. Er wordt aangetoond dat de methode kan vervaardigen ondersteunde lipide dubbellagen op oppervlakken zoals goud, die hardnekkig het blaasje fusiemethode.

Een optimale lipide concentratiebereik (0,1-0,5 mg / ml) werd bepaald voor complete vorming dubbellaag in standaard experimentele formats dusver getest. Bij lipide concentraties onder 0,1 mg / ml, discrete microscopische stukken bilagen gevormd. Anderzijds, bij concentraties boven 0,1 mg / ml en lager dan 0,5 mg / ml, is een volledige en gelijkmatige bilaag gevormd. Op lipide concentraties boven deze range, werd een vloeistof bilayer nog gevormd als verificatieed door FRAP analyse echter fluorescentiemicroscopie onthult de aanwezigheid van extra lipidestructuren bovenop de bilaag. Opvallend is dat de morfologie van deze bijkomende lipidestructuren, zoals bepaald met QCM-D analyse, afhankelijk van de alcohol die gebruikt werd tijdens de incubatiestap. In het geval van ethanol, de relatief hoge Δ f en Δ D verschuivingen lijken op de QCM-D signature verkregen voor een geadsorbeerde laag vesicle. Wanneer isopropanol of n-propanol werd gebruikt in de Δ f iets hoger dan de waarde verwacht voor een dubbellaag (laatste Δ f tussen -30 tot -40 Hz), terwijl Δ D was aanmerkelijk hoger. Dergelijke QCM-D reacties te verwachten voor uitgebreide lipidestructuren (bijv wormachtige micellen) buitenwaarts uitsteekt uit het membraanoppervlak (zoals zichtbaar door fluorescentiemicroscopie in sommige gevallen).

De snelheid van de oplosmiddel uitwisseling is een andere belangrijke parameter die kritisch kan zijn, especially bij lagere lipide concentraties (bijvoorbeeld 0,1 mg / ml) gebruikt. Snelle omwisseling oplosmiddel bij lage lipide concentratie kan leiden tot de vorming van incomplete bilagen. In de standaard meetkamer gebruikt voor QCM-D metingen in dit document (Q-Sense E4 meetkamer), debiet van ongeveer 100 ui / min, waren geschikt voor zeer reproduceerbare volledige dubbellaagsformatie. Voor stroom cellen met andere geometrieën en volume, kan de optimale stroomsnelheid variëren en moet empirisch worden bepaald op basis van de hierin voorgestelde maatregelen.

Naast ondersteunde lipide dubbellagen vormen op oppervlakken die hardnekkig vesikel fusie zijn, kan de SALB worden toegepast om de noodzaak van lipide vesicles die kunnen scheuren, waardoor de deur naar de vervaardiging van ondersteunde membranen met complexe samenstellingen omzeilen. Als illustratief voorbeeld samenstelling werden lipidemengsels met een grote fractie van cholesterol onderzocht. Cholesterol is een belangrijke component van Mammalian celmembranen, en zijn fractie kan benaderen 45-50 mol% van het membraan lipide samenstelling (bijvoorbeeld in erytrocyten). Derhalve moet ook een eenvoudig model van een lipide bilaag die een menselijke celmembraan omvatten cholesterol.

Terwijl vesikel fusie kan worden om vloeibare lipide dubbellagen die slechts 10-15% cholesterol fabriceren, kan de werkwijze SALB vorming van vloeibare lipide dubbellagen met een hoog fracties cholesterol (tot 57 mol%, zoals gekwantificeerd door QCM-D metingen) 36. Wanneer echter het cholesterolgehalte verder werd verhoogd (tot 63 mol%) werden domeinen streep-vorm 37 waargenomen. De co-bestaande domeinen vloeistof denken aan die waargenomen in de β regio in het fasediagram van de cholesterol / fosfolipiden monolaag aan het lucht-water grensvlak.

Over het algemeen wordt de SALB methode getoond om een ​​eenvoudige en efficiënte aanpak op ondersteunde lipide bilagen te vormen, met name in gevallen buiten het bereik van de conventionele vesikel fusie methode. Tot nu toe werden de QCM-D techniek en fluorescentiemicroscopie voornamelijk gebruikt om de ondersteunde lipide bilagen gevormd door SALB wijze karakteriseren. Kijken, een breed scala van oppervlakte-gevoelige analytische meettechnieken, zoals oppervlakte plasmon resonantie (SPR) 38, atomic force microscopie (AFM) 39,40, Fourier-transformatie infrarood spectroscopie 41, X-ray 42 en neutronen reflectiviteit 43 kan, worden gebruikt voor het verder karakteriseren en studie eenvoudige en complexe configuraties dubbellaag Bereid middels de werkwijze SALB. Deze nieuwe mogelijkheden opent de deur naar een groter aantal wetenschappers die kunstmatige celmembranen kunnen verkennen door gebruik te maken van een eenvoudige en robuuste experimentele protocol.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen concurrerende financiële belangen te onthullen.

Dankbetuigingen

De auteurs willen erkennen steun van de National Research Foundation (NRF -NRFF2011-01 en NRF2015NRF-POC0001-19), de National Medical Research Council (NMRC / CBRG / 0005/2012), en de Nanyang Technological University te NJC

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
QCM-D siliciumdioxide-gecoate substratenQSense AB,  Zweden
QCM-D goud-gecoate substratenQSense AB,  Zweden
Q-Sense E4 moduleQSense AB,  Zweden
Plasma Cleaner, PDC-32GHarrick Plasma, Ithaca, NYPDC-001 (115V) 
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-fosfocholine (DOPC)Avanti Polar Lipids850375P
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-fosfoethanolamine-N-(lissamine rodamine B sulfonyl) (ammoniumzout) (Rh-PE)Avanti Polar Lipids810150P
cholesterolAvanti Polar Lipids700000P
Methyl-β-cyclodextrineSigma C4555
IsopropanolSigma 673773
EthanolSigma 459844
n-propanolSigma 279544
Sticky-Slide I 0.1 LuerIBIDI81128
Mannelijke elleboog 1/8”Cole-Parmer30505-70
Siliconen slang 1,6 mm IDIBIDI10842
Glazen dekglas No. 1.5H, 25 mm x 75 mmIBIDI10812
Reglo Digital M2-2/12 Peristaltische pompIsmatec
NatriumdodecylsulfaatSigma 71725

Referenties

  1. Sackmann, E. Supported membranes: Scientific and practical applications. Science. 271, 43-48 (1996).
  2. Kraft, M. L., Weber, P. K., Longo, M. L., Hutcheon, I. D., Boxer, S. G. Phase separation of lipid membranes analyzed with high-resolution secondary ion mass spectrometry. Science. 313, 1948-1951 (2006).
  3. Kalb, E., Engel, J., Tamm, L. K. Binding of proteins to specific target sites in membranes measured by total internal reflection fluorescence microscopy. Biochemistry. 29, 1607-1613 (1990).
  4. Bally, M., et al. Norovirus GII. 4 Virus-like Particles Recognize Galactosylceramides in Domains of Planar Supported Lipid Bilayers. Angewandte Chemie International Edition. 51, 12020-12024 (2012).
  5. Bally, M., Graule, M., Parra, F., Larson, G., Höök, F. A virus biosensor with single virus-particle sensitivity based on fluorescent vesicle labels and equilibrium fluctuation analysis. Biointerphases. 8, 10-1186 (2013).
  6. Groves, J. T., Dustin, M. L. Supported planar bilayers in studies on immune cell adhesion and communication. Journal of Immunological Methods. 278, 10-1016 Forthcoming.
  7. Mager, M. D., Melosh, N. A. Lipid Bilayer Deposition and Patterning via Air Bubble Collapse. Langmuir. 23, 9369-9377 (2007).
  8. Lenhert, S., Sun, P., Wang, Y., Fuchs, H., Mirkin, C. A. Massively Parallel Dip-Pen Nanolithography of Heterogeneous Supported Phospholipid Multilayer Patterns. Small. 3, 71-75 (2007).
  9. Mennicke, U., Salditt, T. Preparation of solid-supported lipid bilayers by spin-coating. Langmuir. 18, 8172-8177 (2002).
  10. Tamm, L. K., McConnell, H. M. Supported phospholipid bilayers. Biophysical Journal. 47, 105-113 (1985).
  11. Kalb, E., Frey, S., Tamm, L. K. Formation of supported planar bilayers by fusion of vesicles to supported phospholipid monolayers. Biochim Biophys Acta. 1103, 307-316 (1992).
  12. Reimhult, E., Höök, F., Kasemo, B. Intact vesicle adsorption and supported biomembrane formation from vesicles in solution: influence of surface chemistry, vesicle size, temperature, and osmotic pressure. Langmuir. 19, 1681-1691 (2003).
  13. Cho, N. -J., Jackman, J. A., Liu, M., Frank, C. W. pH-Driven assembly of various supported lipid platforms: A comparative study on silicon oxide and titanium oxide. Langmuir. 27, 3739-3748 (2011).
  14. Boudard, S., Seantier, B., Breffa, C., Decher, G., Felix, O. Controlling the pathway of formation of supported lipid bilayers of DMPC by varying the sodium chloride concentration. Thin Solid Films. , 495-4246 (2006).
  15. Stanglmaier, S., et al. Asymmetric distribution of anionic phospholipids in supported lipid bilayers. Langmuir. 28, 10818-10821 (2012).
  16. Jackman, J. A., Choi, J. -H., Zhdanov, V. P., Cho, N. -J. Influence of osmotic pressure on adhesion of lipid vesicles to solid supports. Langmuir. 29, 11375-11384 (2013).
  17. Rossetti, F. F., Bally, M., Michel, R., Textor, M., Reviakine, I. Interactions between titanium dioxide and phosphatidyl serine-containing liposomes: formation and patterning of supported phospholipid bilayers on the surface of a medically relevant material. Langmuir. 21, 6443-6450 (1021).
  18. Cho, N. -J., Cho, S. -J., Cheong, K. H., Glenn, J. S., Frank, C. W. Employing an amphipathic viral peptide to create a lipid bilayer on Au and TiO2. Journal of the American Chemical Society. 129, 10050-10051 (2007).
  19. Hardy, G. J., et al. Biomimetic supported lipid bilayers with high cholesterol content formed by [small alpha]-helical peptide-induced vesicle fusion. Journal of Materials Chemistry. 22, 19506-19513 (2012).
  20. Wallin, M., Choi, J. -H., Kim, S. O., Cho, N. -J., Andersson, M. Peptide-induced formation of a tethered lipid bilayer membrane on mesoporous silica. European Biophysics Journal. , 1-10 (2014).
  21. Coutable, A., et al. Preparation of tethered-lipid bilayers on gold surfaces for the incorporation of integral membrane proteins synthesized by cell-free expression. Langmuir. 30, 3132-3141 (2014).
  22. Zan, G. H., Jackman, J. A., Cho, N. -J. AH peptide-mediated formation of charged planar lipid bilayers. The Journal of Physical Chemistry B. 118, 3616-3621 (2014).
  23. Jackman, J. A., Zhao, Z., Zhdanov, V. P., Frank, C. W., Cho, N. -J. Vesicle adhesion and rupture on silicon oxide: Influence of freeze–thaw pretreatment. Langmuir. 30, 2152-2160 (2014).
  24. Tabaei, S. R., Choi, J. -H., Haw Zan,, Zhdanov, G., P, V., Cho, N. -J. Solvent-Assisted Lipid Bilayer Formation on Silicon Dioxide and Gold. Langmuir. 30, 10363-10373 (2014).
  25. Hohner, A., David, M., Rädlera, J. Controlled solvent-exchange deposition of phospholipid membranes onto solid surfaces. Biointerphases. 5, 1-8 (2010).
  26. Tabaei, S. R., Jackman, J. A., Kim, S. -O., Zhdanov, V. P., Cho, N. -J. Solvent-Assisted Lipid Self-Assembly at Hydrophilic Surfaces: Factors Influencing the Formation of Supported Membranes. Langmuir. 31, 3125-3134 (2015).
  27. Tabaei, S. R., Vafaei, S., Cho, N. -J. Fabrication of Charged Membranes by the Solvent-Assisted Lipid Bilayer (SALB) Formation. Method on SiO2 and Al2O3. Physical Chemistry Chemical Physics., doi:10.1039/C5CP01428J. , (2015).
  28. Jackman, J. A., Tabaei, S. R., Zhao, Z., Yorulmaz, S., Cho, N. -J. Self-Assembly Formation of Lipid Bilayer. Coatings on Bare Aluminum Oxide: Overcoming the Force of Interfacial Water. ACS Applied Materials & Interfaces. 7, 959-968 (2015).
  29. Keller, C., Kasemo, B. Surface specific kinetics of lipid vesicle adsorption measured with a quartz crystal microbalance. Biophysical Journal. 75, 1397-1402 (1998).
  30. Sundh, M., Svedhem, S., Sutherland, D. S. Influence of phase separating lipids on supported lipid bilayer formation at SiO2 surfaces. Physical Chemistry Chemical Physics. 12, 453-460 (2010).
  31. Cho, N. -J., Frank, C. W., Kasemo, B., Höök, F. Quartz crystal microbalance with dissipation monitoring of supported lipid bilayers on various substrates. Nature Protocols. 5, 1096-1106 (2010).
  32. Beseničar, M. P., Bavdek, A., Kladnik, A., Maček, P., Anderluh, G. Kinetics of cholesterol extraction from lipid membranes by methyl-β-cyclodextrin—A surface plasmon resonance approach. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1778, 175-184 (2008).
  33. Pedersen, S., Jørgensen, K., Baekmark, T. R., Mouritsen, O. G. Indirect evidence for lipid-domain formation in the transition region of phospholipid bilayers by two-probe fluorescence energy transfer. Biophysical journal. 71, 554-560 (1996).
  34. Okonogi, T., McConnell, H. Contrast inversion in the epifluorescence of cholesterol-phospholipid monolayers. Biophysical Journal. 86, 880-890 (2004).
  35. McConnell, H. M., Radhakrishnan, A. Condensed complexes of cholesterol and phospholipids. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes. 1610, 159-173 (2003).
  36. Tabaei, S. R., et al. Formation of Cholesterol-Rich Supported Membranes Using Solvent-Assisted Lipid Self-Assembly. Langmuir. 30, 13345-13352 (2014).
  37. Tabaei, S. R., Jackman, J. A., Liedberg, B., Parikh, A. N., Cho, N. -J. Observation of Stripe Superstructure in the β-Two-Phase Coexistence Region of Cholesterol–Phospholipid Mixtures in Supported Membranes. Journal of the American Chemical Society. 136, 16962-16965 (2014).
  38. Salamon, Z., Wang, Y., Tollin, G., Macleod, H. A. Assembly and molecular organization of self-assembled lipid bilayers on solid substrates monitored by surface plasmon resonance spectroscopy. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes. , 1195-11267 (1994).
  39. Yuan, C., Johnston, L. Phase evolution in cholesterol/DPPC monolayers: atomic force microscopy and near field scanning optical microscopy studies. Journal of microscopy. 205, 136-146 (2002).
  40. Schneider, J., Dufrêne, Y. F., Barger, W. R. Jr, Lee, G. U. Atomic force microscope image contrast mechanisms on supported lipid bilayers. Biophysical Journal. 79, 1107-1118 (2000).
  41. Tamm, L. K., Tatulian, S. A. Infrared spectroscopy of proteins and peptides in lipid bilayers. Quarterly reviews of biophysics. 30, 365-429 (1997).
  42. Miller, C. E., Majewski, J., Gog, T., Kuhl, T. L. Characterization of biological thin films at the solid-liquid interface by X-ray reflectivity. Physical Review Letters. 94, 238104(2005).
  43. Koenig, B. W., et al. Neutron reflectivity and atomic force microscopy studies of a lipid bilayer in water adsorbed to the surface of a silicon single crystal. Langmuir. 12, 1343-1350 (1996).

Herprints en machtigingen

Tags

Gestabiliseerde lipide dubbellaagvesikelfusievorming van lipide dubbellaagoplosmiddeluitwisselingfluorescence recovery after photobleachingkwartskristalmicrobalanscholesterolkwantificatieassay voor membraanfluiditeitmicrofluïdisch kanaal
Biomembraan Fabrication door de Solvent-geassisteerde lipidedubbellaag (SALB) Methode
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.