Layer-by-layer Collageen depositie in Microfluïdische Inrichtingen voor Microtissue Stabilization

Samenvatting

De creatie van functionele microweefsels binnen microfluïdische apparaten vereist de stabilisatie van celfenotypen door traditionele celkweektechnieken aan te passen aan de beperkte ruimtelijke dimensies in microapparaten. Aanpassing van collageen maakt de laag-voor-laag afzetting van ultradunne collageenstructuren mogelijk die primaire cellen, zoals hepatocyten, kunnen stabiliseren als microfluïdische weefselmodellen.

Samenvatting

Hoewel microfluidische systemen een uitstekende controle over de cellulaire micro-omgeving bieden, kan het cultiveren van cellen in microfluïdische apparaten uitdagend zijn. 3D-kweek van cellen in collageen type I-gels helpt om de celmorfologie en functie te stabiliseren, wat noodzakelijk is voor het creëren van microfluïdische weefselmodellen in micro-apparaten. Het vertalen van traditionele 3D-kweektechnieken voor weefselkweekplaten naar microfluïdische apparaten is vaak moeilijk vanwege de beperkte afmetingen van de kanalen. In deze methode beschrijven we een techniek voor het aanpassen van natuurlijk type I collageen om polycationische en polyanionische collageenoplossing te genereren die kunnen worden gebruikt met laag-voor-laag afzetting om ultradunne collageensamenstellingen op cellen te creëren die in microfluïdische apparaten zijn gekweekt. Deze dunne collageenlagen stabiliseren de celmorfologie en functie, zoals getoond met primaire hepatocyten als voorbeeldcel, waardoor de lange termijn kweek van microweefsels in microfluïdische apparaten mogelijk wordt.

Inleiding

Hoewel microfluïdica de mogelijkheid biedt om het cellulaire micro-omgeving nauwkeurig te controleren, kan het cultiveren van cellen, met name primaire cellen, in microfluïdische apparaten een uitdaging zijn. Veel traditionele celkweektechnieken zijn ontwikkeld om de celfunctie te ondersteunen en te stabiliseren wanneer ze in weefselkweekplaten worden gekweekt, maar het is vaak moeilijk om die technieken te vertalen naar microfluïdische apparaten.

Een van die technieken is het kweken van cellen op of ertussen in collageengels als een model van de fysiologische 3D-celomgeving.¹ Type I collageen is een van de meest gebruikte eiwitten voor biomateriaaltoepassingen vanwege zijn alomtegenwoordigheid in de extracellulaire matrix, natuurlijke overvloed, robuuste celanhechtende sites en biocompatibiliteit.² Veel cellen profiteren van 3D-kweek met collageen, waaronder kankercellen^3,45, microvasculaire endotheelcellen⁶ en hepatocyten⁷, onder anderen. Hoewel het gebruik van collageengels gemakkelijk is in open formaten, zoals weefselkweekplaten, maken de beperkte kanaalafmetingen en de gesloten aard van microfluïdische apparaten het gebruik van vloeistoffen die geleren onpraktisch zonder het hele kanaal te blokkeren.

Om dit probleem te overwinnen, hebben we de laag-voor-laag depositietechniek⁸ gecombineerd met chemische modificaties van natuurlijke collageenoplossing om ultradunne collageenassemblages bovenop cellen te creëren die in microfluïdische apparaten zijn gekweekt. Deze lagen kunnen de celmorfologie en functie stabiliseren, vergelijkbaar met collageengels, en kunnen op cellen in microfluïdische apparaten worden gedeponeerd zonder de kanalen te blokkeren met gepolymeriseerde matrix. Het doel van deze methode is om natuurlijk collageen aan te passen om polycationische en polyanionische collageenoplossing te creëren en cellen in microfluïdische kweek te stabiliseren door dunne collageenmatrixassemblages op de cellen te deponeren. Deze techniek is gebruikt om de morfologie en functie van primaire hepatocyten in microfluïdische apparaten te stabiliseren.⁹

Hoewel laag-voor-laag depositie eerder is gerapporteerd met natuurlijke en synthetische polyelektrolyten¹⁰ om hepatocyten in plaatkweek^11,12 te bedekken en als een zaailaag voor hepatocyten in microfluïdische apparaten^13,14, beschrijft deze methode de depositie van een zuivere collageenlaag bovenop hepatocyten, die de 3D-collageenkweektechnieken nabootst. In dit protocol gebruiken we hepatocyten als voorbeeldcellen die kunnen worden onderhouden met 3D-collageenlagen. De vele andere soorten cellen die profiteren van 3D-kweek in collageen kunnen op vergelijkbare wijze profiteren van kweek na laag-voor-laag depositie van een ultradunne collageenmatrixassemblage.

Protocol

1. Voorbereiding van de Native Oplosbare Collageen Solution

1. Bereid of aankoop 200 mg aangezuurd oplosbaar type I collageen van staarten rat op 1-3 mg / ml middels standaard isolatietechnieken protocollen zoals beschreven door Piez et al. ¹⁵
2. Schaal de hoeveelheid uitgangsmateriaal op basis van het gewenste eindvolume van gemodificeerd collageen oplossingen. Ongeveer maken 25-30 ml methylalcohol en 25-30 ml gesuccinyleerd collageen oplossingen, elk met 3 mg / ml, 200 mg oplosbaar natief collageen.

2. Collageen Methylering

1. Verdun 100 mg van de natieve, aangezuurd (pH 2-3) collageenoplossing tot een concentratie van 0,5 mg / met ijskoud steriel water ml en houd de oplossing op ijs gelering te voorkomen.
2. Stel de pH van het collageen oplossing 9-10 met een paar druppels 1 N NaOH en roer bij kamertemperatuur gedurende 30 min. Let op de collageen neerslag, waardoor de oplossing troebel.
3. Spin down de neergeslagen collageen oplossing bij 3000 x g gedurende 25 min. Een heldere, gelachtige precipitaat moet zichtbaar op de bodem van de buisjes. Aspireren en correct afvoeren van de bovenstaande vloeistof.
4. Resuspendeer het neergeslagen collageen in 200 ml methanol met 0,1 N HCl en laat de methyleringsreactie optreden onder roeren bij kamertemperatuur gedurende 4 dagen. Het collageen lost niet op, maar moet apart breken in zeer kleine stukjes zichtbaar dat de oplossing troebel maken.
5. Na methylatie Centrifugeer de oplossing bij 3000 xg gedurende 25 min naar het gemethyleerde collageen pellet. Aspireren en afvoeren van de aangezuurde methanol supernatant.
6. Los het gemethyleerde collageen in 25 ml steriel PBS, waardoor een concentratie van ongeveer 3 mg / ml, met herhaalde pipetteren, en filtreer de oplossing door een 60 urn zeef cel. Stel de pH van de oplossing 7,3-7,4 via 20 gl stappen van 1 N NaOH.
7. Beoordeel de concentration van de oplossing met behulp van een commercieel rat collageen ELISA-kit of hydroxyproline testkit. Verdun de oplossing 3 mg / ml met steriele PBS.
8. Steriliseer de gemethyleerde collageenoplossing door deze naar een glazen flesje met een schroefdop, zorgvuldig lagen 3 ml chloroform op de bodem van de fles, zodat de fles O / N ingesteld op 4 ° C, en vervolgens aseptisch verwijderen en de toplaag, welke de gemethyleerd collageen.
9. Bewaar de oplossing bij 4 ° C voor gebruik binnen 1 maand.

3. Collageen succinileringsgraad

1. Verdun de andere 100 mg van de natieve, aangezuurd (pH 2-3) collageenoplossing tot een concentratie van 0,5 mg / met ijskoud steriel water ml en houd de oplossing op ijs gelering te voorkomen.
2. Stel de pH van het collageen oplossing 9-10 met een paar druppels 1 N NaOH en roer bij kamertemperatuur gedurende 30 min. Het collageen moet neerslaan, waardoor de oplossing troebel.
3. Los op 40 mg succinic anhydride (0,4 mg per mg collageen) in 10 ml aceton (1/20 ^ste het volume van de collageenoplossing). Langzaam (ongeveer 0,5 ml stappen) voeg dit mengsel aan de collageenoplossing onder roeren terwijl continu de pH. Handhaving van de pH boven 9,0 door toevoeging van 1 of 2 druppels 1 N NaOH de pH 9,0 bereikt.
4. Blijf roeren bij kamertemperatuur 120 min na het toevoegen van alle barnsteenzuuranhydride in aceton. Neem de oplossing duidelijk worden als de gesuccinyleerde collageen oplost. Controleer regelmatig de pH-waarde om ervoor te zorgen dat boven 9,0 blijft.
5. Stel de pH van de oplossing tot 4,0 met 20 gl stappen van 1 N HCl. Neem de oplossing bewolkt weer, omdat de gesuccinyleerde collageen neerslaat.
6. Na succinileringsgraad Centrifugeer de oplossing bij 3000 xg gedurende 25 min naar het gesuccinyleerde collageen pellet. Aspireren en afvoeren van de bovenstaande aangezuurd met gereageerde barnsteenzuuranhydride.
7. Los de gesuccinyleerd collageenin 25 ml steriel PBS, waardoor een concentratie van ongeveer 3 mg / ml, met herhaalde pipetteren, en filtreer de oplossing door een 60 urn zeef cel. Stel de pH van de oplossing 7,3-7,4 via 20 gl stappen van 1 N NaOH.
8. Beoordeel de concentratie van de oplossing met behulp van een commercieel collageen rat ELISA-kit of hydroxyproline testkit. Verdun de oplossing 3 mg / ml met steriele PBS.
9. Steriliseer de gesuccinyleerde collageenoplossing door deze naar een glazen flesje met een schroefdop, zorgvuldig lagen 3 ml chloroform op de bodem van de fles, zodat de fles O / N ingesteld op 4 ° C, en vervolgens aseptisch verwijderen en de toplaag, welke de gesuccinyleerde collageen.
10. Bewaar de oplossing bij 4 ° C voor gebruik binnen 1 maand.

4. Verificatie van de Collagen Wijzigingen

1. Bereid 1 ml monsters van elk van de natieve, gemethyleerd en gesuccinyleerd collageen oplossingen en verdun tot een concentration van 0,1 mg / met steriel zuiver water waterstofionen titratie ml. Verdun de buffer tenminste 1000-voudig door dialyse tegen water door een 10 kDa cutoff membraneusing 3 oplossing verandert gedurende ten minste 4 uur elk.
2. Stel de pH van de oplossingen tot 7,3 met kleine hoeveelheden NaOH en HCl. Gebruik van pH 7,3 als een willekeurige referentie voeren waterstofionen titratie op elk van de monsters zoals beschreven door Tanford ¹⁶ titratie curven voor de natieve, gemethyleerd en gesuccinyleerd collageen oplossingen.
3. Plot de pH verandering per volume zuur versus het aantal gebonden H ⁺ -ionen per molecuul toegevoegd. De hoge pH "amino" bereik zou een verschuiving in de gesuccinyleerde collageen aan het sterpunt (verlies van aminegroepen) vertonen, en de lage pH "carboxyl" bereik zou een verschuiving naar links in de gemethyleerde collageen (een verlies van carboxylgroepen blijkt ) en een verschuiving naar rechts in de gesuccinyleerde collageen (een winst in carboxylgroeps), vergeleken met het natief collageen.
4. Beoordelen van de werkzaamheid van de succinilerings- reactie door bepaling van het% van de aminogroepen in de natieve collageen vervangen door succinyleren met de 2,4,6-trinitrobenzeensulfonzuur (TNBA) colorimetrische methode volgens standaard protocollen ^17,18.

5. Fabricage van microfluïdische apparaten en Cell zaaien

1. Fabriceren microfluïdische apparaten met behulp van standaard methoden ^9. Gebruik replica gieten van PDMS van de SU-8 masters op silicium gedefinieerd met behulp van fotolithografie om microfluïdische celkweek kamers te creëren met 100 micrometer lang, 0,4-1,5 mm breed, en 1-10 mm lange kanalen voor celgroei.
2. Gebruik een plasma cleaner om de oppervlakken van het apparaat en een glasplaatje oxideren en druk samen om obligatie. Na het steriliseren van de inrichting door blootstelling aan UV licht gedurende ten minste 30 min, vult de kamer met 50 ug / ml fibronectine in steriele PBS en incubeer bij 37 ° C gedurende 45 min.
3. Zaad van de inrichting met cellen, zoals primaire rat en humane hepatocyten, waarbij een collageengel voor het stabiliseren van fenotype of differentiatie toestand vereist. We maken gebruik van 20 ul van vers geïsoleerde primaire rat hepatocyten ^7,19 of in de handel verkrijgbaar gecryopreserveerde primaire humane hepatocyten gezaaid met 14 x 10 ⁶ cellen / ml per apparaat.
4. Laat de cellen te hechten voor 4-6 uur, en daarna wassen uit losse cellen en vervang de beplating media met een groei media. Incubeer O / N op volledige cellen waarborgen spreiding en een confluente monolaag van cellen.

6. Laag-voor-laag collageenafzetting

1. In een laminaire stroming weefselkweek kap Bereid voldoende hoeveelheden gemethyleerd en gesuccinyleerd collageen oplossingen voor 10 toepassingen van elke oplossing per apparaat, evenals een paar ml media. Houd de oplossingen op ijs. We maken gebruik van 20 ul (10-15 keer het totale volume van het apparaat) van collageen per laag per apparaat.
2. Zijnstrikken met de gemethyleerd (polykationische) oplossing, alternatieve spoelen van de apparaten met 20 ul van gemethyleerd en vervolgens gesuccinyleerd collageen oplossingen, wacht 1 minuut tussen iedere toepassing. Spoel de inrichting in totaal 10 keer per oplossing, die ongeveer 20 minuten moet nemen. Werk snel de tijd de cellen zonder media te minimaliseren.
3. Observeren collageen langzaam ophopen aan de ingang / uitgang afhankelijk van de grootte. Als de weerstand tegen stroming toeneemt, spoelt het apparaat een of twee keer met de media, en dan verder gelaagdheid.
4. Na het aanbrengen van alle lagen, de inrichting spoel tweemaal met vers medium en terug naar de incubator. Afhankelijk van het celtype, de extracellulaire matrix geïnduceerde morfologische veranderingen, zoals verhoogde polarisatie in hepatocyten, zichtbaar binnen enkele uren moet zijn.
5. Bereid representatieve inrichtingen voor transmissie elektronenmicroscopie middels standaardwerkwijzen ⁹ om de aanwezigheid van een collageen matrix verifiërenmontage bovenop de gekweekte cellen.

7. Stabilisatie van celfenotype en functie

1. Afbeelding de celmorfologie, levensvatbaarheid en polariteit toepassing van standaardmethoden voor het celtype. Voor hepatocyten, beelden verzamelen van meer dan 14 dagen met behulp van fase microscopie, Live / DEAD kleuring voor levensvatbaarheid en CMFDA kleurstof voor apicale polarisatie om de effecten van de collageen afzetting tonen.
2. Voor celmorfologie, spoelt het apparaat via de inlaat met een pipet met 20 ul van PBS te spoelen, injecteren 20 pi PBS, en het beeld van het apparaat met behulp van fasecontrastmicroscopie.
3. Voor Live / DEAD kleuring, spoelt de inrichting door de inlaat met een pipet met 20 pl PBS te spoelen, injecteren 20 ul van LIVE / DEAD kleuroplossing met DAPI bereid volgens de instructies van de fabrikant, incubeer 30 min bij 37 ° C, spoelen weer apparaat met 20 ul van PBS, en het beeld van het apparaat met behulp van fluorescentie microscopie.
4. Voor gal canaliCuli kleuring, spoelt de inrichting door de inlaat met een pipet met 20 pl PBS te spoelen, injecteer 20 gl 2 pM CMFDA kleuroplossing met DAPI bereid volgens de instructies van de fabrikant, incubeer 30 min bij 37 ° C, spoel het apparaat opnieuw met 20 ul van PBS, en het beeld van het apparaat met behulp van fluorescentie microscopie.
5. Het verzamelen van de uitgegeven media en meet cellulaire metabolische producten op de juiste tijdstippen over de duur cultuur aan de celfunctie te bepalen. Voor hepatocyten, meet de hoeveelheid albumine en ureum in de media bracht.
6. Voer eindpunt functionele analyses van de cellen zelf, zoals het beoordelen enzymactiviteit niveaus antilichaamkleuring of RNA analyse. Voor hepatocyten induceren en het meten van cytochroom P450 enzym activiteiten of fase II vervoeging enzym glutathion S-transferase.

Resultaten

Natief collageen kan worden gewijzigd met behulp van methylering en succinileringsgraad te polykation en polyanion collageen oplossingen voor gebruik in laag-voor-laag depositie creëren. Succinileringsgraad wijzigt de ε-aminogroepen van natief collageen met succinyl groepen en methylering wijzigt de carboxylgroepen van natief collageen met een methylgroep (Figuur 1A). Deze modificaties aan het collageen eiwit aminozuurzijketens weg pH titratie krommen voor oplossingen. Succinileringsgraad vermindert het...

Discussie

Ultradunne pure collageen samenstellingen kunnen worden gestort op rekening gebracht cellen of materiaal oppervlakken met behulp van laag-voor-layer deposition van gemodificeerde collageen. De resultaten van deze studie tonen aan dat methylatie en succinylatie van natief collageen maken polykation en polyanion collageen oplossingen (figuur 1) die kan worden gebruikt met de laag-voor-laag techniek om ultradunne collageen matrix samenstellingen afzetten op cellen (figuur 2) of andere gela...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
collageen type I, rattenstaart	Life Technologies	A1048301	optie voor geconcentreerd rattenstaart collageen
collageen type I, rattenstaart	Sigma-Aldrich	C3867-1VL	optie voor geconcentreerd rattenstaart collageen
collageen type I, rattenstaart	EMD Millipore	08-115	optie voor geconcentreerd rattenstaart collageen
collageen type I, rattenstaart	R%D Systems	3440-100-01	optie voor geconcentreerd rattenstaart collageen
succinezuuranhydride	Sigma-Aldrich	239690-50G	succinyleringsreagens
watervrij methanol	Sigma-Aldrich	322415-100ML	methyleringsreagens
natriumhydroxide	Sigma-Aldrich	S5881-500G	pH-precipitatiereagens
zoutezuur	Sigma-Aldrich	320331-500ML	pH-precipitatiereagens
ratten collageen type I ELISA	Chondrex	6013	optie voor het detecteren van collageengehalte
hydroxyproline assay kit	Sigma-Aldrich	MAK008-1KT	optie voor het detecteren van collageengehalte
hydroxyproline assay kit	Quickzyme Biosciences	QZBtotcol1	optie voor het detecteren van collageengehalte