Interfacing 3D Engineered neuronale culturen op micro-elektrode arrays: een innovatieve In Vitro Experimental Model

Samenvatting

In dit werk wordt een nieuw experimenteel model gepresenteerd waarin 3D neuronale culturen gekoppeld zijn aan vlakke Micro-Elektrode Array's (MEA's). 3D netwerken worden gebouwd door neuronen te zaaien in een schaal gemaakt van glazen microbeads waarop neuronen groeien en onderling verbonden 3D structuren vormen.

Samenvatting

Momenteel zijn grootschalige netwerken afgeleid van gedissocieerde neuronen die in vitro groeien en zich ontwikkelen op extracellulaire micro-transducer apparaten de gouden standaard experimenteel model om fundamentele neurofysiologische mechanismen te bestuderen die betrokken zijn bij de vorming en het onderhoud van neuronale celassemblages. Echter, in vitro studies zijn beperkt gebleven tot het registreren van de elektrofysiologische activiteit gegenereerd door bi-dimensionele (2D) neurale netwerken. Niettemin, gezien de ingewikkelde relatie tussen structuur en dynamica, is een aanzienlijke verbetering noodzakelijk om de vorming en de ontwikkelingsdynamica van driedimensionale (3D) netwerken te onderzoeken. In dit werk wordt een nieuw experimenteel platform gepresenteerd waarin 3D hippocampale of corticale netwerken gekoppeld zijn aan vlakke Micro-Electrode Arrays (MEAs). 3D netwerken worden gerealiseerd door neuronen te zaaien in een schaal van glazen microbeads (30-40 µm in diameter) waarop neuronen kunnen groeien en complexe onderling verbonden 3D assemblages vormen. Op deze manier is het mogelijk om geconstrueerde 3D netwerken te ontwerpen bestaande uit 5-8 lagen met een verwachte uiteindelijke celdichtheid. De toenemende complexiteit in de morfologische organisatie van de 3D assemblage induceert een verbetering van de elektrofysiologische patronen die door dit type netwerken worden weergegeven. In vergelijking met de standaard 2D netwerken, waar zeer stereotiepe burstactiviteit ontstaat, verandert de 3D structuur de burstactiviteit in termen van duur en frequentie, en stelt het ook de observatie van meer willekeurige spiking activiteit mogelijk. In die zin lijkt het ontwikkelde 3D model dichter op in vivo neurale netwerken.

Inleiding

In vitro tweedimensionale (2D) neurale netwerken gekoppeld aan micro-elektrode arrays (MEA) arethe gouden standaard aangenomen om de wisselwerking tussen neuronale dynamiek en de onderliggende connectiviteit bestuderen experimenteel model. Tijdens de ontwikkeling, de neuronen recreëren complexe netwerken die goed weergegeven definedspatio-temporalpatternsof activiteit ^1,2 (dat wil zeggen, uitbarstingen, netwerk uitbarstingen, willekeurige spiking activiteit). MEA registreren de elektrofysiologische activiteit van vele sites (van tientallen tot duizenden micro-electroden), waardoor een grondig onderzoek van de expressie dynamiek op netwerkniveau. Bovendien, het gebruik van gedissocieerde kweken maakt possibile engineered-netwerken te ontwerpen. Het is gemakkelijker te begrijpen op deze wijze de functionele verbanden tussen de opgenomen elektrofysiologische activiteit en de parameters van het netwerk organisatie als celdichtheid ^3, modulariteit ^4,5, aanwezigheid van heterogene neuronale populations ^6, etc. Echter, alle in vitro naar gescheiden gekweekte cellen op basis van 2D-neuronale netwerken. Deze benadering leidt tot vereenvoudigingen ten opzichte van de in vivo (intrinsiek 3-dimensionale, 3D) systeem: (i) in een 2D-model, somata en groei kegels afgevlakt en de axonen-dendrieten uitgroei kan verspreiden in alle richtingen ^7. (ii) 2D in vitro netwerken vertonen stereotiep elektrofysiologische dynamiek gedomineerd door barsten activiteit die het grootste deel van de neuronen van het netwerk ^8.

Recentelijk zijn verschillende oplossingen ontwikkeld om de constructie van in vitro 3D gedissocieerde neuronale netwerken mogelijk maken. Het gemeenschappelijke idee bestaat in het creëren van een steiger waar de neuronen kunnen groeien in een 3D-mode. Een dergelijke steiger kan worden gerealiseerd met polymeer gels en vaste poreuze matrices ^9-13. Door het benutten van de mechanische eigenschappen van de polymeren, is het mogelijk om cellen in te bedden these structuren door het definiëren van een uniform blok 3D culturen van neurosferen ^11. Het belangrijkste kenmerk van deze aanpak is de starre mechanische eigenschap van de neurosferen ^9,12. Echter, deze materialen beperkt porositeit, en dat doen ze niet garanderen celmigratie in de matrix. Om dit nadeel te ondervangen, een mogelijke oplossing bestaat uit het doorsnijden van de matrix in "eenheid" modules. Helaas, kunnen de grootte en vorm diversiteit van de deeltjes de pakking in reguliere gelaagde structuren belemmeren. In ^7, Cullen en medewerkers ontworpen 3D neuronale construct uit neuronen en / of astrocyten binnen een bioactief extracellulair matrix-gebaseerde scaffold. Een dergelijke gemanipuleerde zenuwweefsel toegestaan ​​in vitro onderzoek te bestuderen en te manipuleren neurobiologische reacties binnen 3D micro-omgevingen. Dit model bestaat uit neuronen en glia gedistribueerd door de extracellulaire matrix (ECM) en / of hydrogel scaffolds (500-600 micrometer dik). In dit condition een optimale cellevensvatbaarheid (meer dan 90%) werd gevonden door uitplaten cellen bij een uiteindelijke dichtheid van ongeveer 3750 - 5000 cellen / ^mm3. Opgemerkt zij dat een dergelijke dichtheidswaarde veel lager dan in de in vivo toestand, wanneer de celdichtheid van muizenhersenen cortex ongeveer 90.000 cellen / mm ^{3 14.} Om deze beperking te overwinnen Pautot en medewerkers ¹⁵ realiseerde een 3D in vitro systeem waarbij de celdichtheid en netwerkconnectiviteit gecontroleerd te lijken in vivo omstandigheden tegelijk een real-time weergave van het netwerk. Praktisch is deze methode gebaseerd op het concept dat gedissocieerde gekweekte neuronen kunnen groeien op silica microkorrels. Deze kralen te groeioppervlak groot genoeg voor neuronale cellichamen te houden en hun arborizations groeien, rijpen, uitbreiden en definiëren synaptische contacten met andere neuronen. Deze methode maakt het spontane samenstel eigenschappen van mono-gedispergeerde kralen FOrm 3D gelaagde zeshoekige arrays met verschillende subsets van neuronen op verschillende lagen met constrained verbinding tussen neuronen van verschillende kralen. De bereikte celdichtheid met deze methode ongeveer 75.000 cellen / ^mm3.

Onlangs hebben we methode Pautot's aangepast MEA ^16: de verkregen resultaten blijkt dat de 3D ​​elektrofysiologische activiteit presenteert een breder repertoire activiteiten dan het door 2D maken zich. 3D volwassen culturen vertonen een verbeterde dynamiek waarin zowel het netwerk burst en willekeurige spike activiteit naast elkaar bestaan. Evenzo Tang-Schomer en ¹⁷ medewerkers realiseerde een zijde eiwit-gebaseerde poreuze scaffold die een primaire corticale kweken handhaaft in vitro enkele maanden, en nam de elektrofysiologische activiteit middels een wolfraamelektrode.

In dit werk, de experimentele procedures 3D neuronale netwerken gekoppeld aan MEA bouwen wordt beschreven.

Protocol

Het experimentele protocol werd door de Europese Animal Care wetgeving (2010/63 / EU), door het Italiaanse ministerie van Volksgezondheid goedgekeurd in overeenstemming met de DL 116/1992 en door de richtlijnen van de Universiteit van Genua (Prot. N. 13.130, mei 2011). Alle inspanningen werden gedaan om het aantal dieren dat voor het project te verminderen en hun lijden te minimaliseren.

1. Voorbereiding van Materialen en Supports

1. Construct de mal om de PDMS (Poly-dimethyl-siloxaan) constraint te bouwen door middel van een CNC (Computer Numerical Control) freesmachine. Een dergelijke vorm wordt gerealiseerd in polycarbonaat met de centrale cilinder polytetrafluorethyleen (PTFE). Dit materiaal maakt eenvoudiger extractie van het masker nadat het PDMS is uitgehard.
   NB: Het ontwerp van de mal is uitgevoerd door Computer-Aided Design (CAD) en vervolgens geleverd aan de CNC-freesmachine.
2. Bereid de PDMS elastomeer. PDMS is een organisch polymeer. Het bestaat uit twee elementenEen hardingsmiddel en een polymeer. Vermengen door een volumeverhouding van 1:10, een deel hardingsmiddel en negen delen polymeer. Leg de twee componenten in een petrischaal, schud en plaats het mengsel in de vacuümkamer gedurende 10 min om luchtbellen te elimineren. 3 g PDMS is voldoende voor een beperking.
3. De bouw van het PDMS beperking. Plaats de PDMS materiaal in de boetseerder en zet het in de oven gedurende 30 min bij 120 ° C. De PDMS beperking heeft de vorm van een ideale cilinder met een uitwendige en inwendige diameter van 22,0 en 3,0 mm respectievelijk en een hoogte van 650 urn.
4. De dag voor de beplating, stel het masker op het actieve gebied van de micro-elektrode arrays (MEA) met behulp van een pincet onder een stereomicroscoop en steriliseer de PDMS masker in de oven op 120 ° C.
5. Steriliseer de glasmicrokralen (nominale diameter van 40 ± 2 urn; gecertificeerd gemiddelde diameter van 42,3 ± 1,1 pm) in 70% ethanol gedurende 2 uur in een konische flesje en draai every 30 min om alle microbolletjes bloot.
6. Verwijder de ethanol-oplossing uit het flesje en spoel de microbolletjes twee keer met gesteriliseerd water.
7. Conditioneer het centrale deel van het MEA afgebakend door PDMS masker (diameter gelijk aan 3,0 mm) met 24 gl gemengde oplossing van Poly-D-Lysine en laminine bij 0,05 ug / ml.
8. Coat de microkorrels met adhesie-eiwitten, laminine en poly-D-lysine op 0,05 ug / ml en laat ze een nacht in de incubator bij 37 ° C, een stabiele en langdurige neurale netwerk te verkrijgen.
9. Verwijder de adhesiefactoren zowel het glazen oppervlak van de MEA en de microbolletjes van glas. Zuig ongeveer 95% van de bekledingsoplossing met een pipet en breng een kleine volume- 24μl- steriel water op het oppervlak MEA. Zuig weer meer dan 95% van het water en laat het MEA drogen onder laminaire kap 1 uur vóór het uitplaten van de cellen.
   OPMERKING: Bij microkorrels plaats, zuig het coatingoplossing en een eerste wassen met gesteriliseerd water en een tweede met het basismedium en de aanvulling zoals B27, teneinde het glasoppervlak waarin neuronen wordt uitgeplaat conditie. Laat de microbolletjes droog. Laat ze in suspensie in het kweekmedium in de flacon.
10. Verdeel met behulp van een pipet -200 μl-, de suspensie van microbolletjes behandelde (ongeveer 32.000) op een plaat met meerdere putjes met insert membraan (poriediameter 0,4 urn) wanneer zij zelfassemblage vorming van een uniforme laag.
11. Vul elk putje van het membraan met 0,5 ml medium en zet het in de incubator (T = 37,0 ^o C, CO ₂ = 5%) tot de neuronen zijn klaar om te worden verzilverd (3.2).

2. Dissectie van embryo's en dissociatie van Tissue

1. Vrouwelijke ratten huis volwassen (200-250 g) bij een constante temperatuur (22 ± 1 ° C) en luchtvochtigheid (50%) onder normale licht-donker schema (light-on 7 AM-PM 7) in dedier faciliteit. Zorg ervoor dat voedsel en water zijn vrij beschikbaar.
2. Verdoven een zwangere vrouwelijke ratten na 18 dagen van ontwikkeling (E18) met 3% isofluraan. Vervolgens offeren het dier door cervicale dislocatie.
3. Hippocampus verwijderd uit elk embryo rat en plaats ze in ijskoude Hank's gebalanceerde zoutoplossing zonder ^Ca2 + en ^Mg2 +. Op dag 18 van de ontwikkeling hippocampus en cortex weefsels zeer zacht en hoeven niet in kleine stukjes te snijden. Nadere details vindt u ^18,19.
4. Distantiëren het weefsel in 0,125% trypsine / Hank's oplossing bevattende 0,05% DNAse gedurende 18-20 min bij 37 ° C.
5. Verwijder de bovenstaande vloeistof met een Pasteur pipet en stopt de enzymatische digestie door het toevoegen van medium met 10% foetaal runderserum (FBS) gedurende 5 min.
6. Verwijder het medium met FBS en eenmaal wassen met het medium met supplement, 1% L-glutamine, gentamicine 10 ug / ml. Verwijder opnieuw het medium met een Pasteur pipette en vult deze opnieuw met een kleine hoeveelheid (500 ui) van het groeimedium met supplement, 1% L-glutamine, gentamicine 10 ug / ml.
7. Distantiëren van het weefsel pellet mechanisch met een smalle Pasteur pipet tot er een melkachtige suspensie van cellen is duidelijk. Het is niet nodig de celsuspensie centrifuge.
8. Verdun het kleine volume celsuspensie met het groeimedium tot een eindvolume van 2,0 ml. Tel de verkregen cellulaire concentratie met een hemocytometer kamer. Verdun deze concentratie 1: 5 om het gewenste celconcentratie van 600-700 cellen / ul te verkrijgen.

3. Cell Plating

1. Plate cellen bij een dichtheid van ongeveer 2000 cellen / mm ² op het actieve gebied van de MEA, gedefinieerd door de PDMS beperking voor een 2D neuronaal netwerk.
   OPMERKING: Elke hippocampus bevat ongeveer 5 x 10 ⁵ cellen (1 x 10 ⁶ voor een enkele embryo). Ontleden 6 embryo's tot een totaal bedrag van 6 x 10 krijgen⁶ cellen in 2 ml en een geschatte concentratie van 3000 cellen / ul. Verdun deze concentratie 1: 5 om het gewenste celconcentratie te verkrijgen en de plaat ongeveer 600-700 cellen / ul. Als het MEA afgebakend door PDMS constraint ongeveer 7,065 mm ^2, en het totale aantal cellen uitgeplaat 600 cellen / ul x 24 gl = 14.400 cellen de uiteindelijke dichtheid van 2038 cellen / ^mm2.
2. Plaats de MEA inrichtingen in de incubator met bevochtigde _CO2 atmosfeer (5%) bij 37 ° C.
3. Verdeel 160 pi van de suspensie met een celconcentratie van 600-700 cellen / pl (ongeveer 100,000 cellen) op het oppervlak van de microbolletjes monolaag gepositioneerd binnen de multiwell platen om de eerste stap bij de constructie van driedimensionale cultuur voltooien. Zet de multiwell platen in de incubator met bevochtigde _CO2 atmosfeer (5%) bij 37 ° C.

4. 3D Neuronal Netwerk Bouw

1. 6-8 uur na het plateren, breng de suspensie (microkorrels met neuronen) vanaf het multiwell platen voorzichtig binnen het gebied begrensd door de PDMS beperking met behulp van een pipet instellen voor een volume van ongeveer 30-40 pl. Na elke overdracht, wacht ongeveer een halve minuut, om de microbolletjes om zichzelf assembleren in een hexagonale compacte structuur mogelijk te maken.
2. Zodra alle lagen worden afgezet en spontaan geassembleerd, vullen met een grote daling van ongeveer 300 ul medium boven het gebied begrensd door de PDMS constraint.
3. Zet de 3D ​​structuur gekoppeld met de MEA in incubator (T = 37,0 ^{° C,} CO ₂ = 5%) gedurende 48 uur voordat een eindvolume (ongeveer 1 ml) groeimedium kweek met supplement.
   OPMERKING: Beschouw het totale aantal kralen op de multiwell platen met membraan insert (30000) en het aantal kralen op een enkele laag op de MEA inrichting (6000). Het resulterende 3D-structuur bestaat uit 5 lagen microbeads en cellen. Aangezien de 3D neurale netwerk niet geometrisch perfect kan het resulterende 3D-structuur bestaat uit 5-8 lagen.
4. De dag na plating, zorgvuldig het uiteindelijke volume van het medium (ongeveer 900 pl) in de MEA ring toe te voegen. Handhaaf de 3D ​​kweken in een bevochtigde _CO2 atmosfeer (5%) bij 37 ° C gedurende 4-5 weken. Vervang de helft van het medium eenmaal per week.

5. confocale microscopie Acquisition

1. Bevestig de biologische monsters tot het stadium van de microscoop in een houder. Stel de laser (Argon, 496-555 nm), de scansnelheid (400 Hz), waarbij aan het beeld, de versterking en offset (-0,3%) van de PMT te verwerven voor elk beeld om de juiste bandbreedte emissie-filter en om vast te leggen verzadiging voorkomen en de signaal-ruisverhouding te verhogen. De resultaten afdeling rapporteert de waarden die worden gebruikt om de beelden van figuur 4 te verwerven.
2. Voor de verwerving van de z -stack volgorde, sparst selecteren, de waarde van de Z-positie van de bovenste en de onderste laag van het monster, en selecteer vervolgens de stap grootte om de overname te maken.

Resultaten

. In deze experimentele procedure wordt een belangrijke rol gespeeld door de microkorrels dat de mechanische scaffold de groei van de 3D ​​neurale netwerk te definiëren figuren 1A en B tonen de opstelling van de microkorrels (nominale diameter van 40 ± 2 urn; gecertificeerd gemiddelde diameter 42,3 ± 1,1 micrometer) in het vliegtuig. De bijzonderheid van dergelijke structuren is dat microkorrels spontaan zelfassemblage die een compact hexagonale geometrie (Figuur 1B en C). De zo gegener...

Discussie

In dit werk, een nieuw experimenteel in vitro platform opgebouwd uit 3D-engineered neuronale culturen gekoppeld aan MMO's voor netwerk-elektrofysiologie is gepresenteerd. Het gebruik van microbolletjes als scaffold de neuritische uitgroei langs de z-as toe is afgestemd worden geïntegreerd met de vlakke MEA. Op deze wijze verkregen micro-systeem resulteert in een valide en betrouwbare in vitro 3D model voor de opkomende elektrofysiologische dynamiek ¹⁶ bestuderen.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Laminine	Sigma-Aldrich	L2020	0,05 µg/ml
Poly-D-lysine	Sigma-Aldrich	P6407	0,05 µg/ml
Trypsine	Gibco	25050-014	0,125% verdund 1:2 in HBSS zonder CA++, MG++
DNAase	Sigma-Aldrich	D5025	0,05% verdund  in Hanks oplossing
Neurobasal	Gibco Invitrogen	21103049	kweekmedium
B27	Gibco Invitrogen	17504044	2% mediumsupplement
Fetaal bovien serum (FBS)	Sigma-Aldrich	F-2442	10%
Glutamax-I	Gibco	35050038	0,5 mM
gentamicine	Sigma-Aldrich	G.1272	5 mg/L
Poly-Dimethyl-Siloxaan (PDMS)	Corning Sigma	481939	hardingsmiddel en de polymeer
Micro-Elektrode Arrays	Multi Channel Systems (MCS)	60MEA200/30-Ti-pr	MEA met: Elektrodenrooster 8x8; Elektrodeafstand en diameter 200 en 30 µm, respectievelijk; plastic ring zonder schroefdraad
Microkraal	Distrilab-Duke Scientific	9040	1 gr Glas Deel. Grootte Stds 40 µm
Transwell	Costar Sigma	CLS 3413	multiwell platen met membraaninzet (6,5 mm diameter poreus 0,4 µm)
HBSS zonder Ca++,Mg++	Gibco Invitrogen	14175-052
Hanks Buffer Oplossing	Sigma	H8264
Teflon	Sigma	430935-5G	polytetrafluorethyleen
Ratten	Sprague Dawley	Wistar Rat
Confocale Microscopie Rechtopstaand	Leica	TCS SP5 AOBS
20,0x0,50 WATER objectief	Leica	Leica HCX APO L U-V-I
40,0x0,80 WATER objectief	Leica	Leica HCX APO L U-V-I
25,0x0,95 WATER objectief	Leica	HCX IRAPO L