Sandwich-achtige microenvironments Harness Cell / Material Interactions

Samenvatting

Het volgende protocol beschrijft de procedure om sandwich-achtige culturen te assembleren die kunnen worden gebruikt als een tussenstadium tussen bi-dimensionele (2D) en driedimensionale (3D) cellulaire omgevingen. De ontworpen systemen kunnen toepassingen hebben in microscopie, biomechanica, biochemie en celbiologie assays.

Samenvatting

Celcultuur is van oudsher uitgevoerd op twee-dimensionale (2D) substraten waar de cellen hechten behulp ventrale receptoren aan het biomateriaal oppervlak. Echter in vivo meeste cellen zijn volledig omringd door de extracellulaire matrix (ECM), resulterend in een driedimensionale (3D) verdeling receptoren. Dit kan leiden tot verschillen in de buiten-signaalroutes en dus celgedrag.

Dit artikel laat zien dat het stimuleren van de dorsale receptoren van de cellen al tot een 2D-substraat gehandeld door overlappen een film van een nieuw materiaal (een sandwich-achtige cultuur) triggers belangrijke wijzigingen ten opzichte van standaard 2D culturen. Verder is de gelijktijdige excitatie van ventrale en dorsale receptoren verschuift celgedrag dichter bij die gevonden in 3D omgevingen. Bovendien, vanwege de aard van het systeem, een sandwich-achtige cultuur is een veelzijdig instrument dat de studie van verschillende parameters in cel / materiaal inte toelaatractions bijvoorbeeld topografie, stijfheid en ander eiwit coatings op zowel de ventrale en dorsale zijde. Ten slotte, sandwich-achtige cultures op basis van 2D substraten verscheidene analyseprocedures reeds ontwikkeld voor standaard 2D kweken kan normaal worden gebruikt, overwinnen complexere procedures die nodig zijn voor 3D-systemen.

Inleiding

Traditioneel is celcultuur uitgevoerd op tweedimensionale (2D) substraten, hoewel de meeste van de in vivo cellulaire micromilieus een driedimensionale (3D) aard. Deze onnatuurlijke 2D milieu veroorzaakt veranderingen in cel gedrag als een manier van zelf-aanpassing aan een platte wereld, die rechtstreeks invloed lot van de cel ^1,2. Derhalve resultaten verkregen 2D celculturen niet altijd reproduceerbaar in vivo. Dit heeft de ontwikkeling van nieuwe relevante kweeksystemen die meer fysiologische-achtige omstandigheden verder inzicht in elke dimensie afhankelijk biologisch mechanisme ^3,4 krijgen verschaffen aangemoedigd.

Een van de belangrijkste verschillen tussen 2D cultuur en 3D in vivo omgeving is de verdeling van celreceptoren verankerd aan de extracellulaire matrix (ECM) dat 2D substraten cellen hechten ventraal, worden de meeste cellen in vivo volledig omringd door de ECM en dus cell hechting gebeurt door middel van een 3D verdeling van de receptoren. Dit brengt verschillende celadhesie signaalwegen daardoor belangrijke processen zoals celgroei, celdifferentiatie en genexpressie moduleren. Gedurende de laatste decennia hebben veel verschillende 3D ​​kweeksystemen vastgesteld ^5-8, hoewel hun variabiliteit en complexiteit belemmeren hun normalisatie in cultuur procedures gemeenschappelijke cel. Bovendien 3D systemen zijn gewoonlijk moeilijk te hanteren en de huidige experimentele procedures 2D substraten kunnen niet gemakkelijk worden vastgesteld voor 3D-kweken. Bovendien, literatuur zelden vergelijkt 3D culturen met het equivalent 2D conditie of andere 3D-systemen, belemmeren de juiste begrip van de cel gedrag in deze modellen.

Eens dat de cellen gehecht aan een 2D substraat, de excitatie van de dorsale receptoren - door bedekken een laag van een nieuw materiaal (sandwich-achtige kweek) - kan leiden celreacties zowel 3D-omgevingen. De reason hierachter is de gelijktijdige activatie van beide dorsale en ventrale receptoren te houden en verspreiding in de sandwich-omgeving (figuur 1) ^9,10. Bijgevolg cellen ondergaan belangrijke verandering ten opzichte 2D culturen ^11,12. Zo is lot van de cel bepaald tijdens de montage vanwege de sandwich cultuur, omdat de dorsale stimulatie triggers veranderingen in de belangrijkste cellulaire routes. Derhalve is het lot van de cel sterk bepaald door het tijdstip waarop de sandwich-achtige cultuur geassembleerd ^11.

Vanwege de aard van het systeem, een sandwich-achtige cultuur is een eenvoudig en veelzijdig instrument dat de studie van verschillende parameters in cel / materiaal interacties zoals chemie, topografie, stijfheid en eiwitten coatings zowel de ventrale en dorsale zijde toelaat. Dit biedt een grotere mate van flexibiliteit ten opzichte van andere 3D-systemen (Figuur 2) door de onafhankelijke dorsale en ventrale combinatie van een brede variety oppervlakte condities. Bovendien kunnen verschillende cellijnen en verschillende tijdstippen de sandwich-achtige kweek monteren bestudeerd, waardoor de brede spectrum van mogelijkheden.

Een standaardprotocol van de sandwich-achtige kweek, wordt hieronder beschreven hetzij poly-L-melkzuur (PLLA) electrospun vezels of films dorsale substraten dekglaasje als ventrale substraat en fibronectine als eiwitbekleding. Sandwich-achtige culturen werden geassembleerd net na cel zaaien of na 3 uur van 2D-cultuur. Echter, er rekening mee dat andere materiële systemen en eiwitten kunnen worden gebruikt; ook de sandwich-achtige cultuur kan worden gemonteerd op verschillende tijdstippen.

Protocol

1. De productie van Dorsale Substrates

1. Productie van een vlakke film van PLLA door oplosmiddel gieten.
   1. Werk in een zuurkast aan een oplossing van 2% (w / v) PLLA in chloroform (2 g PLLA in 100 ml chloroform) te bereiden door roeren bij kamertemperatuur (KT) tot het volledig is opgelost (ongeveer 3 uur).
   2. Leg de ringen op een glazen petrischaal.
      Opmerking: Gebruik roestvrij stalen ringen met een inwendige diameter van 10,5 mm (iets kleiner dan de ventrale sample diameter) zodat de ring bovenop het ventrale substraat wordt geplaatst. Andere materialen zoals polytetrafluorethyleen (PTFE) of glazenreiniger kunnen eveneens worden gebruikt.
   3. Voeg 200 ul van de PLLA oplossing in de wasmachine en laat verdampen langzaam gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Om de langzame verdamping van het oplosmiddel mogelijk te maken, sluit de petrischaal met aluminiumfolie met een paar gaten.
   4. Verwarm de monsters bij 120 ° C gedurende 5 min teneinde het oplosmiddel te verdampen sporen.
   5. Laat monsters koel te doenwn bij KT.
   6. Zodra monsters afgekoeld (30 min ongeveer), dek af met 18,2 MQ · cm water in de petrischaal en incubeer gedurende 8 min bij RT.
      Opmerking: als monsters worden niet volledig afgekoeld, kunnen ze duren 18.2 MQ · cm water en neemt een rubberachtige toestand. Bovendien incuberen bij 18,2 MQ-cm water gedurende minder dan 8 min kan leiden tot onjuiste onthechting, en meer dan 8 minuten in onthechting van de wasmachine.
   7. Met een scheermesje, wrikken de ringen om ze te pellen de petrischaal.
   8. Verwijder eventuele onvolkomenheden van de rand van de ring met een pincet en laat de monsters lucht drogen.
   9. Bewaar de monsters in een vacuüm exsiccator (80 mbar) tot de dag van het experiment omdat PLLA afbreekbaar door hydrolyse.
2. Productie van PLLA vezels door electrospinning.
   1. Werk in een zuurkast met een oplossing van 8% (w / v) PLLA in hexafluorisopropanol (8 g PLLA in 100 ml hexafluorisopropanol) door oproeren voorbereidinging bij RT totdat het volledig is opgelost (3 uur ongeveer).
   2. Plaats de polytetrafluorethyleen (PTFE) ringen op een aluminium plaat of een trommel voor het electrospinning om willekeurige of uitgelijnde vezels respectievelijk krijgen.
      Opmerking: Gebruik polytetrafluorethyleen (PTFE) ringen met een inwendige diameter van 10,5 mm (iets kleiner dan de ventrale sample diameter) zodat de ring bovenop het ventrale substraat wordt geplaatst. Andere materialen zoals roestvrij staal of glas ringen kunnen ook worden gebruikt. De trommel moet draaien met een hoeksnelheid van 160,7 sec ^-1 (radius = 7 cm) teneinde uitgelijnde vezels te verkrijgen. Een lagere snelheid kan glasvezel uitlijning niet leiden en een hogere snelheid zal resulteren in gebroken vezels.
   3. Laad de spuit met het polymeer-oplossing en plaats het op de injectiepomp.
   4. Electrospin de PLLA oplossing met een 0,9 ml / uur stroomsnelheid een spanning van 30 kV en een collector afstand van 12 cm.
   5. Stop de elektrospinproces achterdeker 20-30 min, tot er een goede vezeldichtheid wordt bereikt (omdat cellen tegelijkertijd communiceren met een aantal vezels).
   6. Verwarm de monsters bij 120 ° C gedurende 5 min teneinde het oplosmiddel te verdampen sporen.
   7. Bewaar de monsters in een vacuüm exsiccator (80 mbar) tot de dag van het experiment omdat PLLA afbreekbaar door hydrolyse.

2. Sandwich Cultuur

1. Monteer de sandwich-achtige cultuur eenmaal cellen worden nageleefd het ventrale 2D-substraat.
   1. Werken in een cultuur kap te zorgen steriele omstandigheden en steriliseer alle materialen (glas dekglaasjes, rug- substraten, pincet, etc.) door UV-blootstelling gedurende 30 min.
   2. Coat om de ventrale en dorsale substraat met fibronectine aan specifieke cel-eiwit hechting direct. Hiertoe incubeer de monsters in 20 ug / ml fibronectine opgelost in Dulbecco's fosfaat-gebufferde zoutoplossing (DPBS) met Ca2 ⁺ en Mg2 ⁺ (200 ul / svoldoende) gedurende 1 uur.
      Opmerking: Als gevolg van het fabricageproces, dorsale substraten aangewezen boven- en onderzijde, omdat het oplosmiddel gegoten film en electrospun vezels bevestigd aan één van de zijden van de ring. Deze zijde is daarom één op de cellen (Figuur 3).
      1. Nadat het eiwit bekleden, was de monsters tweemaal met DPBS om eiwit te verwijderen boven. Dan incubeer monsters in DPBS tot het gebruik ervan in om de monsters te voorkomen van het krijgen van een droge, omdat dit zorgt ervoor eiwit denaturalisatie. Gebruik DPBS met Ca ²⁺ en Mg ²⁺ sinds divalente kationen reguleren eiwitvouwing.
   3. Zaad cellen op de dekglaasjes ^13.
      Opmerking: Als de sandwich-achtige cultuur gebaseerd 2D substraten zal zaaien van cellen op soortgelijke wijze worden uitgevoerd als een 2D monster. Zo worden C2C12 myoblast gezaaid met 17.500 cellen cm ^-1 differentiatie experimenten en NIH3T3 fibroblasten worden uitgezet met 7000 cells cm ^-1 voor geïsoleerde culturen naar cel morfologie en de hechting te bestuderen.
   4. Plaats de monsters in een incubator bij 37 ° C met 5% CO ₂ en laat cellen hechten aan de ventrale substraat voor 3 uur.
   5. Plaats de ventrale gezaaide substraat in een nieuw putje van een 12 plaat met meerdere holtes (indien sluitringen past).
      Opmerking: Montage van de sandwich-achtige cultuur in een nieuwe put is een manier om zich te ontdoen van de cellen die zijn toegetreden tot de bodem van de put na het zaaien, omdat deze voedingsstoffen verbruikt en scheiden groeifactoren en afval dat cellen gekweekt in het beïnvloeden sandwich-achtig systeem. Dit is ook een must voor mobiele extracties om alleen de cellen gekweekt in de sandwich-achtige omgeving lyseren.
   6. Zorgvuldig en met behulp van een pincet, bedekken de dorsale substraat de cellen. Bijvullen medium (1 ml) en incubeer bij 37 ° C met 5% CO _2.
      Opmerking: Het gewicht van de ring wordt voorkomen dat de dorsale subStrate drijven.
   7. Verander het medium tweemaal per week in standaard 2D kweken. Verplaats de dorsale substraat omdat dit kan leiden tot beschadiging van cellen.
2. Monteer de sandwich-achtige cultuur net na cel zaaien.
   1. Werken in een cultuur kap te zorgen steriele omstandigheden en steriliseer alle materialen (glas dekglaasjes, rug- substraten, pincet, etc.) door UV-blootstelling gedurende 30 min.
   2. Coat om de ventrale en dorsale substraat met fibronectine aan specifieke cel-eiwit hechting direct. Hiertoe incubeer de monsters in 20 ug / ml fibronectine opgelost in DPBS bevat Ca2 ⁺ en Mg2 ⁺ (200 ul / monster) gedurende 1 uur.
      1. Nadat het eiwit bekleden, was de monsters tweemaal met DPBS om eiwit te verwijderen boven. Dan incubeer monsters in DPBS tot het gebruik ervan in om de monsters te voorkomen van het krijgen van een droge, omdat dit zorgt ervoor eiwit denaturalisatie. Gebruik DPBS met Ca ²⁺ en Mg ^{2+ sinds divalente kationen reguleren eiwitvouwing.}
   3. Zaad cellen op dekglaasjes in een putje van een 12 multi-well plaat (waar ringen past). Om dit te doen, gebruik maken van een zeer geconcentreerd cellulaire schorsing naar cel verlies na het leggen van de dorsale substraat te vermijden.
   4. Zorgvuldig en met behulp van een pincet, bedekken de dorsale substraat de cellen. Bijvullen medium (1 ml) en incubeer bij 37 ° C met 5% CO _2.
      Opmerking: Het gewicht van de ring voorkomt dat de dorsale ondergrond drijven.
   5. Verander het medium tweemaal per week in standaard 2D kweken.
      Opmerking: Verplaats de dorsale substraat omdat dit kan leiden tot beschadiging van cellen.

3. Analyse

Opmerking: sandwich-achtige cultures op basis van 2D-substraten, en zo kunnen gezamenlijk worden geanalyseerd door reeds ontwikkeld voor standaard 2D-kweken procedures. Bijvoorbeeld, omdat PLLA transparant en CELls worden gedwongen om te verhuizen binnen het xy-vlak, wordt microscopie gedaan Op 2D substraten. Celmigratie kan derhalve worden opgevat als 2D kweken, zonder het bijhouden cellen in de z-as als voor 3D-culturen, waarbij het experiment en beeldanalyse vereenvoudigt. Om de wondgenezing assay bestuderen door een kras-test volgt dit protocol:

1. Studie celmigratie (wondgenezing assay) binnen de sandwich-achtige cultuur.
   1. Werken in een cultuur kap te zorgen steriele omstandigheden en steriliseer alle materialen (glas dekglaasjes, rug- substraten, pincet, etc.) door UV-blootstelling gedurende 30 min.
   2. Coat om de ventrale en dorsale substraat met fibronectine aan specifieke cel-eiwit hechting direct. Hiertoe incubeer de monsters in 20 ug / ml fibronectine opgelost in Dulbecco's fosfaat-gebufferde zoutoplossing (DPBS) met Ca2 ⁺ en Mg2 ⁺ gedurende 1 uur.
      1. Nadat het eiwit bekleden, was de monsters tweemaal met DPBSom eiwitten te verwijderen in overmaat. Dan incubeer monsters in DPBS tot het gebruik ervan in om de monsters te voorkomen van het krijgen van een droge, omdat dit zou kunnen eiwit denaturalisatie veroorzaken. Gebruik DPBS met Ca ²⁺ en Mg ²⁺ sinds divalente kationen reguleren eiwitvouwing.
   3. Zaad cellen op de dekglaasjes bij een hoge dichtheid ^13.
   4. Plaats de monsters in een incubator bij 37 ° C met 5% CO ₂ en laat cellen confluentie bereiken.
   5. Gebruik een pipet om krassen op de cel monolaag om 2 celpopulaties gescheiden door een spleet te krijgen.
   6. Plaats de ventrale geplaatste substraat in een nieuw goed geschikt is voor de time-lapse acquisitie en waar de dorsale substraten passen (dwz 12 multi-well plaat).
   7. Zorgvuldig en met behulp van een pincet, bedekken de dorsale substraat de cellen en vervolgens vullen met medium (1 ml van een 12 multi-well plate).
      Opmerking: Het gewicht van de ring voorkomt tHij dorsale ondergrond drijven.
   8. Het monster wordt in de time-lapse microscoop (ingesteld op 37 ° C en 5% _CO2) en neemt beelden van de gap closure elke 20 min.
   9. Analyseer de gap closure met behulp van specifieke software zoals de plugin MiToBo van ImageJ. ¹⁴

Opmerking: Eiwit en nucleïnezuur extractie wordt op soortgelijke wijze uitgevoerd als 2D substraten. Er is maar één extra stap die bestaat uit het demonteren van de sandwich-achtige cultuur aan de lysis buffer direct aan de cellen toe te voegen om de extractie-efficiëntie te verhogen. Bijvoorbeeld voor mRNA extractie:

2. Uittreksel mRNA van Sandwich-achtige culturen
   1. Bereid de buffers van de commerciële kit volgens instructies van de fabrikant.
   2. Neem de sandwich-achtige cultuur uit de incubator.
   3. Verwijder het kweekmedium van de monsters.
   4. Was de monsters eenmaal met DPBS bevattende Ca2+ en Mg ²⁺ (1 ml) en verwijder alle oplossing.
   5. Met behulp van een pincet, verwijder de dorsale substraat en voeg de lysis buffer (350 pl) aan de ventrale substraat. Overlay opnieuw de dorsale substraat op de ventrale substraat teneinde ook lyseren van de cellen gehecht aan de dorsale substraat.
   6. Verwijder de dorsale substraat om de lysisoplossing isoleren.
   7. Volg de instructies van de fabrikant om het mRNA te krijgen.

Opmerking: Immunodetectie van eiwitten kan ook worden uitgevoerd vanaf Op 2D substraten. Aangezien sandwich-achtige culturen juiste verspreiding van de antilichamen en buffers kunnen belemmeren, incubatietijden worden verhoogd. Ook kan de sandwich worden gedemonteerd alvorens de kleuringsprotocol maar in dit laatste geval enige cellen blijven aan de dorsale substraat en een aantal op de ventrale substraat.

3. Immunodetect eiwitten binnen een sandwich-achtige cultuur
   1. Was eenmaal het monster met DPBS en bevestig met 4% formaldehyde in PBS gedurende 20 minuten bij 4 ° C.
      Opmerking: dorsale substraat gedurende het fixatieproces zodat diffusieprobleem vermeden worden verwijderd.
   2. Spoelen met DPBS (1 ml) en vervolgens doorlaatbaar met 0,5% Triton X-100 in DPBS (1 ml) gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
   3. Blokkeer niet-specifieke bindingsplaatsen met 1% albumine in DPBS (1 ml) gedurende 30 min bij kamertemperatuur.
   4. Incubeer met primaire antilichaam (2 ug / ml, 1 ml) in blokkerende oplossing gedurende 3 uur bij KT.
   5. Was 3 maal gedurende 10 min met DPBS / 0,5% Tween 20 (1 ml).
   6. Incubeer 2 uur met secundaire antilichamen (2 gg / ml) en 1 ug / ml DAPI in blokkeeroplossing (1 ml) bij RT.
   7. Was 3 maal gedurende 10 min in DPBS / 0,5% Tween 20 (1 ml).
   8. Was in DPBS.
      Opmerking: Monsters kunnen op een dia met Vectashield gemonteerd worden en verzegeld met nagellak wanneer dorsale substraten voorafgaand worden verwijderd van de immunodetectie.
   9. Let op onder de fluorescentie microtoepassingsgebied voor standaard 2D substraten.

Resultaten

Het stimuleren van de dorsale receptoren binnen de sandwich-achtige cultuur triggers veranderingen in de cel morfologie, celadhesie en intracellulaire signaalwegen (bijv focale adhesie kinase, FAK) ^10-12. Als voorbeeld, fibroblasten gekweekt in de sandwich-achtig systeem overexpressie de α ₅ integrine subeenheid vergeleken met 2D, zoals waargenomen voor andere 3D culturen ^15,16.

Cell lot is sterk afhankelijk van het tijdstip waarop de dorsale recepto...

Discussie

Tegenwoordig 3D cultuur is een belangrijk onderwerp voor de farmaceutische en biotechnologische industrie, alsmede onderzoek in de celbiologie, met inbegrip van kanker en stamcellen. Bijgevolg meerdere 3D kweeksystemen ontwikkeld. Helaas, de verschillen tussen de 3D-systemen meestal resulteren in verschillende cel gedrag, belemmeren het begrip van cel lot. Trouwens, experimentele procedures zijn meestal niet zo eenvoudig als voor 2D kweeksystemen. Vandaar ontwikkeling van nieuwe kweeksystemen die overwinnen sommige van ...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Ploy(melkzuur)	NatureWorks	4042D	Reagens
Dekglasjes (12 mmØ)	Marienfeld	631-0666	Apparatuur
Chloroform	Scharlab	CL0200	Reagens
1,1,1,3,3,3-Hexafluor-2-propanol (HFIP)	Sigma	105228	Reagens
Spuit (1 ml)	Henke Sass Wolf	4010-200V0	Apparatuur
Spuitpomp	New Era Pump Systems	NE1000	Apparatuur
Hoogspannings DC-voeding	Glassman High Voltage	Serie FC	Apparatuur
Incubator	Hucoa-Herlös	3111	Apparatuur
Laminairstroomkast	Telstar	AV30/70	Apparatuur
Human Fibronectin	Sigma	F2006	Reagens
RNeasy Micro Kit	Qiagen	74004	Reagens
Inverteer microscoop	Leica Microsystems	DMI 6000	Apparatuur
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	Reagens
Albumine	Sigma-Aldrich	A7409	Reagens
Tween 20	Sigma-Aldrich	P2287	Reagens