We beschrijven een 3D-kweekmodel van het menselijk borstpijtheel dat geschikt is om hormoonwerking te bestuderen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Een hormoon-responsieve 3D Cultuur Model van de Human borstklier epitheel
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Het proces van mammaire epitheliale morfogenese wordt beïnvloed door hormonen. De studie van hormoonwerking op het borstpisteel met behulp van 2D-culturen is beperkt tot celproliferatie en genexpressie-eindpunten. In het organisme vindt mammaire morfogenese echter plaats in een 3D-omgeving. 3D-cultuursystemen helpen de kloof te overbruggen tussen monolaag-celcultuur (2D) en de complexiteit van het organisme. Hier beschrijven we een 3D-cultuurmodel van het menselijk borstpisteel dat geschikt is om hormoonwerking te bestuderen. Het gebruikt de commercieel verkrijgbare hormoonresponsieve menselijke borstpisteelcellijn, T47D, en rattenstaart collageen type 1 als matrix. Dit 3D-cultuurmodel reageert op de belangrijkste mammotrope hormonen: estradiol, progestagenen en prolactine. De invloed van deze hormonen op epitheliale morfogenese kan worden waargenomen na 1- of 2-weken behandeling volgens het eindpunt. De 3D-culturen kunnen worden geoogst voor analyse van epitheliale morfogenese, celproliferatie en genexpressie.
Inleiding
In tegenstelling tot standaard 2D culturen 3D celkweek surrogaat apparaten kan de studie van epitheelcel gedrag in een fysiologisch relevante context, iemand als een weefsel. 3D culturen van de borstklier geholpen verhelderen vele aspecten van ontwikkeling van de borstklier en neoplasie. De meeste van de 3D cultuurmodellen momenteel beschikbaar zijn ongeschikt hormoonactie bestuderen omdat het menselijke epitheliale cellijnen gebruikt voor de taak missen hormoonreceptor expressie 6,7,9.
Hierin beschrijven we een 3D cultuurmodel van de menselijke borst epitheel die geschikt is om hormooninwerking 12 bestuderen. Dit ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Bereiding van reagentia
- Los het synthetische progestageen promegeston (R5020) en 17-β-estradiol (E2) in ethanol tot 10 -3 M voorraadoplossingen te maken. Prolactine lossen in gedestilleerd gedeïoniseerd water om een 1 mg / ml voorraadoplossing te maken. Ontbinding van de anti-oestrogeen ICI 182.780 in DMSO om een 10 -2 M voorraad oplossing te maken. Bewaar de oplossingen bij -20 ° C maximaal 6 maanden.
- Charcoal dextran (CD) gestript serum en CDFBS medium:
- Warmte-geïnactiveerd foetaal runderserum (FBS) in een 57 ° C waterbad gedurende 30 minuten.
Opmerking: Gebruik alleen zuur gewassen glaswerk voor de re....
- Warmte-geïnactiveerd foetaal runderserum (FBS) in een 57 ° C waterbad gedurende 30 minuten.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Figuur 1 geeft een overzicht van de procedure voor het bereiden van de hormoongevoelige 3D culturen. Epitheelstructuren worden waargenomen in whole mounts gelen gekweekt gedurende 2 weken in de aanwezigheid van E2 alleen en in combinatie met andere hormonen. Slechts enkele cellen of groepen van 2-3 cellen zijn aanwezig wanneer geen hormonen worden toegevoegd aan het kweekmedium (CDFBS gemiddeld) (figuur 2). Deze voorwaarde dient als negatieve controle.
Celle.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Hier beschrijven we een hormoongevoelig 3D-kweekmodel om de werking van hormonen op borstprikkel te testen. De respons op hormonen kan worden beoordeeld op het niveau van weefselmorfologie, celproliferatie en genexpressie 12. Een beperking van deze techniek is dat visualisatie tijdens de kweekperiode beperkt is tot lichtmicroscopie, omdat de culturen worden gekweekt in een plastic bodemplaat. Het 3D-kweeksysteem zou kunnen worden aangepast naar glazen bodemplaten om live beeldvorming van de culturen mogelijk t.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
We waarderen de redactionele bijdragen van Cheryl Schaeberle. Dit onderzoek werd gesteund door Avon Grants # 02-2009-093 en 02-2011-095 en NIEHS / NIH ES 08.314 naar AMS. De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en niet noodzakelijkerwijs het officiële standpunt van het National Institute of Environmental Health Sciences of de National Institutes of Health.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 12-well Tissue Culture Plates (Falcon) | Fisher Scientific | 08-772-29 | |
| 15 ml polystyrene conical Tubes | Fisher Scientific | 14-959-49D | |
| Activated Charcoal | Sigma | C-5510 | |
| Carmine Alum | Sigma | C1022-100G | |
| Collagenase, Type 3 | Worthington | S0C11784 | |
| Confocal Microscope | Zeiss | LSM510 | Uitgerust met HeNe 633nm laser |
| Dextran T-70 | Abersham/Pharmacia | 17-0280-01 | |
| DMEM/F-12, HEPES, no phenol red | Life Technologies | 11339-021 | Fenolroodvrij medium voor hormoongebruik |
| DMEM, low glucose, pyruvate, no glutamine, no phenol red | Life Technologies | 11054-020 | Fenolroodvrij medium voor hormoongebruik |
| 17-β-Estradiol | EMD Millipore | 3301 | Opgelost in Ethanol |
| Ethanol | Koptec | V1001 | |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30070.03 | Voor gebruik met hormonen, moet eerst Charcoal Dextran gestrippingt zijn |
| Filters (115 ml) | Nalgene | 380-0080, 245-0045, 120-0020 | Respectievelijk 0.88, 0.45, 0.20 micron |
| Formalin, 10% | Fisher Scientific | SF93-20 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Life Technologies | 25030-081 | |
| ICI 182,780 (fulvestrant) | Sigma Aldrich | I4409-25MG | Opgelost in DMSO |
| Microtome | Leica | RM2155 | |
| Tissue embedding media | McCormick Scientific | 39502004 | |
| Penicillin | Sigma | 7794-10MU | Opgelost in 10 ml gedistilleerd gedeïoniseerd water |
| Permount | Fisher Scientific | SP15-500 | |
| Phosphate Buffered Saline pH 7.4 | Sigma Aldrich | P3813-10PAK | |
| Prolactin | Sigma Aldrich | L4021-50UG | Opgelost in gedistilleerd gedeïoniseerd water |
| Promegestone | Perkin Elmer | NLP004005MG | Opgelost in Ethanol |
| Rat-Tail Collagen | Corning | 354236 | Lots kunnen verschillende concentraties bevatten, neem hier rekening mee |
| Scalpel | Miltex | 4311 | |
| Semi-enclosed Benchtop Tissue Processor | Leica | TP1020 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma Aldrich | S5881 | Bereid 1N NaOH-stock |
| StaticMaster Anti-static brush | Amstat | C3500 | |
| Stripette Serological Pipettes | Corning | 4101 | |
| T-25 flasks | Corning | 430168 | |
| Tissue Cassettes | Fisher Scientific | 15-200-403E | |
| Wheaton Vials, Glass, 20 ml | Fisher Scientific | 03-341-25D | |
| Xylene | VWR | 95057-822 |
Referenties
- Barnes, C., et al. From single cells to tissues: interactions between the matrix and human breast cells in real time. PLoS ONE. 9, e93325(2014).
- Berthois, Y., Katzenellenbogen, J. A., Katzenellenbogen, B. S.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
