Protocol voor drie-dimensionale confocale Morfometrische Analyse van Astrocytes

Summary

Astrocytes in the CNS change their functional and structural properties in response to harmful stimuli. This report presents a protocol for assessment of three-dimensional astrocyte morphology in diseased conditions or after therapeutic interventions.

Abstract

Zoals gliacellen in de hersenen, astrocyten hebben uiteenlopende functionele rol in het centrale zenuwstelsel. In aanwezigheid van schadelijke stimuli, astrocyten wijzigen hun functionele en structurele eigenschappen, een aandoening die reactief astrogliosis. Hier wordt een protocol voor de beoordeling van de morfologische eigenschappen van de astrocyten gepresenteerd. Dit protocol omvat de kwantificering van 12 verschillende parameters namelijk de oppervlakte en het volume van het weefsel onder een astrocyt (astrocyten gebied), de volledige astrocyten zoals takken, cellichaam en kern, en totale lengte en het aantal vertakkingen, de intensiteit van fluorescentie immunoreactiviteit van antilichamen die voor detectie astrocyten en astrocyten dichtheid (aantal / 1000 um ^2). Hiertoe driedimensionale (3D) confocale microscopische beelden werden gemaakt en 3D beeldanalyse software zoals Volocity 6,3 werd gebruikt voor metingen. Rat hersenweefsel blootgesteld aan amyloïd-bèta _1-40 1-40) met of zonder een therapeutische interventie gebruikt om de werkwijze te presenteren. Dit protocol kan ook gebruikt worden voor 3D morfometrische analyse van andere cellen uit in vivo of in vitro omstandigheden.

Introduction

Bij gezonde centraal zenuwstelsel (CNS), astrocyten spelen een belangrijke rol bij de regulatie van de bloedstroom, energiemetabolisme, synaptische functie en plasticiteit en extracellulair ion homeostase en neurotransmitter ^1-3. Bovendien astrocyten reageren op verschillende schadelijke stimuli en abnormale aandoeningen zoals trauma, infectie, ischemie of neurodegeneratie via reactieve astrogliosis die wordt gekenmerkt door hypertrofie, proliferatie en functionele vernieuwing van astrocyten ^4,5.

Reactieve astrogliosis kan de ontstekingsreactie en reparatieproces in het weefsel engineering en daarom kan het klinische....

Protocol

Deze studie werd uitgevoerd in overeenstemming met het bepaalde in de Gids voor de Zorg en gebruik van proefdieren (NIH) beleid van Ethische Comité van Iran Universiteit van Medische Wetenschappen (Teheran, Iran) goedgekeurd uitgevoerd.

1. Dieren, Chirurgie en Specimen Voorbereidingen

OPMERKING: Bereid hersenweefsel voor 3D confocale microscopische analyse.

1. Verdeel dieren willekeurig in twee groepen: Ap _1-40 -Injectie (n = 8) en Aß _1-40 -Injectie met genisteïne behandeling (n = 8); genisteïne (10 mg / kg verdund in een drager zoals gepolyethoxyleerde ricinusolie) door gavage 1 ....

Results

In dit gedeelte wordt een aantal voorbeelden van de kwalitatieve en kwantitatieve waarnemingen geproduceerd door 3D morfometrische analyse. Voor de volledige resultaten van alle 12 parameters eerder vermeld, zie onze eerdere publicatie ^10.

Kwalitatieve Waarnemingen

Astrocytes vertoonden dunne of dikke takken die gewoonlijk werden lang Aß _1-40 geïnjecteerde ratten (Figuur 1). Enkele kleine stervormig gevormde astrocyten met k.......

Discussion

In het huidige protocol, gebruikten we 3D confocale morfometrie evalueren 12 verschillende parameters die werden geassocieerd met astrocyt morfologie. Daartoe hippocampus weefsel van ratten Ap _{1-40 -} geïnduceerd astrogliose, met of zonder voorbehandeling genisteïne als een anti-inflammatoir middel gebruikt. Via 3D afbeeldingen en morfometrische software, konden we het effect van genisteïne op astrogliosis dus de morfologie van de astrocyten te tonen.

Veranderingen in de i.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amyloid beta 1-40	Sigma Aldrich	79793	Keep in -70 °C
Genistein	Sigma Aldrich	446-72-0	keep in -20 °C
polycolonal rabbit antibodies against glial fibrillary acidic protein	DAKO	Z0334
alkaline phosphate-conjugated swine anti-rabbit IgG antibodies	DAKO
Liquid Permanent Chromogen	DAKO	K0640
Liquid permanent Red Substrate Buffer	DAKO	K0640
Cremophor EL	Sigma Aldrich	27963	Polyethoxylated castor oil - Step 1.1
LSM 700 Confocal Laser Scanning Microscopy	Carl Zeiss
Volocity 6.3	Perkin Elmer Inc.,
Image Analysis 2000	Tekno Optic
Streotaxic apparatus	Stoelting
Graph pad Prism 5	Graph pad software Inc.