Astrocyten in het CZS veranderen hun functionele en structurele eigenschappen als reactie op schadelijke stimuli. Dit rapport presenteert een protocol voor de beoordeling van de driedimensionale morfologie van astrocyten in zieke toestanden of na therapeutische interventies.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Protocol voor drie-dimensionale confocale Morfometrische Analyse van Astrocytes
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Zoals gliacellen in de hersenen, astrocyten hebben uiteenlopende functionele rol in het centrale zenuwstelsel. In aanwezigheid van schadelijke stimuli, astrocyten wijzigen hun functionele en structurele eigenschappen, een aandoening die reactief astrogliosis. Hier wordt een protocol voor de beoordeling van de morfologische eigenschappen van de astrocyten gepresenteerd. Dit protocol omvat de kwantificering van 12 verschillende parameters namelijk de oppervlakte en het volume van het weefsel onder een astrocyt (astrocyten gebied), de volledige astrocyten zoals takken, cellichaam en kern, en totale lengte en het aantal vertakkingen, de intensiteit van fluorescentie immunoreactiviteit van antilichamen die voor detectie astrocyten en astrocyten dichtheid (aantal / 1000 um 2). Hiertoe driedimensionale (3D) confocale microscopische beelden werden gemaakt en 3D beeldanalyse software zoals Volocity 6,3 werd gebruikt voor metingen. Rat hersenweefsel blootgesteld aan amyloïd-bèta 1-40 1-40) met of zonder een therapeutische interventie gebruikt om de werkwijze te presenteren. Dit protocol kan ook gebruikt worden voor 3D morfometrische analyse van andere cellen uit in vivo of in vitro omstandigheden.
Inleiding
Bij gezonde centraal zenuwstelsel (CNS), astrocyten spelen een belangrijke rol bij de regulatie van de bloedstroom, energiemetabolisme, synaptische functie en plasticiteit en extracellulair ion homeostase en neurotransmitter 1-3. Bovendien astrocyten reageren op verschillende schadelijke stimuli en abnormale aandoeningen zoals trauma, infectie, ischemie of neurodegeneratie via reactieve astrogliosis die wordt gekenmerkt door hypertrofie, proliferatie en functionele vernieuwing van astrocyten 4,5.
Reactieve astrogliosis kan de ontstekingsreactie en reparatieproces in het weefsel engineering en daarom kan het klinische verloop van therapeutische interventies beïnvloeden. Dienovereenkomstig astrocyten zijn aandacht neuroloog die tijdens de laatste decennia als potentiële targets voor therapeutische interventies voor een verscheidenheid van ziekten van het CZS.
Astrocyten hebben doorgaans een stervormige vorm met goed-defined takken die verspreid over de soma 6. In een zieke toestand in de hersenen, astrocyten takken worden ingewikkelde en tonen gezwollen einden 7, bijvoorbeeld in aanwezigheid van amyloïde beta (Ap).
Dit artikel presenteert een protocol voor het analyseren van 3D-beelden van astrocyten overgenomen door confocale microscopie. Twaalf verschillende kwantitatieve parameters voor elk astrocyten werden gemeten: de oppervlakten en volumes van de astrocyten grondgebied (het weefsel onder een astrocyten), hele cel (met inbegrip van filialen), cel lichaam, en de kern; de totale lengte en het aantal vestigingen; de fluorescentie-intensiteit van antilichamen voor detectie astrocyten; en de dichtheid van de astrocyten (aantal / 1000 um 2). Hiervoor gebruikten we hersencoupes van ratten blootgesteld aan injectie van Ap 1-40 intrahippocampale met of zonder behandeling genisteïne als een anti-inflammatoire stof. De beschreven protocol kan worden gebruikt voor een morfometrischeANALYSE van verschillende celtypes in vitro of in vivo in verschillende omstandigheden.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Deze studie werd uitgevoerd in overeenstemming met het bepaalde in de Gids voor de Zorg en gebruik van proefdieren (NIH) beleid van Ethische Comité van Iran Universiteit van Medische Wetenschappen (Teheran, Iran) goedgekeurd uitgevoerd.
1. Dieren, Chirurgie en Specimen Voorbereidingen
OPMERKING: Bereid hersenweefsel voor 3D confocale microscopische analyse.
- Verdeel dieren willekeurig in twee groepen: Ap 1-40 -Injectie (n = 8) en Aß 1-40 -Injectie met genisteïne behandeling (n = 8); genisteïne (10 mg / kg verdund in een drager zoals gepolyethoxyleerde ricinusolie) door gavage 1 uur dienen voor de operatie.
- Verdoven van de dieren met ketamine (100 mg / kg) en xylazine (10 mg / kg). Bevestig de juiste verdoving door een gebrek aan terugtrekking reflex na knijpen de teen. Gebruik zalf op de ogen tijdens de operatie om uitdroging te voorkomen.
- Plaats dieren in stereotaxische apparatuur en scheren hoofd. Solliciteer iodine oplossing op de hoofdhuid voor incisie reinigen en houd de operatieplaats steriel tijdens de operatie om het risico op infectie te verminderen. Injecteer Aß 1-40 stereotaxically (4 pl) in de hippocampus op -3,5 mm achter bregma, ± 2 mm lateraal van middellijn en -2,8 mm onder dura, volgens rattenhersenen atlas 8. Voor stereotaxisch methode zie eerdere publicatie 9.
- Post-operatieve observatie / zorg tot de dieren volledig bewust om het comfort van de dieren te garanderen. Houd de dieren warm tijdens het herstel, en ze niet terug te keren naar een kooi met andere dieren tot volledig herstel. Besteed aandacht aan elk teken van infectie bij de dieren na de operatie.
- Verdoven van de dieren diep met ketamine (150 mg / kg) drie weken na de operatie. Voeren transcardial fixatie door perfuseren de dieren met 0,9% zoutoplossing, gevolgd door 4% paraformaldehyde in 0,1 M PBS (pH = 7,4), verwijder dan en bevestig de hersenen, zoals beschreven in het 10 </ sup>.
- Na de vaststellen van de hersenen in 4% paraformaldehyde gedurende 2-3 dagen bij 4 ° C.
- Het weefsel in paraffine blokken insluiten door het gebruik van weefsel inbedding apparatuur, en te voorkomen dat onder-vulling of over-vullen van de cassette omdat het kan interfereren met de juiste uitlijning of snijden. Besteed aandacht aan de oriëntatie van het weefsel in de paraffineblok.
Opmerking: De rat hippocampus, bijvoorbeeld dicht bij achterste deel van de cerebrale hemisfeer. Daarom moet het weefsel worden ingebed op een wijze die snijden begint bij achterste deel van de hersenen. Gebruik de Paxinos atlas 8 als een leidraad voor de gewenste anatomische structuur te bereiken. - Plaats de microtoom weg van tocht of deuropeningen sinds lucht bewegingen maken de behandeling van onderdelen moeilijk.
- Gebruik profielen met een dikte van ≥20 um als deze diepte noodzakelijk Met zijn om Z-Stack beelden van complete astrocyten produceren. Gebruik niet de eerste paar hoofdstukken, omdat ze ongewenste dikte kan hebben door thermische eXpansion.
- Plaats de secties op het oppervlak van warm water (5 ± 2 C, onder de smelttemperatuur voor paraffine) net lang genoeg om de delen plat.
Opmerking: In uitzetting van het deel de morfologie van de constructie kan verstoren. Gebruik klein penseel om zorgvuldig te dragen secties. Verzamel 2-3 secties in elke dia. - Bewaren dia's in een rack in een rechtopstaande positie en laat ze drogen op 37 ° C gedurende enkele uren of O / N.
2. Immunohistochemie
- Deparaffinize secties xyleen, 2 x 10 min, en hydrateren met alcohol gradiënt (99,8%, 95% en 70%, 10 min elk) en PBS.
- Incubeer met antilichamen tegen glial fibrillair zuur eiwit (GFAP) verdund 1: 1500 in PBS met 0,25% runderserumalbumine (BSA), 0,25% Triton X-100 en 3,5% normaal serum (O / N bij 4 ° C).
- Was secties in PBS gedurende 3 x 5 min.
- Incubeer met secundaire alkalisch fosfaat-geconjugeerde antibodies 1 uur (1: 100, 21 ° C, verdund in PBS).
- Was de secties in PBS gedurende 3 x 5 min.
NB: Het is belangrijk om de onderdelen goed te wassen na het secundaire antilichamen op de achtergrond vlekken minimaliseren. - Incubeer secties in duisternis met Liquid Permanent Red Chromogen (15-20 min). NB: Bereid de oplossing niet meer dan 30 min voor gebruik.
- Was secties in PBS gedurende 3 x 5 min.
- Tenslotte vlekken de kernen met 4-6-diamidino-2-phenylindole (DAPI; 1: 500 verdund in PBS) vóór dekken-slippen. Bewaar de dia's in de koelkast 24-48 uur voor microscopie.
3. Confocale microscopie
Opmerking: Voor kwantitatieve evaluatie (zie hieronder), selecteer een astrocyten met een duidelijk zichtbare kern DAPI gekleurd met minimaal overlappende takken het risico van fouten. Produceren Z-Stack beelden is tijdrovend. Wees geduldig en niet stoppen bij de verwerking. Rechtop confocale laser scanning microscoop is used om 3D-beelden te creëren van astrocyten.
- Leg de dia op de microscoop-podium, en selecteer de 63x doelstelling.
- Open de imaging software en klik op Start-systeem. Klik op het tabblad Locate. Ga naar toewijzen en selecteer GFP aan het juiste licht aan te passen.
- Open de sluiter aan het licht reflecteren. Vind de Reflector Revolver aan de rechterkant van Shutter en kies de kleur die moet worden weerspiegeld door astrocyten (groen, rood of paars); rode kleur (FSet20 WF) werd hier gebruikt.
OPMERKING: Vergeet niet om de foto direct richten op het oculair van de microscoop. - Om de beste scherpstelling vinden, klik op Alle gesloten, zet de microscoop pin in de modus scherm, en klik op het tabblad Verwerving.
- Klik op Smart Setup onder het tabblad Overname; een venster geopend. Kies de juiste fluorofoor (dwz DAPI en Alexa Fluor 555, in het huidige project) in de lijst. De kleur wordt automatisch geselecteerd.
- Klik op Best signaal en Apply, klik dan op de belichting; de computer zal dan automatisch de belichting parameters.
- Voor het optimaliseren van het beeld, ga naar het venster Kanalen. Opheffen Track2, markeert Track1 en klik op Live. Focus het beeld indien nodig.
- In het venster Kanalen pas de volgende toetsen; op 1AU de pinhole automatisch optimaliseren. Het is zeer belangrijk om deze stap verder de confocale beelden zal niet optimaal zijn doen. Pas Gain om de beste intensiteit (houd deze instelling onder de 800 tot extra ruis te verminderen) te hebben. Tot slot stellen de Digital Gain tussen 2 en 3.
- Opheffen Track1, klik op Track2 en herhaal stap 3.8 voor Track2. Stop dan met Live.
- Ga naar het venster Acquisition Mode. Verbetering van het imago door het optimaliseren van Frame Grootte en Middelings-. Om te veranderen framemaat naar X * Y en kies 1024 x 1024. Kies een langzame snelheid om een beter beeld te creëren.
- Ga naar Middeling en selecteer een nummer ≥4. Deze gemiddelde waarde geeft het aantal scans dat zal worden gemiddeld om produce de verworven afbeelding. Klik nu op de Snap-knop, en het vastgelegde beeld 2D slaan.
- Voor 3D-beeldvorming, markeren de Z-Stack post onder Smart Setup waardoor het raam Z-Stack te openen.
- Stel de eerste en laatste posities voor de Z-stack, dat wil zeggen de diepte van de cel. Klik eerst op Live. Maak dan gebruik van de focus-station van de microscoop te richten op de bovenste positie van astrocyten in het weefsel, waar de Z-Stack is om te beginnen. Klik op Set First. Richten vervolgens naar de laagste stand van de astrocyten in het weefsel, waar de Z-Stack scannen moet worden gestopt. Klik op Set Last. Stop dan met Live.
- Kies het interval; 1,01 pm gebruikt in de huidige studie; kiezen interval kan door op Optimal om het aantal segmenten te stellen.
- Klik op Start Experiment. Sla de beelden zodra de scan is voltooid. Dit beeld wordt gebruikt voor het meten van de volgende parameters: oppervlak en het volume van de astrocyt grondgebied de gehele astrocyt van BHnches, cel lichaam en kern.
- Verwerven van een 2D-beeld met behulp van een 10X of 20X doel zoals beschreven in de stappen 3,6-3,11. Deze afbeelding kan worden gebruikt voor het meten van de intensiteit van fluorescentie immunoreactiviteit van antilichamen en astrocyten dichtheid (aantal / 1000 um 2).
4. Astrocyte Density en GFAP + Fluorescence Intensity
- Open het beeld 20X 2D. Klik op Histo (Hisogram) aan de linkerkant van het beeld venster.
- Om astrocyten dichtheid berekenen, selecteert drie opeenvolgende visuele velden onder 20X objectief. Tel het aantal astrocyten die een duidelijke soma vertonen met een minimum, overlappende takken in de velden.
- Fluorescentie-intensiteit te kwantificeren, selecteer een juiste gereedschap (rechthoek of cirkel) op de voettekst van het venster, en kies een gebied voor de meting. Noteer de gemiddelde waarde en de standaarddeviatie verschijnen automatisch onder de afbeelding. In de huidige studie, een 0,7 mm 2 rechthoekig gebied tussen striatum en mediale lemmet van dentate gyrus werd gebruikt.
5. Astrocyte Branches
- Om de lengte en het totale aantal vestigingen te kwantificeren, gebruik van 3D-beelden (overgenomen met 20X) in het beeld analyse software. Trek een draad met de hand langs de lengte van elke tak van de geselecteerde astrocyt. Selecteer dan de meting-tool die is gespecialiseerd voor het meten van lijn lengte. Om het aantal vestigingen te kwantificeren, selecteert u de telling-instrument om het aantal gemarkeerde items te tellen.
6. Volume en Oppervlakte
LET OP: Het merken van een structuur handmatig in 3D-beeld analyse software vereist focus en training. Oefen een paar keer voordat het starten van een experiment.
- Om het volume en de oppervlakte van de astrocyten kern, soma, cel lichaam en territorium te kwantificeren, de overdracht van de 3D-beelden (overgenomen in de stappen 3,1-3,16) om een 3D-beeld analyse software zoals Volocity 6.1.
- Open de software en een nieuwbibliotheek. Slepen alle beelden naar de linker grijze kolom in de nieuwe bibliotheek. Vervolgens selecteert u een 3D-beeld. Aan de rechterkant zijn er verschillende kanalen met verschillende kleuren. Schakelen op één kanaal van belang; bijvoorbeeld de blauwe kanaal voor DAPI bij het meten van de kern. De helderheid handmatig wijzigen om een optimaal contrast te krijgen.
- Kies in het menu Extra, ga naar Volume maken en produceren van een enkel 3D-beeld uit de Z-stack beelden. Klik op Eigenschappen in het menu Bewerken en zorg ervoor dat de X, Y en Z-eigenschappen worden gepresenteerd; anders is het onmogelijk om 3D analyse te verrichten.
- Klik op Freehand RIO gereedschap icoon in de werkbalk. Om het volume en de oppervlakte van de astrocyten nucleus meten trek een lijn rond de DAPI-gelabeld kern.
- Om het volume en de oppervlakte van de astrocyten cel lichaam te meten trek een lijn rond de soma exclusief takken.
- Om het volume en de oppervlakte van de gehele astrocyten (cel lichaam met inbegrip van filialen) meten trek een lijn rond de soma na deoppervlak van alle vestigingen.
- Om het volume en de oppervlakte van de astrocyt grondgebied beoordelen trek een lijn tussen de uiteinden van de takken.
OPMERKING: Druk op Delete op het toetsenbord om ongewenste tekeningen wissen. - Klik op het menu metingen boven in het beeldvenster een meetprotocol maken; een venster met verschillende gereedschappen opent.
- Slepen Zoek objecten naar boven van het venster (ruit). Geef een beschrijvende naam voor de bevolking 1, selecteert u de bijbehorende kleur en klik op Meting. Een ander venster geopend.
- Kies een parameter wil zeggen, het volume of de oppervlakte. Klik op OK. De gegevens worden weergegeven in een tabel.
- Om de gegevens opslaan, klik op het menu Meting en selecteer Make Meting Punt.
- Selecteer Een nieuwe meting item met de naam van het geopende venster. Geef dan een naam aan de gegevens in en klik op OK.
- Tot slot, de gegevens exporteren naar statistieken software zoals Graph pad of Excel-programma. Gebruik t-test om de gegevens te analyseren, dan plot 2D graphs.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
In dit gedeelte wordt een aantal voorbeelden van de kwalitatieve en kwantitatieve waarnemingen geproduceerd door 3D morfometrische analyse. Voor de volledige resultaten van alle 12 parameters eerder vermeld, zie onze eerdere publicatie 10.
Kwalitatieve Waarnemingen
Astrocytes vertoonden dunne of dikke takken die gewoonlijk werden lang Aß 1-40 geïnjecteerde ratten (Figuur 1). Enkele kleine stervormig gevormde astrocyten met k...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
In het huidige protocol, gebruikten we 3D confocale morfometrie evalueren 12 verschillende parameters die werden geassocieerd met astrocyt morfologie. Daartoe hippocampus weefsel van ratten Ap 1-40 - geïnduceerd astrogliose, met of zonder voorbehandeling genisteïne als een anti-inflammatoir middel gebruikt. Via 3D afbeeldingen en morfometrische software, konden we het effect van genisteïne op astrogliosis dus de morfologie van de astrocyten te tonen.
Veranderingen in de i...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Dit werk werd ondersteund door subsidies van de Raad van de Provincie van Östergötland (Zweden) en de Cellulaire en Moleculaire Research Center aan Iran Universiteit van Medische Wetenschappen (Teheran, Iran).
Dankbetuigingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Amyloid beta 1-40 | Sigma Aldrich | 79793 | Bewaar bij -70 °C |
| Genistein | Sigma Aldrich | 446-72-0 | Bewaar bij -20 °C |
| polycolonale konijnenantilichamen tegen glial fibrillair zuur proteïne | DAKO | Z0334 | |
| alkalisch fosfaat-geconjugeerde zwijnen anti-konijn IgG antilichamen | DAKO | ||
| Liquid Permanent Chromogen | DAKO | K0640 | |
| Liquid permanent Red Substrate Buffer | DAKO | K0640 | |
| Cremophor EL | Sigma Aldrich | 27963 | Polyethoxyleerde castorolie - Stap 1.1 |
| LSM 700 Confocal Laser Scanning Microscopy | Carl Zeiss | ||
| Volocity 6.3 | Perkin Elmer Inc., | ||
| Image Analysis 2000 | Tekno Optic | ||
| Stereotaxisch apparaat | Stoelting | ||
| Graph pad Prism 5 | Graph pad software Inc. |
Referenties
- Barres, B. A. The mystery and magic of glia: a perspective on their roles in health and disease. Neuron. 60 (3), 430-440 (2008).
- Pellerin, L., et al. Activity-dependent regulation of energy metabolism by astrocytes: an update. Glia. 55 (12), 1251-1262 (2007).
- Sofroniew, M. V., Vinters, H. V. Astrocytes: biology and pathology. Acta Neuropathol. 119 (1), 7-35 (2010).
- Pekny, M., Nilsson, M. Astrocyte activation and reactive gliosis. Glia. 50 (4), 427-434 (2005).
- Sofroniew, M. V. Molecular dissection of reactive astrogliosis and glial scar formation. Trends Neurosci. 32 (12), 638-647 (2009).
- Anderova, M., et al. Cell death/proliferation and alterations in glial morphology contribute to changes in diffusivity in the rat hippocampus after hypoxia-ischemia. J Cereb Blood Flow Metab. 31 (3), 894-907 (2011).
- Hatten, M. E. Neuronal regulation of astroglial morphology and proliferation in vitro. J Cell Biol. 100 (2), 384-396 (1985).
- Paxinos, G., Watson, C. A stereotaxic atlas of the rat brain. , Academic. New York. (1998).
- Kirby, E. D., Jensen, K., Goosens, K. A., Kaufer, D. Stereotaxic surgery for excitotoxic lesion of specific brain areas in the adult rat. J Vis Exp. (65), e4079(2012).
- Bagheri, M., et al. Amyloid beta(1-40)-induced astrogliosis and the effect of genistein treatment in rat: a three-dimensional confocal morphometric and proteomic study. PloS One. 8 (10), e76526(2013).
- Chvatal, A., Anderova, M., Kirchhoff, F. Three-dimensional confocal morphometry - a new approach for studying dynamic changes in cell morphology in brain slices. J Anat. 210 (6), 671-683 (2007).
- Kulkarni, P. M., et al. Quantitative 3-D analysis of GFAP labeled astrocytes from fluorescence confocal images. J Neuroscie Methods. 15 (246), 38-51 (2015).
- Wagner, D. C., et al. Object-based analysis of astroglial reaction and astrocyte subtype morphology after ischemic brain injury. Acta Neurobiol Exp. 73 (1), 79-87 (2013).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
