Analyse van de ontwikkelingslanden Tooth Germ Innervatie behulp van microfluïdische co-cultuur apparaten

Samenvatting

Co-cultures vertegenwoordigen een waardevolle methode om de interacties tussen zenuwen en doelweefsels en organen te bestuderen. Microfluïdische systemen maken co-cultiveren van ganglia en hele zich ontwikkelende organen of weefsels in verschillende kweekmedia mogelijk, waardoor ze een waardevol hulpmiddel vormen voor de in vitro studie van de interactie tussen neuronen en hun doelwitten.

Samenvatting

Innervatie speelt een belangrijke rol in de ontwikkeling, homeostase en regeneratie van organen en weefsels. Echter, de mechanismen die ten grondslag liggen aan deze fenomenen zijn nog niet goed begrepen. In het bijzonder is de rol van innervatie bij tandontwikkeling en regeneratie verwaarloosd.

Verscheidene in vivo studies hebben belangrijke informatie over de patronen van innervatie van tandheelkundige weefsels die tijdens de ontwikkeling en herstelprocessen van verschillende diermodellen. De meeste van deze benaderingen niet optimaal om de moleculaire basis van de interactie tussen zenuwvezels en target organen en weefsels te benadrukken.

Co-culturen vormen een waardevolle methode te onderzoeken en te manipuleren de interacties tussen zenuwvezels en tanden in een gecontroleerde en geïsoleerde omgeving. In de laatste decennia zijn conventionele co-kweken met hetzelfde kweekmedium uitgevoerd voor zeer korte perioden (bijvoorbeeld twee dagen)naar de aantrekkelijke of afstotende effecten van de ontwikkeling van orale en tandheelkundige weefsels op sensorische zenuwvezels te onderzoeken. Echter, is verlenging van de kweekperiode vereist om de effecten van innervatie voor tanden morfogenese en cytodifferentiation onderzoeken.

Microfluidics systemen maken co-culturen van neuronen en verschillende celtypes in de juiste cultuur media. We hebben onlangs aangetoond dat trigeminale ganglia (TG) en tanden kunnen overleven gedurende langere tijd bij co-gekweekt in microfluïdische inrichtingen, en voeren zij deze omstandigheden dezelfde innervatie patroon dat ze tonen in vivo.

Op basis hiervan beschrijven we hoe te isoleren en co-cultuur ontwikkelt trigeminale ganglia en tandkiemen in een microfluïdische co-cultuur system.This protocol beschrijft een eenvoudige en flexibele manier om co-cultuur ganglia / zenuwen en doelweefsels en de rollen bestuderen specifieke moleculen op dergelijke interacties in een controlled en geïsoleerde omgeving.

Inleiding

Innervatie speelt een belangrijke rol in de ontwikkeling, homeostase en regeneratie van organen en weefsels ^1,2. Bovendien is innervatie betrokken bij de regulatie van stamcel proliferatie, activering en differentiatie ^3-5. Inderdaad, recent studies uitgevoerd in weefsels van het orofaciale complex gebleken dat parasympathische zenuwen noodzakelijk epitheliale stamcellen functie dat bij de ontwikkeling en regeneratie van de speekselklieren ^6,7. Evenzo is aangetoond dat innervatie noodzakelijk is voor de ontwikkeling en instandhouding van smaakpapillen ^8-11. Het is dus belangrijk om de nog verwaarloosde rol van innervatie in de ontwikkeling van andere belangrijke orofaciale organen en weefsels geanalyseerd zoals tanden.

Ondanks de rijke innervatie van volwassen tanden, in tegenstelling tot alle andere organen en weefsels van het lichaam, developing tanden beginnen te worden geïnnerveerd spoedig postnatale fase. Tanden ontstaan ​​als gevolg van sequentiële en wederzijdse interacties tussen de orale ectoderm en craniale neurale kam afgeleide mesenchym. Deze interacties leiden tot epitheliaal afgeleide ameloblasts en mesenchym afgeleide odontoblasten die verantwoordelijk zijn voor de vorming van respectievelijk ¹² glazuur en dentine zijn. Sensorische zenuwen van de nervus ganglia en sympathische zenuwen van de superieure cervicale ganglia innerveren de volwassen tanden ^13-15. Tijdens de embryogenese, zenuwvezels afkomstig van de nervus ganglia project naar de ontwikkeling van tanden kiemen en geleidelijk omringen hen, maar ze niet doordringen in de dentale papilla mesenchym ^13. Zenuwvezels voer de tandheelkundige pulp mesenchyme op meer geavanceerde ontwikkelingsfasen die correleren met odontoblast differentiatie en dentine matrix depositie ^16. Tandmerg innervatie is completed kort na tand uitbarsting in de mondholte ^13. Eerdere studies hebben aangetoond dat verschillende semaforinen en neurotrofinen zijn betrokken bij de regulatie van innervatie in odontogenese ^16-19. Eerdere studies hebben duidelijk aangetoond dat innervatie is een voorwaarde voor tandvorming bij vissen ^20. Recentere studies hebben aangetoond dat de homeostase van dentale mesenchym stamcellen in muizen snijtanden wordt gereguleerd door sensorische zenuwen via secretie van sonic hedgehog (shh) ^21. Toch is de rol van de innervatie in tand initiatie, ontwikkeling en regeneratie is nog steeds zeer omstreden in zoogdieren ^22-24.

Een overvloed van in vivo studies hebben belangrijke informatie over de patronen van innervatie van tandheelkundige weefsels die tijdens de ontwikkeling en herstelprocessen van verschillende diermodellen ^13,25,26. De meeste van deze Appropijn niet optimaal om de moleculaire basis van de interactie tussen zenuwvezels en target organen en weefsels te benadrukken. Co-culturen vormen een waardevolle methode te onderzoeken en te manipuleren de interacties tussen zenuwvezels en tanden in een gecontroleerde en geïsoleerde omgeving ^26-29. Tegelijkertijd, co-kweek wordt onderworpen aan diverse technische aanpassingen. Bijvoorbeeld, zenuwen en specifieke tand (bv tandmerg, tand follikel, tandheelkundige epitheel) vereisen vaak verschillende kweekmedia om weefsel overleving garanderen langere tijd ^30-32.

In de laatste decennia zijn conventionele co-kweken met hetzelfde kweekmedium uitgevoerd voor zeer korte perioden (bijvoorbeeld twee dagen) op de aantrekkelijke of afstotende effecten ontwikkelen orale en dentale weefsels op sensorische zenuwvezels onderzoeken ^{27 - 29.}Echter, is verlenging van de kweekperiode vereist om de effecten van innervatie voor tanden morfogenese en cytodifferentiation onderzoeken en de dynamiek van zenuwvezels vertakking in doelorganen bestuderen. Derhalve zou nietaangrenzende co-kweken geschikter te onderzoeken op neuronale tandweefsel interacties.

Microfluidics systemen maken co-culturen van neuronen en verschillende celtypes in de juiste cultuur media. Bij deze inrichtingen worden tandweefsel en neuronen gescheiden in verschillende compartimenten, terwijl de groei van axons van de neurale cellichamen met microkanalen naar het compartiment met het doelweefsel ^33. Microfluïdische inrichtingen zijn reeds gebruikt om de interactie tussen neuronen en microglia ^34,35, en cel tot cel interacties te bestuderen bij kanker en neovascularisatie ^35. Bovendien zijn deze systemen gebruikt om de interacties tussen dors bestuderenal ganglia en osteoblasten ^36.

We hebben onlangs aangetoond dat trigeminale ganglia (TG) en tanden kunnen overleven gedurende langere tijd bij co-gekweekt in ³⁷ microfluïdische inrichtingen. Bovendien hebben we aangetoond dat de tanden van verschillende ontwikkelingsstadia handhaven in deze in vitro omstandigheden dezelfde afstotende of aantrekkelijke effecten trigeminal innervatie zij vertonen in vivo ^37. Dit protocol geeft informatie over eenvoudige, krachtige en flexibele manier om co-cultuur ganglia / zenuwen en doelweefsels en de rollen van specifieke moleculen studie over dergelijke interacties in een gecontroleerde en geïsoleerde omgeving.

Protocol

Alle muizen werden onderhouden en behandeld volgens de Zwitserse Animal Welfare wet en in overeenstemming met de voorschriften van de kantonrechter Veterinair Bureau, Zürich.

1. Voorbereiding van de Dissection Material, Cultuur Media, microfluïdische apparaten

1. Autoclaaf micro-dissectie pincet en een schaar (121 ° C, sterilisatie: 20 min) en bewaar ze in een steriele container.
2. Steriliseer dekglaasjes (24 mm x 24 mm) door te incuberen in 1 M HCl gedurende 24 uur op een orbitale schudinrichting bij 37 ° C. Was ze driemaal met steriel, gedestilleerd _H2O en driemaal met ethanol 99%. Droog dan de dekglaasjes bij 37 ° C of onder steriele zuurkast. Tenslotte geautoclaveerd of dekglaasjes aan UV-licht (30 min) bloot aan de sterilisatie voltooien. Dekglaasjes kunnen vervolgens worden opgeslagen in ethanol 70%.
3. Verwijder zorgvuldig de AXIS Axon Isolatie apparaten uit de verpakking met behulp van een steriel pincet en plaats ze in een steriele petrischaal.
4. Met behulp van een steriele punch biopsie (ø: 1 mm) maakt één gat per monster worden gekweekt (figuur 1) in overeenstemming van de kweek kamers.
   LET OP: Niet te dicht bij de microgroeven slaan, als ze zouden kunnen worden beschadigd door de toegepaste druk.
5. Steriliseer de AXIS Axon Isolation Devices door alom tegenwoordige hen in ethanol 70%. Droog vervolgens AXIS Axon Isolatie Apparaten en dekglaasjes volledig onder een steriele stroming kap. Wacht een minimum van 3 uur voordat u verder gaat.
   OPMERKING: incomplete drogen zal resulteren in een defecte assemblage van de microfluïdische apparaten.
6. Plaats elke dekglaasje in een 35 mm petrischaal of in een goed binnen een 6-wells plaat.
7. Plaats de AXIS Axon Isolation Device op het dekglaasje en druk voorzichtig maar stevig met een pincet met gebogen uiteinden om volledige hechting tussen de isolatie-inrichting en het glas dekglaasje mogelijk te maken.
8. In elk kweekkamer, pipet 150 ul van poly-D-lysine (0,1 mg / ml in steriel, gedistilleerd H ₂O). Plaats de microfluïdische inrichtingen onder vacuüm gedurende 5 min, teneinde alle lucht uit de kweek kamers verwijderen.
9. Als de lucht nog steeds te zien in de kamers, re-pipet de poly-D-lysine oplossing in de kamers.
10. Incubeer hulpmiddelen met poly-D-lysine O / N bij 37 ° C.
11. Was kamers drie keer met steriel, gedistilleerd H ₂ O.
12. Vul kamers met 150 ul laminine werkoplossing (Sigma-Aldrich, 5 ug / ml in PBS of serumvrij medium) en geïncubeerd O / N bij 37 ° C.
13. Bereid 50 ml medium voor trigeminale ganglia kweken ^37, als volgt samengesteld: 48 ml Neurobasal medium, 1 ml B-27, 100 U / ml penicilline / streptomycine, 2 mM L-glutamine, 5 ng / ml zenuwgroeifactor (NGF) , 12:25 cytosinearabinoside.
14. Bereid 50 ml medium voor tandkiem kweken ^37, als volgt samengesteld: 40 ml DMEM-F12, 10 ml foetaal runderserum (FBS, eindconcentratie: 20%), 100 U / ml penicilline / streptomycine, 2 mM L-glutamine, 150 ug / ml ascorbinezuur.

2. Mouse Embryo Generation en Dissection

1. Bepaal embryonale leeftijd volgens vaginale plug (vaginale plug: embryonale dag van de ontwikkeling van 0,5, E0.5) en bevestig het via morfologische criteria. Voor dit protocol, over het algemeen gebruiken we E14.5-E17.5 muis embryo's.
2. Reinig de dissectie gebied en de stereoscoop met ethanol 70%.
3. Offer de zwangere moeder via cervicale dislocatie. Blokkeer de hals van de muis met de eerste en tweede vinger op een rooster, en trek met de beslissing van de staart.
4. Prepareer de huid rond de onderbuik, en open de buik met een schaar. Zoek de baarmoeder tijdens dergelijke late stadia van de zwangerschap, de baarmoeder overvloedig vul de buikholte.
5. Ontleden de baarmoeder en plaats in een buis gevuld met PBS op ijs. Wanneer op ijs, kan het weefsel worden overgelaten voor meerdere uren. Gooi het lijk van de moeder volgens de institutionele richtlijnen
6. Ontleden uit de embryo's uit de baarmoeder en hen bevrijden uit hun extra-embryonale weefsels. Plaats de embryo's in PBS op ijs.
7. Onthoofden het embryo met een schaar, en scheiden de onderkaak van de rest van de kop met micro-dissectie scharen (Figuur 2A). Verwijder precies de onderkaak, zonder beschadiging van de nervus ganglia; zoals deze zijn gelokaliseerd in de nabijheid van de onderkaak, de toevallige beschadiging mogelijk. Bewaar de onderkaak en de rest van de kop in koud PBS op ijs.
8. Om TG ontleden, neem het hoofd en plaats deze op een dissectie glazen petrischaal, die eerder gevuld met koud PBS. Met behulp van de tang, verwijder de huid en de schedel. Verwijder vervolgens de telencephalon en de kleine hersenen door het plaatsen van een tang onder de telencephalon en lift; het telencefalon en het cerebellum samen draaien, waardoor de onderkant van de schedel blootgelegd.
9. Lokaliseren van de nervus ganglia (figuur 2B). Gebruik de tangde TG scheiden van de trigeminale zenuw. Elimineer de resten van de nervus projecties met behulp van de dissectie naalden als messen. Plaats de ontleed TG in een petrischaal gevuld met koud PBS en bewaar ze op ijs.
10. Embryonale tanden ontleden, plaatst de onderkaak, die eerder gescheiden van de schedel, op de dissectie glazen petrischaal, gevuld met koud PBS. Met behulp van dissectie naalden als messen, verwijder de tong en de huid rond de kaak. Scheid links en rechts hemi-bekken door snijden langs de middellijn van de kaak. De tandkiemen goed zichtbaar, zie figuur 1C. Isoleer de tand ziektekiemen met dissectie naalden en verwijder de overmaat aan niet-tandheelkundige weefsels. Plaats de ontleed tand kiemen in een petrischaal gevuld met koud PBS en bewaar ze op ijs.

3. Microfluïdische Co-culturen

1. Na dissectie, verwijder laminine van de microfluïdische apparaten. Vul de kamers met 200 ul van de onderscheidenlijkve media.
2. Met een pincet, de overdracht zachtjes de ontleed TG en tand ziektekiemen in de gaten gemaakt door ponsen (figuur 1D). Zorg ervoor dat de tand ziektekiemen niet zweven en dat ze zinken tot ze contact op met de dekglaasjes.
3. Kweken van de monsters in incubator bij 37 ° C, 5% CO _2.
4. Verander het kweekmedium elke 48 uur. Laat de kamers niet helemaal leeg, en niet direct pipet in de cultuur kamers. Volledig leegmaken van kamers zou resulteren in de vorming van luchtbellen in de kamers; directe pipetteren in de kamer zou resulteren in axonale schade. Om deze problemen te voorkomen, verwijder het medium wijzen de pipet naar de externe kant van de putten; evenzo pipet vers medium aan de zijde van de putten bevindt tegenover de kamers.
5. Tijdens de kweekperiode, kan co-culturen gemakkelijk worden afgebeeld door time-lapse microscopie. Co-culturen worden gedurende meer dan 10 dagen.
6. Na de cultuur period, was de kamers door pipetteren 150 pi PBS in een goed per kamer en laten PBS stromen door de kamers drie keer.
7. Verwijder de PBS en bevestig de monsters door pipetteren 150 ul van paraformaldehyde 4% (in PBS) in een goed per kamer; incuberen bij kamertemperatuur gedurende 15 min.
8. Was de kamers tweemaal met PBS, zoals beschreven in 3.6.
9. Ga verder met verdere analyse.

Resultaten

Deze resultaten tonen aan dat geïsoleerde trigeminale ganglia kan groeien in een compartiment van de microfluïdische inrichting en bovendien, dat de ontwikkeling van de geïsoleerde tandkiemen blijft gedurende langere tijd in het andere compartiment van de microfluïdische apparaat. Verschillende kweekmedia worden in de twee compartimenten en de microgroeven tussen de twee compartimenten mogelijk verlenging van axon van het trigeminale ganglion tegenover de ontwikkelingslanden tandkiemen. Figuur 3 is een ...

Discussie

Vorige in vitro studies van de tand innervatie waren gebaseerd op conventionele co-culturen van de ganglia semilunares en tandheelkundige weefsels of cellen ^26,28,29. Deze studies werden uitgevoerd om vooral de aantrekkelijke effecten van deze cellen of weefsels voor sensorische axons ³⁸ onderzoeken. Hoewel het brengen van significante vooruitgang in het veld, werden verschillende technische kwesties. Tooth kiemen beginnen te ontaarden na enkele dagen van de cultuur ^37. Op basis...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
AXIS Axon Isolation Devices	Millipore	AX15010-TC	Microchannels van verschillende lengte zijn beschikbaar
Laminin	Sigma Aldrich	L2020
Neurobasal	Gibco	21103-049
B27	Gibco	17504
Recombinant Mouse beta-NGF	R&D Systems	1156-NG-100	Human en Rat beta-NGF (R&D Systems) zijn gelijkwaardig
DMEM-F12	Gibco	11320-033