Methodenartikel

A-Label gratis Techniek voor de ruimte en tijd Imaging van Single Cell afscheiding

DOI:

10.3791/53120

⸱

23 november 2015

 ,  ,  ,  , 
1Materials Science and Technology, Naval Research Laboratory, 2Center for Bio/Molecular Science and Engineering, Naval Research Laboratory

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Intercellulaire communicatie kritisch om diverse fysiologische activiteiten binnen en buiten de cel. Dit document beschrijft een protocol voor het meten van de ruimtelijke en temporele karakter van enkele cel afscheidingen. Om dit te bereiken, is een multidisciplinaire aanpak waarin label-free nanoplasmonic sensing met live-cell imaging integreert.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Intercellulaire communicatie is een integraal onderdeel van een complex systeem dat helpt bij het onderhouden van basiscellulaire activiteiten. Als gevolg hiervan kan het slecht functioneren van dergelijke signalering leiden tot vele aandoeningen. Om cel-tot-cel-signalering te begrijpen, is het essentieel om de ruimtelijke en temporele aard van de uitgescheiden moleculen van de cel te bestuderen zonder de lokale omgeving te verstoren. Er zijn verschillende assays ontwikkeld om eiwitsecretie te bestuderen, maar deze methoden zijn doorgaans gebaseerd op fluorescente sondes die de relevante signaalroutes verstoren. Om deze beperking te overwinnen, is een label-free techniek vereist.

In dit artikel beschrijven we de fabricage en toepassing van een label-free gelokaliseerde oppervlakteplasmonenresonantie-imaging (LSPRi) technologie die in staat is om eiwitsecreties van een enkele cel te detecteren. De plasmonische nanostructuren worden lithografisch gepattend op een standaard glazen dekglas en kunnen worden geëxciteerd met zichtbaar licht op commercieel verkrijgbare lichtmicroscopen. Slechts een klein deel van het dekglas is bedekt met de nanostructuren en daarom is deze techniek goed geschikt voor het combineren van gangbare technieken zoals fluorescentie- en helderveldbeeldvorming.

In dit protocol wordt een multidisciplinaire aanpak gebruikt die sensornanofabricage en daaropvolgende biofunctionalisatie, bindingskinetiek karakterisering van ligand en analyt, de integratie van de chip en levende cellen en de analyse van het gemeten signaal omvat. Als geheel stelt deze technologie een algemene label-free benadering mogelijk voor het in kaart brengen van cellulaire secreties en het correleren ervan met de reacties van naburige cellen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Intercellulaire communicatie is cruciaal voor de regulering van vele fysiologische activiteiten binnen en buiten de cel. Een verscheidenheid van eiwitten en vesicles kan worden afgescheiden, die vervolgens leiden tot complexe cellulaire processen, zoals differentiatie, wondgenezing, immuunrespons, migratie en proliferatie. 1-5 Storingen van inter-cellulaire signaalroutes zijn betrokken bij vele ziekten zoals kanker, atherosclerose en diabetes, een paar te noemen.

De optimale celsecretie assay moet in staat zijn ruimtelijk en temporeel kaart brengen uitgescheiden eiwit plaats zonder verstoring van de betreffende signaalwegen. Zo causale verbanden tussen de concentratieprofielen en de reactie van de ontvangende cellen kunnen worden afgeleid. Helaas zijn veel van de meest algemeen gebruikte fluorescentie-gebaseerde technieken niet aan deze criteria. Fluorescent fusie-eiwitten kunnen worden gebruikt om de analyt te taggen winnen de cel maar kan de secretieroute verstoren of uitgescheiden, leidt tot een diffuse gloed buiten de cel die moeilijk te kwantificeren. Fluorescerende-immunosandwich gebaseerde assays zijn de meest gebruikte technieken voor het detecteren cellulaire afscheiding maar vereisen typisch isolatie van afzonderlijke cellen. 11/06 Bovendien is de invoering van de detectie antilichaam kenmerkend stopt of beëindigt het experiment en de omvang van het antilichaam labels, 150 kDa voor IgG, is een belemmering voor de downstream signalering.

Vanwege deze wegversperringen het de voorkeur dat een labelvrije techniek worden toegepast om het eiwit afscheidingen en tussen bestaande labelvrije technologieën, oppervlakte plasmon resonantie (SPR) en sensoren gelokaliseerd surface plasmon resonance (LSPR) zijn uitstekende kandidaten. 12-17 Deze sensors zijn op grote schaal gebruikt voor het analyt bindingsstudies van eiwitten, exosomes en andere biomarkers. 18-24 Bij LSPR, de plasmonische nanostructures kan lithografisch worden gevormd op dekglaasjes en enthousiast met behulp van zichtbaar licht via een standaard wide-field microscopie configuraties. Door hun nanoschaal voetafdruk, het merendeel van het glazen substraat voor algemeen beeldvormingstechnieken zoals helder-veld en fluorescentiemicroscopie maken van deze probes zeer geschikt voor integratie met levende cellen microscopie. 25-28 We hebben de real-time metingen aangetoond antilichaam afscheiding uit hybridoomcellen met gefunctionaliseerde goud plasmonische nanostructuren met ruimtelijke en temporele resoluties van 225 msec en 10 micrometer, respectievelijk. De basis chip configuratie is in figuur 1. 28 De uitgang lichtweg van de microscoop wordt verdeeld tussen een CCD-camera gebruikt voor beelden en een vezel-optisch gekoppelde spectrometer voor de kwantitatieve bepaling van fractionele bezetting van een bepaalde reeks nanostructuren (figuur 2 ).

De protocol in dit document beschrijft de experimentele opzet voor het real-time meting van één cel afscheiding tegelijkertijd bewaken van de respons van de cellen met behulp van de standaard licht-microscopie. De multidisciplinaire aanpak omvat de vervaardiging van nanostructuren, functionalisering van de nanostructuren van de hoge affiniteit binding van analyten oppervlak optimalisatie voor zowel het minimaliseren van niet-specifieke binding en karakteriseren kinetische snelheidsconstanten met een commercieel Surface Plasmon Resonance (SPR) instrument, integratie van cellijnen op het substraat, en de analyse van beelden en spectrale gegevens. We verwachten van deze techniek om een ​​enabling technology voor de ruimte-tijd in kaart brengen van de cel afscheidingen en hun causale relaties met het ontvangen van cellen.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Nanostructuur Fabrication

  1. Kies 25 mm diameter glazen dekglaasjes met een dikte van ongeveer 170 urn (1,5 No.) als substraten voor nanofabricage.
  2. Dompel de dekglaasjes in piranha-oplossing (3: 1 verhouding van zwavelzuur en waterstofperoxide) gedurende ten minste 6 uur. Was de piranha gedrenkt dekglaasje met ruime hoeveelheid ultrapuur 18,2 MQ gedeïoniseerd gedestilleerd water (DDW).
    LET OP: Piranha zuur reageert hevig met organische materialen en moet met uiterste zorg worden behandeld.
  3. Aanbetaling van 10 nm chroom dunne film op de dekglaasjes door e-beam verdamping om de leiding effecten tijdens de patroonvorming en beeldvorming van nanostructuren te voorkomen.
  4. Draai de eerste laag dubbellaag weerstand bestaande uit ethyllactaat methylmethacrylaat (MMA_EL6) copolymeer bij 2000 rpm gedurende 45 seconden en vervolgens bakken bij 150 ° C. Draai de tweede laag van poly-methylmethacrylaat (950PMMA_A2) bij 3000 tpm gedurende 45 sec daarna bakken bij 180 ° C.
  5. Getrippeln de bilaag resist met de elektronenbundel lithografie (EBL) bij 25 kV met een oppervlakte dosis van 300 uC / cm 2. Ontwikkelen in isopropylalcohol (IPA) / methylisobutylketon (MIBK): 2/1 en spoel in IPA.
  6. Borg Ti (5 nm) / Au (80 nm) film op het substraat met behulp van een e-beam verdamper.
  7. Na de gouden afzetting, til de copolymeer dubbellaag te weerstaan ​​door het weken het substraat in aceton gedurende 4 uur.
  8. Inspecteer de ondergrond met de scanning elektronenmicroscoop (SEM) met nanostructuur vorm en grootte te bevestigen, verwijder de overgebleven chroom uit het substraat via natte ets behulp CR-7 etsmiddel gedurende 60 seconden bij kamertemperatuur en spoel in DDW.
  9. Ontwerp een hart-op-centrum scala tussenruimte van 33 micrometer ruimte voor cell imaging tussen arrays te verlaten. Patroon van de nanostructuren in 20 x 20 patroon voor elke array met een toonhoogte van 300 nm met behulp van een e-beam schrijver. Elke chip bevat 300 arrays met een typische nanostructuur afmeting van 80 ± 2,5 nm hoogte en 70 ± 2,5 nm Diameter.
  10. Inspecteer een subset van arrays met de atomic force microscope (AFM) voor de verificatie van grootte en uniformiteit.
  11. Bevestig een steunring, gewoonlijk silicium, met de achterkant van het dekglaasje met UV-uithardende epoxy.

2. Chip Reiniging en toepassing van Self-geassembleerde monolaag

  1. Voor het reinigen en regenereren van de chips, as plasma met een vermogen van 40 W in een 300 mTorr mengsel van 5% waterstof, 95% argon gedurende 45 seconden na het reinigen van de kamer gedurende 5 minuten onder dezelfde omstandigheden.
  2. Functionaliseren goud nanostructuren direct na verassen door onderdompeling van de chip in een tweecomponenten thiol ethanolische oplossing bestaande uit een 3: 1 verhouding tussen SH- (CH 2) 8 -zoals 3-OH (SPO) en een component met ofwel een amine of carboxyl functionele groepen, namelijk SH- (CH 2) 11 -zoals 3-NH 2 (SPN) of SH- (CH 2) 11 -zoals 3-COOH (SPC).
  3. Laat de chip in de thiol oplossing O / N om een ​​zelf-geassembleerde monolaag (SAM) te vormen.
  4. Spoel de chip met ethanol en droog met stikstofgas.
  5. Indien nodig, slaan de gefunctionaliseerde chip maximaal 2 weken bij 4 ° C.
  6. Bij gebruiksklaar reageren SPN of SPC component met behulp van een chemisch ligand afhankelijk van het ligand naar keuze (zie hieronder).
    Opmerking: De chips kunnen worden geregenereerd en opnieuw gefunctionaliseerde tientallen keren. Een bepaalde chip kan worden gebruikt voor perioden die variëren van 6 maanden tot een jaar. De spectra gemeten op een bepaalde serie worden betrouwbaar gereproduceerd na herhaalde regeneraties door plasmaverassing, gevolgd door biofunctionalization. 29

3. Oppervlakte functionalisering en Kinetic karakterisering

Opmerking: Gebruik de gefunctionaliseerde chip in de commerciële SPR instrument om de kinetische snelheidsconstanten tussen het ligand en de analyt te karakteriseren, evenals de weerstand van SAM aspecifieke b bestudereninding. Er is een breed scala van stroomsnelheden en microfluïdische ontwerpen die het mogelijk maken voor een efficiënte oppervlak functionalisering. Aangezien we een commercieel beschikbare SPR we gestandaardiseerd rond zijn aanbevolen debiet. We merken op dat deze debieten zijn typerend voor alle SPR instrumenten en zijn dus niet beperkend. De SPR instrument is niet noodzakelijk aangezien alle functionalisering direct kan worden gedaan op de LSPR chip, maar het heeft ons minder werklast omdat het een multiplex-instrument terwijl onze LSPR microfluïdische setup niet.

  1. Functionaliseren een commercieel kale gouden chip met de SAM, zoals beschreven in hoofdstuk 2.
  2. Bij gebruik van een ABC SAM, activeert de carboxylgroep met een 1: 1 mengsel van 133 mM 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) en 33 mM N-hydroxysuccinimide (NHS) in DDW gedurende 10 min.
  3. Vervoeg de geactiveerde carboxylgroep met het antilichaam / ligand plaats voor 300 seconden met een stroomsnelheid van 30 pl / min. Bereid de ligandenpH 6 fosfaatbuffer, kenmerkend, maar dit kan variëren afhankelijk van het molecuul.
  4. Na de ligand conjugatie stromen 0,1 M ethanolamine in met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) als deactivator stap voor 300 seconden met een snelheid van 30 pl / min. Ethanolamine helpt bij het minimaliseren van de niet-specifieke binding.
  5. Het introduceren van belang zijnde analyt met een debiet van 100 ul / min onder toepassing van een reeks concentraties en bereken de kinetische snelheidsconstanten met een kinetische analyse software.
  6. Wanneer niet-specifieke binding is problematisch, verhoging van de verhouding SPO SPC of SPN.

4. LSPR Algemene instellingen

  1. Microscoop instellingen:
    1. Gebruik maken van een 100 W halogeenlamp aan Koehler verlichten van het monster. Gebruik een lange pass filter (meestal 593 nm afsluiting) in het licht pad naar golflengtes die niet bijdragen aan de resonantie shift (figuur 2) te elimineren.
    2. Voor de LSPRi het verzamelen van gegevens, gebruik maken van een omgekeerde microscoop met een 40X olie Immersion doel (1.4 NA) en een thermo-elektrisch gekoelde 16 bit CCD-camera.
    3. Plaats een bundelsplitser aan de uitgangspoort van de microscoop beelden en spectra tegelijk verkrijgen.
    4. Stel de temperatuur gecontroleerde microscoop podium tot 37 ° C en equilibreren gedurende 4 uur.
    5. Voorzien zijn van een bijkomende incubatie samenstel op de microscoop om de CO 2 concentratie en vochtigheid te reguleren bij 5% en 95% respectievelijk.
  2. Chip voorbereiding en montage:
    1. Functionaliseren de LSPR chip zoals beschreven in paragraaf 2 met de optimale tweecomponenten SAM verhoudingen bepaald uit de SPR experimenten.
    2. Laad de chip in een op maat gemaakte microfluïdische houder als volgt. Plaats de chip op een aluminium onderste stuk. Sandwich de chip tussen het onderste stuk en een siliconen pakking en een doorzichtige plastic bovenste stuk. Gebruik de 4 schroeven aan de montage klem.
    3. Voor een typische SPC-gebaseerde applicatie thiol, drop coat 300 pi van een 1: 1 mixtuur van 133 mM EDC en 33 mM NHS in DDW de carboxylgroepen van het SPC thiol component activeert.
    4. Wacht 10 minuten en het oppervlak handmatig spoelen met 10 mM PBS.
    5. Vervoeg de geactiveerde carboxylgroep met de ligand (kenmerkend een antilichaam of antilichaamfragment) plaats druppel coating 300 pl ligandoplossing.
    6. Wacht 30 minuten en handmatig spoelen met 10 mM PBS.
    7. Drop coat 300 gl 0,1 M ethanolamine in PBS op de chip niet-specifieke binding te minimaliseren. Wacht 10 minuten.
    8. Was het ethanolamine met PBS dat 0,005% Tween 20 (PBS-T20).
    9. Plaats een kwarts stuk boven de chip voor schommelingen in de gegevens met betrekking tot een veranderende meniscus te verminderen.
    10. Houd de chip nat met PBS-T20 buffer tijdens de montage op de microscoop.
    11. Plaats de LSPR chip assemblage stevig in de verwarmde podium monster houder en bevestig microfluïdische buizen.
    12. Bevestig de microfluidics slang aan op de assemblage en stroom buffer (of serum vrije media voor mobiele studies) tot een steady state is bereikt.
    13. Laat de montage en microscoop equilibreren gedurende ten minste 2 uur.
    14. Lijn de chip via joystick zodat de centrale matrix wordt uitgelijnd met de optische voor spectroscopie. Spectroscopische gegevens worden genomen met behulp van een spectrometer en spectrale analyse software.
    15. Houd arrays in focus gedurende het experiment met behulp van software autofocus, Zeiss Definite Focus of gelijkwaardig autofocus apparaat.

5. LSPR Imaging van anti-c-myc afscheiding uit 9E10 Hybridomacellen

Opmerking: De hybridoma cellijn die voor dit onderzoek expressie anti-c-myc antilichaam constitutief en dus niet een chemische trekker vereisen

  1. Functionaliseren de nanostructuren met een c-myc peptide. Dit heeft een Ko-waarde van 1,77 nM voor de anti-c-myc antilichamen die door hybridomacellen kloon 9E10.
  2. Kweek de hybridomacellen in complete kweekmedium met 10% foetaal runderserum (FBS) en 1% antibioticum in een T75 fles bij 37 ° C onder 5% CO2. Handhaaf een celdichtheid van 4 x 10 5 cellen / ml.
  3. Voor de celsecretie studies, pellet cellen van de T75 kolf door centrifugeren, twee keer wassen met RPMI-1640 serumvrij medium (SFM) de afgescheiden antilichamen te verwijderen en pas de celdichtheid 4 x 10 6 cellen / ml.
  4. Oogst de cellen en test voor de levensvatbaarheid van vóór de invoering van ze aan de LSPR chips.
  5. Invoering 50 ul van de celoplossing handmatig op de LSPR chips met een micropipet. Na enkele minuten 25 tot 50 cellen hechten aan het oppervlak van de LSPR chips.
  6. Wegspoelen de resterende cellen in een oplossing met verse SFM met de microfluïdische perfusie-systeem.
  7. Selecteer de LSPR arrays voor de beeldvorming die in de buurt zijn, binnen 10 micrometer, maar niet overlapt met de cellen.
  8. Om het signaal specifiek is voor het uitgescheiden anti-c-myc ANTIBOdies introduceren celkweekmedium met en zonder de onderhavige antilichamen alsook met de antilichamen, maar hun bindingsplaatsen geblokkeerd door de aanwezigheid van een verzadigende concentratie van c-myc peptide in de oplossing.
  9. Kalibreer de sensoren aan het eind van elke proef met een verzadigende oplossing van anti-c-myc-antilichamen (250 nM). Dit helpt bij het normaliseren van de reactie van de sensoren en bepalen fractionele bezetting basis van de biofunctionalization profiel van elke run.
  10. Corrigeer de drift in de X- en Y-richting met behulp van het alignment software.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In een typische levende celsecretie onderzoek er meerdere wijzen van data plaatsvindt. Figuur 3 toont een overlay van een LSPRi beeld, waarbij de vierkante arrays belicht, en uitgezonden licht verlicht beeld dat de cel belicht linksonder. Gegevens worden gewoonlijk verzameld in een 3-uur periode, gevolgd door de introductie van een verzadigende oplossing van het analyt voor de normalisatie berekening hieronder beschreven. Fluorescentie beelden kunnen ook in de gegevensverzameling routine worden geïntegreerd door het automatische schakelen van een filter kubus. In figuur 4 een cel gekleurd met de fluorescerende membraan kleurstof rhodamine DHPE vertoont lamellipodia-achtige extensies (pijlen). Als dergelijke verlengingen zouden overlappen met de arrays zouden ze een vals-positief voor eiwitsecretie. Met meerdere modi van beelden kan helpen identificeren van dergelijke voorvallen.

Figuur 5 toont spectrometrische gegevens vóór en achterer de invoering van een verzadigende oplossing (400 nM) van commercieel aangekocht anti-c-myc antilichamen tegen het c-myc gefunctionaliseerde arrays. Geen cellen waren aanwezig in dit experiment. Het spectrum toont zowel een roodverschuiving en een toename in intensiteit. Het verschil tussen de gebieden onder de twee curves resulteert in een verhoging van de matrix beeldintensiteit in LSPRi modus op de CCD camera. Een niet-lineaire kleinste kwadraten gegevensanalyse aanpak ontwikkeld fractionele bezetting van het oppervlak gebonden liganden uit de spectra afgeleid. 30,31

Aan het einde van het experiment, de verzadigde intensiteitswaarden (bijvoorbeeld fractionele bezetting ≈ 1) gebruikt om een genormaliseerde respons voor elke array met de volgende formule berekenen:

Wanneer de genormaliseerde intensiteit op tijdstip t, oorspronkelijke intensiteit bij aanvang van het experiment uiteindelijke verzadigde intensiteit en gemeten intensiteit van de array op tijdstip t resp.

Genormaliseerde waarden van twee matrices worden getoond in Figuur 6. Een matrix werd op 10 um van de cel onderzochte terwijl het andere, gebruikt als controle, werd een afstand van 130 urn uit de cel. De plotselinge toename van de genormaliseerde reactie van de matrix dichtst bij de cel ten opzichte van de vlakke respons van de controle matrix wijst op een gelokaliseerde uitbarsting van uitgescheiden antilichamen.

figure-results-1
Figuur 1. Sensor Design. Een tekening die de geometrie van een typische levende celsecretie experiment. De cel (blauwe sferoïde) is afgezet op het LSPR chip die arrays van biofunctionalized goud nanostructuren bevat. In het ingezoomde weergave, de cel afscheiding van belang, in dit geval antilichamen aangegeven als Y-vormige moleculen wordt gemeten als ze binden aan het oppervlakvan de gefunctionaliseerde nanostructuren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2. Optische Setup. Het verlichte licht van een halogeenlamp wordt eerst gefilterd door een lange pass filter (LP). Het licht wordt lineair gepolariseerd (P1) en verlicht via een 40X / 1.4 NA doelstelling het monster. Het verstrooide licht wordt verzameld door de objectieve en door een gekruiste polarisator (P2). Een 50/50 bundelsplitser (BS) wordt in de verzamelde lichtweg voor gelijktijdige beeldvorming en spectroscopische analyse. Rechtsboven:. Een atomic force microscopy beeld van 9 individuele nanostructuren gescheiden door een worp van 300 nm Klik hiervoor een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3. Levende Cell LSPRi Study. Een samengevoegd doorgelaten licht en het beeld LSPRi toont een enkele hybridomacel (linksonder), omringd door 12 arrays. Dit is een contrast verbeterd. Schaal bar is 10 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-4
Figuur 4. Levende Cell Fluorescence Study. Een fluorescerende kleurenbeeld van een hybridoma cel gekleurd met rhodamine DHPE, die een membraan kleurstof false. Fluorescerend afbeeldingsmode de matrices zijn algemeen niet zichtbaar, maar de buurt array here waarneembaar als abmissen plein in de rechter benedenhoek. De cel kan gezien worden gescheiden van de matrix hoewel tentakel uitsteeksels (eventueel filopodia of lamellipodia) buitenwaarts uitstrekt vanaf de cellen (pijlen). Schaal bar is 10 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-5
Figuur 5. Spectrale modaliteit. De verkregen uit een c-myc gefunctionaliseerde matrix voor en na de introductie van 400 nM oplossing van anti-c-myc antilichamen spectra. Geen cellen waren aanwezig in dit onderzoek. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-6
Figuur 6. Single Cell secretie. De reactie van een matrix zich binnen 15 urn van een enkele cel en één op 130 um verwijderd (Control). Schaal bar is 10 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De LSPR-beeldtechniek die in dit werk wordt beschreven, heeft talrijke voordelen boven meer traditionele methodologieën voor het detecteren van celsecreties. Ten eerste is de tijdsresolutie van onze techniek in de orde van seconden, terwijl de commerciële alternatief, een immunosandwhich-test bekend als EliSpot, een typische tijdsresolutie heeft van 2 tot 3 dagen.7,32 Als gevolg hiervan waren we in staat plotselinge veranderingen in de snelheid van eiwitsecretie op te lossen, zoals dat getoond in Figuur 6. Ten tweede, met arrays die over de chip zijn verdeeld, kan het uitgescheiden signaal in ruimte en tijd worden gevolgd, wat rigoureuzere vergelijkingen mogelijk maakt met diffusie-gebaseerde modellen van celsecretie. Bovendien kunnen arrays zoals de controlearray getoond in Figuur 6 worden gebruikt om globale veranderingen in het beeld weg te trekken die doorgaans voortvloeien uit instrumentele factoren zoals focusdrift. Ten derde vereist onze techniek geen wijzigingen aan de cellen. Indien gewenst, kan het experiment algemeen gebruikte tags zoals fluorescerende eiwitten bevatten, maar als er bezorgdheid is dat dergelijke tags de celviabiliteit of homeostase negatief kunnen beïnvloeden, vereist de label-vrije aard van onze aanpak ze niet. Ten vierde hebben we met behulp van de spectroscopische gegevens aangetoond dat kwantitatieve informatie over de fractionele bezetting van aan het oppervlak gebonden liganden kan worden berekend.

Er zijn talrijke alternatieve methoden voor EBL voor het fabriceren van metaalnanodeeltjes. We hebben echter gevonden dat de EBL aanzienlijke flexibiliteit biedt voor het optimaliseren van nanostructuur- en arraydimensies om het best te passen bij de optica en de onderzochte cellen. Ook cruciaal is het feit dat de chips gemakkelijk kunnen worden geregenereerd door plasma-as. Op deze manier kan een typische chip tientallen keren worden gebruikt. Biofunctionaliseringsdetails moeten worden aangepast voor de specifieke toepassing. Het hier gepresenteerde protocol conjugated het oppervlak met relatief kleine c-myc-peptideliganden. Grotere liganden zoals hele antilichamen vereisen doorgaans meer ruimte en dus een hogere SPO naar SPN/SPC-verhouding. Ongeacht, een goed gevormde SAM-laag is essentieel voor het voorkomen van niet-specifieke binding in live-celexperimenten. In het algemeen worden grotere moleculaire gewichtsanalysen gemakkelijker gedetecteerd door LSPR. Dus, in zijn enkele-cel manifestatie, kan deze techniek niet geschikt zijn voor het detecteren van de secretie van kleine eiwitten, zoals cytokines.

De huidige opstelling is gebruikt voor het bestuderen van individuele niet-adherente cellen. Er zijn een significant aantal uitgescheiden signaalproteïnen en vesiculen waarop de resultaten die in dit werk worden gerapporteerd direct van toepassing zijn. Bijvoorbeeld carcino-embryonaal antigeen (CEA) dat al tientallen jaren een diagnostisch marker voor kanker is. Colonkankercellen zijn bekend om CEA uit te scheiden met snelheden van duizenden moleculen/cel/uur en het moleculaire gewicht is 180 kDa wat dat van IgG-antilichamen overschrijdt. CEA wordt geacht betrokken te zijn bij autocriene en paracriene signaalroutes, maar de ruimte-tijdelijke aard van deze secreties is nooit gemeten. Onze techniek kan deze signaalvragen direct aanpakken. Een verlenging van dit werk zal zijn om de ruimte-tijdelijke aard van CEA-secretie van enkele cellen te meten.33 Toekomstig werk zal zich ook richten op het integreren van LSPRi met twee- en driedimensionale celculturen van adherante cellen. Door multiplexed arrays te incorporeren die in staat zijn een aantal uitgescheiden proteïnen parallel te detecteren, heeft deze techniek het potentieel om een nieuw venster te openen in celsecreties en hoe ze nabije cellen beïnvloeden.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We bedanken George Anderson voor zijn nuttige opmerkingen en discussies. Dit werk werd ondersteund door het Naval Research Laboratory’s Institute for Nanoscience en de National Research Council Research Associateship Award.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
25 mm diameter glass coverslipsBioscience Tools CSHP-No1.5-25  170±5 µm is optimaal
Poly-methyl methacrylateMicrochemPMMA 950 A4
Ethyl lactate methyl metacrylateMicrochemMMA EL6
Electron beam evaporatorTemescalFC-2000
Electron beam lithographyRaithSeries 150
EthanolSigma-Aldrich459836
AcetoneSigma-Aldrich320110
CR-7 chromium etchantCyantekCR-7
Scanning electron microscopeZeissUltra 55
Atomic force microscopeVeecoNanoscope III
Plasma ashing systemTechnicsSeries 85 RIE
SH-(CH2)8-EG3-OH (SPO)ProchimiaTH 001-m8.n3-0.2
SH-(CH2)11-EG3-COOH (SPC)ProchimiaTH 003m11n3-0.1
SH-(CH2)11-EG3-NH2 (SPN)ProchimiaTH 002-m11.n3-0.2
Surface plasmon resonance systemBioradXPR36
Bare gold chipBioradGLC chipPlasma ashed om de monolaag te verwijderen
1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimideThermo22980
N-hydroxysuccinimide (NHS)Thermo24510
Pentylamine-Biotin     Thermo21345
EthanolamineSigma-AldrichE9508
NeutraavidinThermo31000
Phosphate buffered salineThermo28374
Tween 20Sigma-AldrichP2287
Inverted microscopeZeissAxio ObserverMicroscope is uitgerust met 40X olie-immersie objectief; CO2 en vochtigheid incubatie van Pecon GmbH
CCD cameraHamamatsuOrca R2Thermo-elektrisch gekoeld (16 bit)
SpectrometerOcean OpticsQE65Pro
SpectrasuiteOcean Opticsversion1.4
c-myc peptide HyNic TagSolulinkSP-E003
monoclonal anti-c-myc antibodySigma-AldrichM4439
Hybridoma cell lineATCCCRL-1729
Antibiotic Antimycotic Solution (100×)Sigma-AldrichA5955
Serum free media RPMI 1640 Invitrogen 11835-030 
Fetal bovine serumATCC30-2020
Rhodamine DHPELife TechnologiesL-1392

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ludwig, A. -K., Giebel, B. Exosomes: Small vesicles participating in intercellular communication. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 44, 11-15 (2012).
  2. Friedl, P., Gilmour, D. Collective cell migration in morphogenesis, regeneration and cancer. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10, 445-457 (2009).
  3. Letterio, J. J., Roberts, A. B. Regulation of immune responses by TGF-beta. Annual Review of Immunology. 16, 137-161 (1998).
  4. Werner, S., Grose, R. Regulation of wound healing by growth factors and cytokines. Physiological Reviews. 83, 835-870 (2003).
  5. Werner, S., Krieg, T., Smola, H. Keratinocyte-fibroblast interactions in wound healing. Journal of Investigative Dermatology. 127, 998-1008 (2007).
  6. Bailey, R. C., Kwong, G. A., Radu, C. G., Witte, O. N., Heath, J. R. DNA-encoded antibody libraries: A unified platform for multiplexed cell sorting and detection of genes and proteins. Journal of the American Chemical Society. 129, 1959-1967 (2007).
  7. Gazagne, A., et al. A Fluorospot assay to detect single T lymphocytes simultaneously producing multiple cytokines. Journal of Immunological Methods. 283, 91-98 (2003).
  8. Han, Q., et al. Polyfunctional responses by human T cells result from sequential release of cytokines. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 1607-1612 (2012).
  9. Han, Q., Bradshaw, E. M., Nilsson, B., Hafler, D. A., Love, J. C. Multidimensional analysis of the frequencies and rates of cytokine secretion from single cells by quantitative microengraving. Lab on a Chip. 10, 1391-1400 (2010).
  10. Ma, C., et al. A clinical microchip for evaluation of single immune cells reveals high functional heterogeneity in phenotypically similar T cells. Nature Medicine. 17, 738-743 (2011).
  11. Shirasaki, Y., et al. Real-time single-cell imaging of protein secretion. Scientific Reports. 4, (2014).
  12. Milgram, S., et al. On chip real time monitoring of B-cells hybridoma secretion of immunoglobulin. Biosensors and Bioelectronics. 26, 2728-2732 (2011).
  13. Abbas, A., Linman, M. J., Cheng, Q. A. New trends in instrumental design for surface plasmon resonance-based biosensors. Biosensors & Bioelectronics. 26, 1815-1824 (2011).
  14. Ermakova, A., et al. Detection of a Few Metallo-Protein Molecules Using Color Centers in Nanodiamonds. Nano Letters. 13, 3305-3309 (2013).
  15. Haes, A. J., Van Duyne, R. P. A nanoscale optical blosensor: Sensitivity and selectivity of an approach based on the localized surface plasmon resonance spectroscopy of triangular silver nanoparticles. Journal of the American Chemical Society. 124, 10596-10604 (2002).
  16. Horowitz, V. R., Aleman, B. J., Christle, D. J., Cleland, A. N., Awschalom, D. D. Electron spin resonance of nitrogen-vacancy centers in optically trapped nanodiamonds. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 13493-13497 (2012).
  17. Sepulveda, B., Angelome, P. C., Lechuga, L. M., Liz-Marzan, L. M. LSPR-based nanobiosensors. Nano Today. 4, 244-251 (2009).
  18. Barbillon, G., et al. Biological and chemical gold nanosensors based on localized surface plasmon resonance. Gold Bulletin. 40, 240-244 (2007).
  19. Endo, T., et al. Multiple label-free detection of antigen-antibody reaction using localized surface plasmon resonance-based core-shell structured nanoparticle layer nanochip. Analytical Chemistry. 78, 6465-6475 (2006).
  20. Endo, T., Kerman, K., Nagatani, N., Takamura, Y., Tamiya, E. Label-free detection of peptide nucleic acid-DNA hybridization using localized surface plasmon resonance based optical biosensor. Analytical Chemistry. 77, 6976-6984 (2005).
  21. Haes, A. J., Hall, W. P., Chang, L., Klein, W. L., Van Duyne, R. P. A localized surface plasmon resonance biosensor: First steps toward an assay for Alzheimer's disease. Nano Letters. 4, 1029-1034 (2004).
  22. Jonsson, M. P., Jonsson, P., Dahlin, A. B., Hook, F. Supported lipid bilayer formation and lipid-membrane-mediated biorecognition reactions studied with a new nanoplasmonic sensor template. Nano Letters. 7, 3462-3468 (2007).
  23. Park, J. H., et al. A regeneratable, label-free, localized surface plasmon resonance (LSPR) aptasensor for the detection of ochratoxin A. Biosensors & Bioelectronics. 59, 321-327 (2014).
  24. Mayer, K. M., Hao, F., Lee, S., Nordlander, P., Hafner, J. H. A single molecule immunoassay by localized surface plasmon resonance. Nanotechnology. 21, (2010).
  25. Endo, T., Yamamura, S., Kerman, K., Tamiya, E. Label-free cell-based assay using localized surface plasmon resonance biosensor. Analytica Chimica Acta. 614, 182-189 (2008).
  26. Huang, Y. X., Cai, D., Chen, P. Micro- and Nanotechnologies for Study of Cell Secretion. Analytical Chemistry. 83, 4393-4406 (2011).
  27. Oh, B. R., et al. Integrated Nanoplasmonic Sensing for Cellular Functional Immunoanalysis Using Human Blood. ACS Nano. 8, 2667-2676 (2014).
  28. Raphael, M. P., Christodoulides, J. A., Delehanty, J. B., Long, J. P., Byers, J. M. Quantitative Imaging of Protein Secretions from Single Cells in Real Time. Biophysical Journal. 105, 602-608 (2013).
  29. Raphael, M. P., et al. A New Methodology for Quantitative LSPR Biosensing and Imaging. Analytical Chemistry. 84, 1367-1373 (2011).
  30. Raphael, M. P., et al. Quantitative LSPR imaging for biosensing with single nanostructure resolution. Biophysical Journal. 104, 30-36 (2013).
  31. Raphael, M. P., et al. A new methodology for quantitative LSPR biosensing and imaging. Analytical Chemistry. 84, 1367-1373 (2012).
  32. Henn, A. D., et al. Modulation of single-cell IgG secretion frequency and rates in human memory B cells by CpG DNA, CD40L, IL-21, and cell division. Journal of Immunology. 183, 3177-3187 (2009).
  33. Bramswig, K. H., et al. Soluble Carcinoembryonic Antigen Activates Endothelial Cells and Tumor Angiogenesis. Cancer Research. 73, 6584-6596 (2013).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Gelokaliseerde oppervlakteplasmonresonantie imagingLSPRi technologiegouden plasmonische nanosensorenzelfgeassembleerde monolaagligandfunctionaliseringmicroflu dische integratieruimtelijk temporele mappingdetectie van eiwitsecretie

Gerelateerde artikelen