Methodenartikel

Early Viral Entry testsystemen voor de identificatie en evaluatie van antivirale verbindingen

31.1K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/53124

⸱

29 oktober 2015

 ,  ,  ,  , 
1Department of Chinese Medicine, Taipei Medical University Hospital, 2Department of Obstetrics and Gynecology, School of Medicine, College of Medicine, Taipei Medical University, 3Department of Microbiology and Immunology, School of Medicine, College of Medicine, Taipei Medical University, 4Division of Hematology and Oncology, Department of Internal Medicine, Taipei Medical University Hospital, 5Department of Internal Medicine, School of Medicine, College of Medicine, Taipei Medical University, 6Graduate Institute of Medical Sciences, College of Medicine, Taipei Medical University

In dit artikel

Samenvatting

Hier presenteren we een protocol dat specifieke stappen van de virale binnenkomst onderzoekt om nieuwe antivirale middelen te identificeren en te evalueren.

Samenvatting

Celgebaseerde systemen zijn nuttig voor het ontdekken van antivirale middelen. Het dissecteren van de virale levenscyclus, met name de vroege entreestadia, maakt een mechanistische benadering mogelijk om antivirale middelen te identificeren en evalueren die zich richten op specifieke stappen van de virale entree. In dit rapport worden de methoden voor het onderzoeken van virale inactivering, virale hechting en virale entree/fusie als antivirale assays voor dergelijke doeleinden beschreven, waarbij hepatitis C-virus als model wordt gebruikt. Deze assays zouden nuttig moeten zijn voor het ontdekken van nieuwe antagonisten/remmers voor vroege virale entree en helpen om de reikwijdte van kandidaat-antivirale middelen voor verdere medicijnontwikkeling uit te breiden.

Inleiding

Virale infecties vormen een constante bedreiging voor de volksgezondheid en een belangrijke oorzaak van epidemische ziekten, morbiditeit en sterfgevallen wereldwijd. Specifieke controlemethoden tegen virale infecties omvatten vaccinontwikkeling en antivirale therapieën. Terwijl vaccininspanningen succesvol zijn gebleken bij het immuniseren tegen verschillende virussen, blijven veel virale pathogenen zonder beschermend vaccin, waaronder denguevirus (DENV), humaan cytomegalovirus (HCMV), hepatitis C-virus (HCV), humaan immunodeficiëntievirus (HIV) en respiratoir syncytieel virus (RSV)1-5. Antivirale middelen spelen daarentegen een belangrijke rol bij de behandeling van deze virale infecties wanneer profylactische vaccins niet beschikbaar zijn. Tot op heden zijn er echter slechts weinig goedgekeurde en kosteneffectieve antivirale geneesmiddelen beschikbaar in vergelijking met het aantal virale pathogenen dat de volksgezondheid bedreigt. Belangrijker nog, door een toename in wereldwijde reizen en snelle urbanisatie, wordt de situatie verergerd door de risico's van epidemische uitbraken van opkomende/opnieuw opkomende virale infecties die worden geïntroduceerd in niet-inheemse gebieden6. Recente uitbraken veroorzaakt door het ernstige acute respiratoire syndroom (SARS) virus, influenzavirussen (H1N1, H5N1, H3N2 en H7N9), DENV, West-Nijlvirus (WNV), mazelenvirus (MV), Midden-Oosten respiratoir syndroom (MERS) virus en Ebolavirus6-12 zijn enkele voorbeelden die de noodzaak van ontwikkeling van antivirale middelen weerspiegelen wanneer immunisatie en/of therapieën niet beschikbaar zijn. Bovendien is er altijd een potentieel risico op het genereren van geneesmiddelresistente infecties met momenteel gebruikte antivirale middelen. Daarom is de continue ontwikkeling en uitbreiding van het bereik van antivirale middelen voor deze opkomende/opnieuw opkomende virale infecties noodzakelijk om betere beheerstrategieën te bieden en de volksgezondheid te beschermen.

De meeste antivirale therapieën bestaan uit direct werkende antivirale middelen (DAA's) die zich richten op een specifiek virologisch eiwit of cofactor dat belangrijke stappen in de virale levenscyclus mediëert. Bijvoorbeeld, het nucleoside-analoog Acyclovir remt herpesvirus DNA-polymerase, proteaseremmers Boceprevir en Telaprevir antagoniseren de HCV NS3, en Oseltamivir en Zanamivir zijn neuraminidaseremmers die de afgifte van influenzavirusdeeltjes uit geïnfecteerde cellen blokkeren13-15. Er zijn echter zeer weinig goedgekeurde virale toegangsremmers, inclusief Enfuvirtide, dat zich richt op HIV gp41 om fusie te voorkomen, en Maraviroc, dat het HIV co-receptor CCR5 blokkeert, waardoor virale toegang wordt voorkomen16. Het verkennen van nieuwe antagonisten/remmers voor virale toegang zou kunnen helpen bij het leveren van aanvullende therapeutischa voor profylactisch of therapeutisch gebruik, zoals in combinatie met andere antivirale middelen met een ander werkingsmechanisme om virale infecties beter te behandelen17-19.

Identificatie van antivirale middelen kan structureel begeleide geneesmiddelontwikkeling en op screening gebaseerde strategie voor kandidaat-geneesmiddelen omvatten. Methoden voor het beoordelen van de antivirale activiteit van testmiddelen omvatten biochemische assays van enzymatische activiteit en evaluatie door celgebaseerde systemen20-23. In celgebaseerde systemen kan de virale levenscyclus worden ontleed in verschillende stadia van infectie, zoals toegangsgebeurtenissen (aanhechting, fusie, ontsluiting), de replicatiefase (virale genoomreplicatie en eiwittranslatie) en virionuittreding (assemblage, rijping en afgifte). Omdat de assays kunnen worden aangepast om elk specifiek stadium te onderzoeken met behulp van verschillende hulpmiddelen en methoden, maakt deze aanpak de identificatie/onderzoek mogelijk van potentiële kandidaat-antivirale middelen met een specifiek werkingsmechanisme dat zich richt op het specifieke stadium dat wordt geanalyseerd. Om bijvoorbeeld het effect van geneesmiddelen specifiek op de vrije virusdeeltjes vóór binding aan de gastheercel te analyseren, kan een 'virale inactiveringstest' worden uitgevoerd. In deze test wordt het virus toegestaan om te incuberen met het testgeneesmiddel en vervolgens verdund om het geneesmiddel te titeren voordat het een celmonolaag infecteert. Aanvullende stappen zoals virale aanhechting en entree/fusiestadia kunnen ook afzonderlijk worden geanalyseerd, door de temperatuur tijdens de infectie te veranderen. Voor veel omhulde virussen wordt virale entree/fusie aan het gastheercelmembraan sterk vergemakkelijkt bij 37 °C, maar wordt meestal voorkomen bij 4 °C, wat de virusbinding niet beïnvloedt24-29. Ten slotte zou het gebruik van reportervirussen of celsystemen deze studies kunnen vergemakkelijken en een hoogdoorvoeranalyse mogelijk maken.

We hebben eerder de celgebaseerde aanpak toegepast en de vroege entree van verschillende omhulde virussen ontleed voor de onderzoek van antivirale verbindingen die mogelijk virale toegang antagoniseren30,31. Hierin worden de verschillende gebruikte methoden beschreven, waaronder virale inactivering, virale aanhechting en virale entree/fusie-assays.

Protocol

Let op: Zorg ervoor dat alle procedures waarbij celcultuur en virusinfectie worden uitgevoerd in gecertificeerde bioveiligheid kappen, dat geschikt is voor de bioveiligheid niveau van de monsters worden behandeld zijn. Voor het beschrijven van de protocollen wordt Gaussia luciferase reporter-gelabeld HCV als model virus 32. In het kader van de representatieve resultaten zijn de verbindingen chebulagic acid (ChLA) en punicalagin (PUG) worden gebruikt als kandidaat antivirale middelen die virale glycoproteïne interacties met celoppervlak glycosaminoglycanen richten tijdens de vroege virale binnenkomst stap 31. Heparine, waarvan bekend is te interfereren met de komst van veel virussen 30,31,33,34, wordt gebruikt als een positieve controlebehandeling in dergelijke context. Voor eenvoudige achtergrond op virologie technieken, verspreiding van virussen, bepaling van de virustiter, en expressie van infectieuze dosis in plaque-vormende eenheden (PFU), richten eenheden (FFU), of een veelvoud van infectie (MOI), de lezer is redoeld referentie 35. Voorafgaande voorbeelden en geoptimaliseerde omstandigheden voor virussen in de representatieve resultaten wordt verwezen naar referenties 30-32,36-39 alsmede gegevens in tabel 1, figuur 1A en figuur 2A weergegeven.

1. Cel Cultuur, Compound Voorbereiding en Compound cytotoxiciteit

  1. Groeien de respectievelijke cellijn voor virusinfectie systeem te analyseren (tabel 1). Voor HCV, groeit de Huh-7,5-cellen in Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium (DMEM) aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS), 200 U / ml penicilline G, 200 ug / ml streptomycine, en 0,5 ug / ml amfotericine B.
  2. Bereid de testverbindingen en controles met behulp van hun respectievelijke oplosmiddelen: bijvoorbeeld oplossen ChLA en PUG in dimethylsulfoxide (DMSO); heparine bereiden in steriel dubbel gedestilleerd water. Voor alle volgende verdunningen, gebruiken cultuur media.
    Opmerking: De laatste concentrantsoen van DMSO in de test verbinding behandelingen minder dan 1% in de experimenten; 1% DMSO wordt opgenomen als een negatieve controle behandeling in de assays voor vergelijking.
  3. Bepaal de cytotoxiciteit van de testverbindingen (bijv ChLA en PUG) op de cellen van de virale infectie door een cellevensvatbaarheid bepalen reagens zoals XTT (2,3-bis [2-methoxy-4-nitro-5-sulfofenyl] -5-fenylamino) carbonyl] -2H-tetrazolium hydroxide):
    1. Voor HCV, zaad Huh-7,5-cellen in een 96-putjes plaat (1 x 10 4 cellen per putje) en incubeer bij 37 ° C in een 5% CO2 incubator O / N om een monolaag te verkrijgen.
    2. Breng DMSO control (1%) en toenemende concentraties van de testverbindingen ChLA en PUG (ex. 0, 10, 50, 100 en 500 uM) aan de kweekputjes in drievoud.
    3. Incubeer bij 37 ° C gedurende 72 uur, vervolgens het medium in de plaat weggooien en was de cellen met 200 ul fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) tweemaal.
    4. Voeg 100 ul van assaying oplossing van de XTT-gebaseerde in vitro toxicologie assay kit aan elk putje en incubeer de platen bij 37 ° C gedurende nog 3 uur tot XTT laten formazanproductie.
    5. Bepaal de absorptie met een microplaat reader bij een test golflengte van 492 nm en een referentie golflengte van 690 nm.
    6. Bereken het percentage overlevende cellen met de volgende formule: levensvatbaarheid van de cellen (%) = At ​​/ Al x 100%, waarbij "in" en "Al" naar de absorptie van de testverbindingen en oplosmiddelcontrole (ex 1% DMSO. ) behandelingen, respectievelijk. Bepaal de concentratie van 50% cellulaire cytotoxiciteit (CC50) van de testverbindingen in analytisch software zoals GraphPad Prism volgens het protocol van de fabrikant.

2. Uitlezing van virale infectie

Opmerking: Het uitlezen van virale infectie is afhankelijk van het virus wordt gebruikt en kunnen werkwijzen zoals plaque assays of mea betrekkensuring reporter signalen van reporter-gelabeld virussen. Werkwijze voor het detecteren van reporter-HCV-infectie op basis van het luciferase reporter-activiteit wordt hieronder beschreven.

  1. Verzamel de supernatanten van de geïnfecteerde putjes en verduidelijkt bij 17.000 xg in een microcentrifuge gedurende 5 minuten bij 4 ° C.
  2. Meng 20 pl supernatant proef 50 ui luciferase substraat tegen de Gaussia luciferase assay kit en direct te meten met een luminometer volgens de instructies van de fabrikant.
  3. Express HCV infectiviteit als log 10 relatieve lichteenheden (RLU) voor het bepalen van virale remming (%) en bereken de 50% effectieve concentratie (EC50) van de testverbindingen tegen HCV-infectie via algoritmen van GraphPad Prism software volgens het protocol van de fabrikant.

3. Viral Inactivering Assay

Opmerking: Voorbeelden van incubatieperiode en virale dosis voor verschillende virussen eenre weergegeven in figuur 1A. Hogere concentraties van het virus kan ook getest worden door verhoging van de MOI / PFU.

  1. Seed Huh-7,5-cellen in een 96-putjes plaat (1 x 10 4 cellen per putje) en incubeer bij 37 ° C in een 5% CO2 incubator O / N om een monolaag te verkrijgen.
  2. Incubeer de test verbindingen of controles (uiteindelijke concentraties zijn: ChLA = 50 uM; PUG = 50 uM; heparine = 1000 ug / ml; DMSO = 1%) met het HCV-deeltjes bij 37 ° C (Figuur 1A, 'Long-Term' ) in een 1: 1 ratio. Bijvoorbeeld, een 100 ul virus inoculum bevattende 1 x 10 4 FFU, voeg 100 ul van een 100 uM ChLA werkverdunning; Dit levert ChLA behandeling bij een uiteindelijke concentratie van 50 uM.
  3. Verdun de virus-drug mengsel "subtherapeutische" (effectief) concentratie van de testverbindingen. Bijvoorbeeld, de ineffectieve concentratie ChLA en PUG tegen HCV is 1 uM 31; daaromDit vereist een 50-voudige verdunning van het virus-drug mengsel dat kan worden bereikt met 9,8 ml basismedium (celcultuur medium met 2% FBS).
    Opmerking: De verdunning tot subtherapeutische concentraties voorkomt significante interactie tussen de proefverbindingen en de gastheercel oppervlak en maakt onderzoek behandelingseffect op het celvrije virions. Merk op dat deze verdunning is afhankelijk van de antivirale dosis respons van de testverbindingen tegen de specifieke virale infectie, en voor het uitvoeren van deze specifieke test 31 bepaald.
  4. Ter vergelijking, meng het virus met de test verbindingen en onmiddellijk te verdunnen (geen incubatietijd) tot sub-therapeutische concentratie voorafgaand aan de infectie (Figuur 1A, 'korte termijn').
  5. Voeg 100 ul van de verdunde HCV-geneesmiddelmengsel op de Huh-7,5 celmonolaag (de hoeveelheid virus is nu 1 x 10 2 FFU; uiteindelijke MOI = 0,01) en incubeer gedurende 3 uur bij 37 ° C om virale toestaanadsorptie.
  6. Naar aanleiding van de infectie, verwijder de verdunde inocula en voorzichtig wassen van de putjes met 200 pl PBS tweemaal.
    Opmerking: Voer het wassen voorzichtig opheffen van de cellen te voorkomen.
  7. Breng 100 pi basaal medium aan elk putje en incubeer bij 37 ° C gedurende 72 uur.
  8. Analyseer de resulterende infectie door testen van het supernatans van luciferaseactiviteit zoals beschreven in "2. Uitlezing van de virale infectie '.

4. Viral Attachment Assay

Opmerking: Voorbeelden van incubatieperiode en virale dosis voor verschillende virussen zijn opgenomen in figuur 2A, 'Bijlage'. Hogere concentraties van het virus kan ook getest worden door verhoging van de MOI / PFU.

  1. Seed Huh-7,5-cellen in een 96-putjes plaat (1 x 10 4 cellen per putje) en incubeer bij 37 ° C in een 5% CO2 incubator O / N om een monolaag te verkrijgen.
  2. Pre-chill de celmonolagen in platen bij 4 ° C for 1 uur.
  3. Co-behandeling van de cellen met HCV inoculum (MOI = 0,01) en testverbindingen en controles (uiteindelijke concentraties: ChLA = 50 uM; PUG = 50 uM; heparine = 1000 ug / ml; DMSO = 1%) bij 4 ° C gedurende 3 hr. Bijvoorbeeld, een 90 ul virus inoculum bevattende 1 x 10 2 FFU, voeg 10 ul van een 500 uM ChLA werkverdunning; Dit levert ChLA behandeling bij een uiteindelijke concentratie van 50 uM en een infectie met HCV bij MOI = 0,01 op de cel monolaag.
    Opmerking: Het is belangrijk om het experiment uit te voeren bij 4 ° C heeft, aangezien het virus binden maar uitsluit ingang die het meest efficiënt optreedt bij 37 ° C. Voer de toevoeging van virus en testverbindingen op ijs en de daaropvolgende incubatie op 4 ° C koelkast zodat de temperatuur op 4 ° C.
  4. Verwijder het supernatant en voorzichtig wassen van de monolaag met 200 ul ijskoude PBS tweemaal.
    Opmerking: Voer het wassen voorzichtig opheffen van de cellen te voorkomen <./ li>
  5. Breng 100 pi basaal medium aan elk putje en incubeer bij 37 ° C gedurende 72 uur.
  6. Analyseer de resulterende infectie door testen van het supernatans van luciferaseactiviteit zoals beschreven in "2. Uitlezing van de virale infectie '.

5. Virale Entry / Fusion Assay

Opmerking: Voorbeeld van de incubatietijd en virale dosis voor verschillende virussen worden in figuur 2A 'Entry / Fusion' genoemd. Hogere concentraties van het virus kan ook getest worden door verhoging van de MOI / PFU.

  1. Seed Huh-7,5-cellen in een 96-putjes plaat (1 x 10 4 cellen per putje) en incubeer bij 37 ° C in een 5% CO2 incubator O / N om een monolaag te verkrijgen.
  2. Pre-chill de cel monolagen in platen bij 4 ° C gedurende 1 uur.
  3. Infecteren de cellen met HCV (MOI = 0,01) bij 4 ° C gedurende 3 uur. Gebruik bijvoorbeeld een 100 ul virusinoculum met 1 x 10 2 FFU.
    Opmerking: Voer de additie van het virale inoculum op ijs en de daaropvolgende incubatie op 4 ° C koelkast de temperatuur op 4 ° C, waarbij de virale binding, maar niet inreisvergunningen handhaven.
  4. Verwijder het supernatant en voorzichtig wassen van de cel monolagen met 200 ul ijskoude PBS tweemaal.
    Opmerking: Voer het wassen voorzichtig opheffen van de cellen te voorkomen.
  5. Behandel de putjes met de testverbindingen en controles (uiteindelijke concentraties: ChLA = 50 uM; PUG = 50 uM; heparine = 1000 ug / ml; = 1% DMSO) en incubeer bij 37 ° C gedurende 3 uur. Bijvoorbeeld, voeg 10 ul van een 500 uM ChLA werkverdunning tot 90 ul van de media, mengen, en behandel de putten; Dit levert ChLA behandeling bij een uiteindelijke concentratie van 50 uM.
    Opmerking: De verschuiving van 4 ° C tot 37 ° C maakt nu het virale entry / samensmelting en maakt derhalve de beoordeling van het effect testverbindingen 'op deze bepaalde stap.
  6. Zuig het geneesmiddel-bevattende supernatant en verwijder niet-geïnternaliseerdeextracellulaire virussen door ofwel wassen met 200 gl citraat buffer (50 mM natriumcitraat, 4 mM kaliumchloride, pH 3,0) of PBS. Breng 100 pi van het basismedium vóór incubatie bij 37 ° C gedurende 72 uur.
  7. Analyseer de resulterende infectie door testen van het supernatans van luciferaseactiviteit zoals beschreven in "2. Uitlezing van de virale infectie '.

Resultaten

In figuur 1 is de "virale inactivatie assay werd uitgevoerd om te onderzoeken of twee specifieke natuurlijke verbindingen ChLA en PUG verschillende omhulde virussen in celvrije toestand kunnen inactiveren en voorkomen daaropvolgende infectie. De cytotoxiciteit en antivirale dosis-respons van deze verbindingen zijn voor het uitvoeren van de mechanistische studie 31 bepaald. De virussen werden voorbehandeld met testverbindingen en vervolgens de virus-drug mengsels werden verdund tot subtherapeutische concentraties voor enting op de betreffende cel monolaag per virussysteem. Zoals getoond in figuur 1, zowel ChLA en PUG bleek interactie met de celvrije virions, wat resulteert in onomkeerbare effecten die de cel monolaag beschermd tegen daaropvolgende infectie. De twee test-verbindingen bereikt een bijna 100% remming tegen HCMV, HCV en DENV-2, terwijl een 60-80% blok werd waargenomen tegen MV en RSV. Deze resultaten Suggest dat ChLA en PUG hebben directe invloed op deze vrije virusdeeltjes door het inactiveren van hen en het neutraliseren van hun besmettelijkheid.

In figuur 2, de bevestiging en invoer / fusion assays werden uitgevoerd om het effect van ChLA en PUG staand tegen deze vroege virale binnenkomst gerelateerde gebeurtenissen van HCMV, HCV, DENV-2, MV en RSV. Zowel ChLA en PUG effectief voorkomen binding van de onderzochte virussen op de respectieve gastheercel zoals door remming op de resulterende virale infectie (figuur 2, 'Bijlage': licht grijze balken). Het remmende effect op virus attachment door beide verbindingen was vergelijkbaar met HCMV (figuur 2B), HCV (figuur 2C), DENV-2 (Figuur 2D) en RSV (figuur 2F), variërend van 90 - 100%. Anderzijds, PUG bleek effectiever dan ChLA tegen MV binding (figuur 2E) te zijn, waarbij de remming vanaf de two verbindingen variëren tussen 50 - 80%. De controlebehandeling heparine, waarvan bekend is dat de instroming van veel virussen, remde ook de bevestiging van HCMV, DENV-2, RSV, ad MV blokkeren, maar was minder efficiënt tegen HCV. De daaruit voortvloeiende 'viral entry / fusion-test' onderzocht of ChLA en PUG behielden hun activiteit tijdens het virus entry / fusion fase (figuur 2, 'Entry / Fusion': donker grijze balken). Pas wanneer beide ChLA en PUG waargenomen effectief beïnvloeden het virale entry / smelttrap van de onderzochte virussen (Figuur 2B - F), waarbij een 50 - 90% beschermend effect op de respectievelijke cel monolaag. Heparine ook krachtig geremd invoer / fusion in DENV-2 en RSV-infecties, maar was minder effectief tegen HCMV, HCV, en MV (<40% remming gemiddeld).

Virus Cel Type
HCMV HEL
HCV Huh-7.5
DENV-2 Vero
MV CHO-SLAM
RSV HEp-2

Tabel 1:. Gastheercel type voor virusinfectie Het gebruikte celtype voor elk viraal infectiesysteem in de representatieve resultaten beschreven aangegeven. Verdere details met betrekking tot de cellen zijn te vinden in referentie 31.

figure-results-1
Figuur 1. Inactivatie van virale infecties door de testverbindingen ChLA en PUG Verschillende virussen werden behandeld met de testverbindingen gedurende een lange periode. (Gedurende 1,5 - 3 uur voor titratie lichtgrijze staven) of korte (direct verdund; donkergrijs bars) bij 37 ° C bij een verdunning tot subtherapeutische concentratiestie en daaropvolgende analyse van besmetting van de respectieve gastheercellen. (A) Schema van het experiment (links getoond) met de laatste virusconcentratie (PFU / well of MOI), langdurige virus-drug incubatieperiode (i), en daaropvolgende incubatietijd (ii) aangegeven voor elk virus in de tabel rechts. Analyses voor (B) HCMV, (C) HCV, (D) DENV-2, (E) MV, en (F) RSV worden in elke extra paneel. De resultaten worden uitgezet tegen de DMSO negatieve controle behandeling van virusinfecties en de getoonde data zijn gemiddelden ± standaardfouten van het gemiddelde (SEM) van drie onafhankelijke experimenten. Dit cijfer is aangepast uit referentie 31. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2. Evaluatie van antivirale activiteiten van de testverbindingen ChLA en PUG tegen virussen bevestiging en invoer / fusion. (A) De experimentele procedure virusconcentratie (PFU / well of MOI) en het tijdstip van toevoeging en behandeling met testverbindingen (i, ii, iii) worden voor elk virus in de schema's en de bijbehorende tabellen. In virus attachment analyse (lichtgrijze staven), monolagen van verschillende celtypes was voorgekoeld bij 4 ° C gedurende 1 uur, vervolgens co-behandeling met deze virussen en testverbindingen bij 4 ° C (1,5 - 3 uur; i) voor het wassen van de ent en de testverbindingen voor daaropvolgende incubatie (37 ° C, ii) en onderzoek van virusinfectie. In virusingang / fusion analyse (donker grijze balken), geënte celmonolagen waren voorgekoeld bij 4 ° C gedurende 1 uur en daarna geprikkeld met deze virussen bij 4 ° C gedurende 1,5 - 3 uur (i). Cellen werden vervolgensgewassen en behandeld met de testverbindingen tegen incubatieperiode (ii) waarbij de temperatuur werd verschoven naar 37 ° C om het virale entry / samensmelting vergemakkelijken. Aan het einde van de incubatie werden extracellulaire virussen verwijderd door een citraatbuffer (pH 3,0) of PBS wast en de cellen werden verder geïncubeerd (iii) voor de analyse van virusinfectie. Resultaten voor (B) HCMV, (C) HCV, (D) DENV-2, (E) MV, en (F) RSV worden in elke extra paneel. Gegevens worden uitgezet tegen de DMSO negatieve controle behandeling van virusinfecties en worden weergegeven als het gemiddelde ± SEM van drie onafhankelijke experimenten. Dit cijfer is aangepast uit referentie 31. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

In dit rapport werden de methoden beschreven om antivirale verbindingen te identificeren en evalueren op basis van een mechanistische benadering van het ontleden van de vroege virale binnenkomstgebeurtenissen. Specifiek maakten de assays het mogelijk om het effect van testverbindingen op vrije virusdeeltjes, virale binding en virale binnenkomst/fusie te onderzoeken. Kritische stappen werden geïmplementeerd om het effect van het medicijn op de specifieke fase van de vroege virale binnenkomst duidelijk te evalueren. Bijvoorbeeld, in de ‘virale inactiveringstest’, voorkomt het verdunnen van het virus-geneesmiddelmengsel tot subtherapeutische concentratie significante interactie tussen de testverbinding en het oppervlak van de gasthercelk door de ‘titratieverwijdering’ van het medicijn. Dit zorgt ervoor dat het remmende effect dat wordt waargenomen op de daaropvolgende infectie van de gasthercelk te wijten is aan een directe interactie tussen de testverbinding en de celvrije virionen, in plaats van een effect van de testverbinding op het gasthercelmembraan of membraangebonden moleculen, inclusief virale receptoren30. Evenzo, de temperatuurverschuiving tussen 4 °C (die virusbinding toestaat maar geen binnenkomst) en 37 °C (die virusbinnenkomst/fusie vergemakkelijkt) in de ‘virale bindingstest’ en ‘virale binnenkomst/fusietest’ zijn cruciaal om het effect van de testverbinding op elk van deze specifieke gebeurtenissen te bepalen. Dit is mogelijk vanwege de temperatuurgevoeligheid van omhulde virussen tijdens deze stappen in de infectie24-29. Het is daarom belangrijk dat de tests worden uitgevoerd bij de aangegeven temperatuur om de nauwkeurigheid van de resultaten te garanderen; bijvoorbeeld door het experiment op ijs uit te voeren om de temperatuur op 4 °C te houden en door het monster direct in een 37 °C incubator te plaatsen voor de temperatuurverschuiving. Bovendien helpt het gebruik van negatieve (bijv. DMSO-oplosmiddel voor de bereiding van geneesmiddelen) en positieve (bijv. heparinebehandeling) controles ook om de nauwkeurigheid van de tests verder te bevestigen. De bruikbaarheid en toepasbaarheid van dergelijke methoden is aangetoond in veel antivirale onderzoeken26,30,31,40,41. Merk op dat heparine, hoewel het als controle is opgenomen voor alle drie de tests in de context van de representatieve resultaten, meestal de initiële virusbinding blokkeert in plaats van de daaropvolgende fusie/binnenkomststap (zoals weerspiegeld door de gegevens in Figuur 2). Er kunnen ook aanvullende controles worden gebruikt, zoals neutraliserende antilichamen gericht tegen het virus (voor virale inactiveringstest), antilichamen die de celoppervlaktereceptoren voor het virus maskeren (voor virale bindingstest) en membraanfusieremmende middelen (voor virale fusie/binnenkomsttest).

De assays die in dit rapport worden beschreven, die specifiek zijn voor de vroege stadia van de virale infectie, zijn nuttig in termen van toepassing als secundaire tests om het werkingsmechanisme van kandidaatgeneesmiddelen uit primaire screeningstests te karakteriseren, die doorgaans breder gericht zijn op de virale infectie. Alternatief kunnen ze ook worden opgenomen in primaire screeningstests als men specifiek op zoek is naar remmers van vroege virale binnenkomst, inclusief virusinactiverende middelen, virale bindingsantagonisten en remmers voor virale binnenkomst/fusie. In dit geval maakt hun gebruik een meer gerichte en nauwkeurige schermanalyse mogelijk voor de identificatie van mechanisme-specifieke antivirale kandidaten, wat op zijn beurt de downstream-geneesmiddelontwikkeling zou versnellen.

Het gebruik van celgebaseerde assays bij het identificeren van antivirale middelen biedt verschillende belangrijke voordelen in vergelijking met biochemische assays, waaronder het onthullen van mogelijke off-targeteffecten (zoals cytotoxiciteit) en het toevoegen van fysiologische relevantie aan de bioactiviteit van de geteste middelen42. Deze kwesties zijn belangrijke overwegingen bij het beslissen of een kandidaatmiddel van waarde is voor voortzetting in volgende fasen van de geneesmiddelontwikkeling. Evenzo, de vroege virale binnenkomstspecifieke assays die in dit rapport worden beschreven, maken onderzoek van het effect van het medicijn op de verschillende virale binnenkomstfase op cellulair niveau mogelijk, en meer specifiek in de context van een authentieke virale infectie in vitro. De resultaten die uit dergelijke assays worden verkregen, zouden daarom helpen de antivirale werkzaamheid van de testverbindingen beter te voorspellen en ook potentieel ongewenste off-targeteffecten tegen de gasthercelk te identificeren. Een potentiële beperking is echter dat een in vitro celgebaseerde assay mogelijk niet volledig de werkelijke in vivo binnenkomststap weerspiegelt in de context van een natuurlijke virale infectie. Desondanks dienen de in dit protocol gepresenteerde assays als een analytisch platform voor mechanisme-gebaseerde identificatie en evaluatie van nieuwe antivirale middelen.

De ontwikkeling van reportervirussen of reportercelsystemen om de hoeveelheid virale infectie te kwantificeren heeft de celgebaseerde screening en evaluatie van antivirale middelen aanzienlijk vergemakkelijkt. Voorbeelden zijn het gebruik van recombinante virussen die een reportergen dragen of door middel van recombinante menselijke cellijnen die een reportergen bevatten dat wordt aangedreven door de specifieke viruspromoter31,43. In dit rapport kan de infectie van luciferase-gelabelde HCV gemakkelijk worden gemonitord door de reporter signaal te kwantificeren, waardoor de gegevensanalyse wordt vergemakkelijkt. Door deze nuttige reporter-gebaseerde hulpmiddelen op te nemen, kunnen de hier beschreven vroege virale binnenkomst assays essentieel worden aangepast in een high-throughput formaat voor mechanisme-gebaseerde screening van kleine molecuulbibliotheken.

Kortom, er werd een protocol beschreven voor assays die de vroege virale binnenkomst ontleden als middel om mechanisme-specifieke antivirale verbindingen te identificeren en evalueren. Dergelijke assays zouden nuttig zijn voor het ontdekken van nieuwe antagonisten/remmers voor virale binnenkomst en zouden helpen de reikwijdte van antivirale middelen voor ontwikkeling als profylactisch en/of therapeutische behandelingen uit te breiden.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat er geen concurrentie-belangen bestaan.

Dankbetuigingen

Deze studie wordt ondersteund door financiering van het Taipei Medical University Hospital (102TMU-TMUH-19) en het Ministerie van Wetenschap en Technologie van Taiwan (MOST103-2320-B-038-031-MY3).

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
DMEMGIBCO11995-040
FBSGIBCO26140-079
Penicillin-StreptomycinGIBCO15070-063
Amphotericin BGIBCO15290-018
DMSOSigmaD5879
In vitro toxicology assay kit, XTT-basedSigmaTOX2
PBS pH 7.4 GIBCO10010023
Microplate readerThermo Scientific89087-320
MicrocentrifugeThermo Scientific75002420
BioLux Gaussia luciferase assay kitNew England BiolabsE3300L   
LuminometerPromegaGloMax-20/20
Sodium citrate, dihydrateSigma71402
Potassium chlorideSigmaP5405

Referenties

  1. Munier, C. M., Andersen, C. R., Kelleher, A. D. HIV vaccines: progress to date. Drugs. 71, 387-414 (2011).
  2. Rothman, A. L. Immunity to dengue virus: a tale of original antigenic sin and tropical cytokine storms. Nat Rev Immunol. 11, 532-543 (2011).
  3. Sung, H., Schleiss, M. R. Update on the current status of cytomegalovirus vaccines. Expert Rev Vaccines. 9, 1303-1314 (2010).
  4. Torresi, J., Johnson, D., Wedemeyer, H. Progress in the development of preventive and therapeutic vaccines for hepatitis C virus. J Hepatol. 54, 1273-1285 (2011).
  5. Wright, M., Piedimonte, G. Respiratory syncytial virus prevention and therapy: past, present, and future. Pediatr Pulmonol. 46, 324-347 (2011).
  6. Christou, L. The global burden of bacterial and viral zoonotic infections. Clin Microbiol Infect. 17, 326-330 (2011).
  7. Cascio, A., Bosilkovski, M., Rodriguez-Morales, A. J., Pappas, G. The socio-ecology of zoonotic infections. Clin Microbiol Infect. 17, 336-342 (2011).
  8. Grais, R. F. Measles vaccination in humanitarian emergencies: a review of recent practice. Confl Health. 5, 21(2011).
  9. Gautret, P. Emerging viral respiratory tract infections-environmental risk factors and transmission. Lancet Infect Dis. 14, 1113-1122 (2014).
  10. Sampathkumar, P. Middle East respiratory syndrome: what clinicians need to know. Mayo Clin Proc. 89, 1153-1158 (2014).
  11. Burd, E. M. Ebola Virus: a Clear and Present Danger. J Clin Microbiol. 53, 4-8 (2015).
  12. Bishop, B. M. Potential and Emerging Treatment Options for Ebola Virus Disease. Ann Pharmacother. , (2014).
  13. Arduino, P. G., Porter, S. R. Oral and perioral herpes simplex virus type 1 (HSV-1) infection: review of its management. Oral Dis. 12, 254-270 (2006).
  14. Mitrasinovic, P. M. Advances in the structure-based design of the influenza A neuraminidase inhibitors. Curr Drug Targets. 11, 315-326 (2010).
  15. Soriano, V. Directly acting antivirals against hepatitis C virus. J Antimicrob Chemother. 66, 1673-1686 (2011).
  16. Haqqani, A. A., Tilton, J. C. Entry inhibitors and their use in the treatment of HIV-1 infection. Antiviral Res. 98, 158-170 (2013).
  17. Melby, T., Westby, M. Inhibitors of viral entry. Handb Exp Pharmacol. , 177-202 (2009).
  18. Vanderlinden, E., Naesens, L. Emerging antiviral strategies to interfere with influenza virus entry. Med Res Rev. 34, 301-339 (2014).
  19. Antoine, T. E., Park, P. J., Shukla, D. Glycoprotein targeted therapeutics: a new era of anti-herpes simplex virus-1 therapeutics. Rev Med Virol. 23, 194-208 (2013).
  20. Pawlotsky, J. M., Chevaliez, S., McHutchison, J. G. The hepatitis C virus life cycle as a target for new antiviral therapies. Gastroenterology. 132, 1979-1998 (2007).
  21. Beyleveld, G., White, K. M., Ayllon, J., Shaw, M. L. New-generation screening assays for the detection of anti-influenza compounds targeting viral and host functions. Antiviral Res. 100, 120-132 (2013).
  22. Kilianski, A., Baker, S. C. Cell-based antiviral screening against coronaviruses: developing virus-specific and broad-spectrum inhibitors. Antiviral Res. 101, 105-112 (2014).
  23. Caillet-Saguy, C., Lim, S. P., Shi, P. Y., Lescar, J., Bressanelli, S. Polymerases of hepatitis C viruses and flaviviruses: structural and mechanistic insights and drug development. Antiviral Res. 105, 8-16 (2014).
  24. Frey, S. Temperature dependence of cell-cell fusion induced by the envelope glycoprotein of human immunodeficiency virus type 1. J Virol. 69, 1462-1472 (1995).
  25. Tscherne, D. M. Time- and temperature-dependent activation of hepatitis C virus for low-pH-triggered entry. J Virol. 80, 1734-1741 (2006).
  26. Madan, R. P. Molecular umbrellas: a novel class of candidate topical microbicides to prevent human immunodeficiency virus and herpes simplex virus infections. J Virol. 81, 7636-7646 (2007).
  27. Haywood, A. M., Boyer, B. P. Time and temperature dependence of influenza virus membrane fusion at neutral pH. J Gen Virol. 67 (Pt 12), 2813-2817 (1986).
  28. Haywood, A. M., Boyer, B. P. Sendai virus membrane fusion: time course and effect of temperature, pH, calcium, and receptor concentration). Biochemistry. 21, 6041-6046 (1982).
  29. Wang, G., Hernandez, R., Weninger, K., Brown, D. T. Infection of cells by Sindbis virus at low temperature. Virology. 362, 461-467 (2007).
  30. Lin, L. T. Hydrolyzable tannins (chebulagic acid and punicalagin) target viral glycoprotein-glycosaminoglycan interactions to inhibit herpes simplex virus 1 entry and cell-to-cell spread. J Virol. 85, 4386-4398 (2011).
  31. Lin, L. T. Broad-spectrum antiviral activity of chebulagic acid and punicalagin against viruses that use glycosaminoglycans for entry. BMC Microbiol. 13, 187(2013).
  32. Marukian, S. Cell culture-produced hepatitis C virus does not infect peripheral blood mononuclear cells. Hepatology. 48, 1843-1850 (2008).
  33. Baba, M., Snoeck, R., Pauwels, R., de Clercq, E. Sulfated polysaccharides are potent and selective inhibitors of various enveloped viruses, including herpes simplex virus, cytomegalovirus, vesicular stomatitis virus, and human immunodeficiency virus. Antimicrob Agents ChemotheR. 32, 1742-1745 (1988).
  34. Barth, H. Cellular binding of hepatitis C virus envelope glycoprotein E2 requires cell surface heparan sulfate. J Biol CheM. 278, 41003-41012 (2003).
  35. Flint, S. J., Enquist, L. W., Racaniello, V. R., Skalka, A. M. Principles of Virology. , 3rd edn, ASM Press. (2008).
  36. Brown, M. G. Dramatic caspase-dependent apoptosis in antibody-enhanced dengue virus infection of human mast cells. J Leukoc Biol. 85, 71-80 (2009).
  37. Huang, Y., Cyr, S. L., Burt, D. S., Anderson, R. Murine host responses to respiratory syncytial virus (RSV) following intranasal administration of a Protollin-adjuvanted, epitope-enhanced recombinant G protein vaccine. J Clin Virol. 44, 287-291 (2009).
  38. Isaacson, M. K., Compton, T. Human cytomegalovirus glycoprotein B is required for virus entry and cell-to-cell spread but not for virion attachment, assembly, or egress. J Virol. 83, 3891-3903 (2009).
  39. Leonard, V. H., et al. Measles virus blind to its epithelial cell receptor remains virulent in rhesus monkeys but cannot cross the airway epithelium and is not shed. J Clin Invest. 118, 2448-2458 (2009).
  40. Ciesek, S. The green tea polyphenol, epigallocatechin-3-gallate, inhibits hepatitis C virus entry. Hepatology. 54, 1947-1955 (2011).
  41. Lin, L. T. Saikosaponin b2 is a naturally occurring terpenoid that efficiently inhibits hepatitis C virus entry. J Hepatol. 62, 541-548 (2015).
  42. Atkins, C., Evans, C. W., White, E. L., Noah, J. W. Screening methods for influenza antiviral drug discovery. Expert Opin Drug Discov. 7, 429-438 (2012).
  43. Zhang, J. Identification of novel virus inhibitors by influenza A virus specific reporter cell based screening. Antiviral Res. 93, 48-54 (2012).

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Hepatitis C virusvirale inactivatievirale aanhechtingvirale fusieluciferase reportercytotoxiciteitstestenincubatie van celculturenwassen met PBS
Early Viral Entry testsystemen voor de identificatie en evaluatie van antivirale verbindingen
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.