Method Article

Ontcijferen en Imaging Pathogenese en Cording van Mycobacterium abscessus In zebravis embryo's

DOI:

10.3791/53130

⸱

September 9th, 2015

 ,  ,  ,  ,  , 
1Dynamique des Interactions Membranaires Normales et Pathologiques, CNRS, UMR 535, Université Montpellier, 2Centre d'études d'agents Pathogènes et Biotechnologies pour la Santé, CNRS, FRE 3689, Université Montpellier, 3Unité de Formation et de Recherche des Sciences de la Santé, EA3647-EPIM, Université Versailles St Quentin

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Optisch transparante zebravis embryo's worden veel gebruikt om in realtime de interacties tussen pathogene micro-organismen en de aangeboren immuuncellen te bestuderen en te visualiseren. Micro-injectie van Mycobacterium abscessus, gecombineerd met fluorescentiebeeldvorming, wordt gebruikt om essentiële pathogene kenmerken zoals koordvorming in zebravis embryo's te onderzoeken.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zebrafish (Danio rerio) embryo's worden steeds vaker gebruikt als infectiemodel om de functie van het aangeboren immuunsysteem van gewervelde dieren in host-pathogeen interacties te bestuderen. De eenvoud van het verkrijgen van grote aantallen embryo's, hun toegankelijkheid door externe ontwikkeling, hun optische transparantie, evenals de beschikbaarheid van een breed scala aan genetische/immunologische hulpmiddelen en collecties van transgene reporter lijnen, dragen bij aan de veelzijdigheid van dit model. In dit opzicht beschrijft het huidige manuscript het gebruik van zebrafish als een in vivo modelsysteem om de chronologie van Mycobacterium abscessus infectie te onderzoeken. Deze humane ziekteverwekker kan bestaan als gladde (S) of ruwe (R) varianten, afhankelijk van de samenstelling van de celwand, en hun respectieve virulentie kan worden afgebeeld en vergeleken in zebrafish embryo's en larven. Micro-injectie van gladde of ruwe fluorescente varianten rechtstreeks in de bloedcirculatie via de caudale ader, leidt respectievelijk tot chronische of acute/dodelijke infecties. Dit biologische systeem maakt hoge resolutie visualisatie en analyse mogelijk van de rol van mycobacteriële koordvorming bij het bevorderen van abscessvorming. Bovendien biedt het gebruik van fluorescente bacteriën samen met transgene zebravislijnen die fluorescente macrofagen bevatten, een unieke gelegenheid voor multi-kleurige beeldvorming van host-pathogeen interacties. Dit artikel beschrijft gedetailleerde protocollen voor de bereiding van homogeen M. abscessus inoculum en voor intraveneuze injectie van zebravis embryo's voor daaropvolgende fluoresceine beeldvorming van de interactie met macrofagen. Deze technieken openen de weg naar toekomstig onderzoek met mutanten die defect zijn in koordvorming en zijn gewijd aan het begrijpen hoe dit de M. abscessus pathogeniteit in een volledig gewervelde dier beïnvloedt.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mycobacterium abscessus is een opkomende ziekteverwekker die een breed spectrum van klinische ziektebeelden bij de mens veroorzaakt. Deze omvatten cutane infecties alsook ernstige chronische longinfecties, meestal aangetroffen in een verzwakt immuunsysteem en bij patiënten met cystische fibrose 1,2,3,4. M. abscessus wordt ook beschouwd als een belangrijke snelgroeiende mycobacteriële species belast en iatrogene nosocomiale infecties bij mensen. Bovendien is een aantal recente rapporten gewezen op de mogelijkheid dat M. abscessus kan de bloed-hersenbarrière en induceert belangrijke laesies in het centrale zenuwstelsel (CZS) 5,6. Ondanks dat het een snelle groeier, M. abscessus vertoont ook verschillende pathogene functies die samenhangen met die van Mycobacterium tuberculosis, zoals het vermogen om te zwijgen jaren binnen granulomateuze structuren en kaasachtige laesies in de longen 7 genereren. Meer verontrustend is de lage senligheid van M. abscessus antibiotica, waardoor deze infecties zeer moeilijk te behandelen leidt tot een significant therapeutisch uitvalpercentage 8,9. Het belangrijkste gevaar van deze soort is vooral de intrinsieke resistentie tegen antibiotica, die van groot belang in openbare gezondheidsinstellingen 10 en een contra longtransplantatie 11.

M. abscessus displays glad (S) of ruwe (R) kolonie morfotypen die leiden tot verschillende klinische resultaten. In tegenstelling tot de stam S, R bacteriën de neiging om begin tot eind groeien, waardoor een touw of koord structuur 12,13. Verschillende onafhankelijke studies op basis van hetzij cellen of diermodellen bleek de hyper-virulentie fenotype van de R morfotype 14,15. Uit epidemiologische studies, de ernstigste gevallen van M. abscessus longinfecties lijken geassocieerd te zijn met R varianten 16 de enige variant dieis gezien te blijven voor de komende jaren in een geïnfecteerde gastheer 3. De morfotype verschil is gebaseerd op de aanwezigheid (in S) of verlies (in R) van oppervlakte geassocieerd glycopeptidolipids (GPL) 12. Vanwege de inherente beperkingen van de momenteel beschikbare cellulaire / diermodellen gebruikt om M. studeren abscessus infectie, onze kennis over de pathofysiologische gebeurtenissen van de R- of S-varianten blijft onduidelijk. Infectie van immuno-competente muizen via een intraveneuze of aerosol routes leidt tot kortstondige kolonisatie, belemmeren het gebruik van muizen om hardnekkige infecties en voor in vivo drug gevoeligheid testen 17 bestuderen. Daarom ontwikkelen diermodellen vatbaar voor de manipulatie van de gastheer respons is een grote uitdaging. In deze context, niet- zoogdierlijke modellen van infectie zijn recent ontwikkeld, inclusief Drosophila melanogaster 18 dat verscheidene voordelen zoals kosten, snelheid en ethische aanvaardbaarheid o aanbiedingenVER de muismodel. De zebravis (Danio rerio) model van de infectie is ook onderzocht om te visualiseren, door niet-invasieve beeldvorming, de voortgang en de chronologie van M. abscessus infectie bij een levend dier 19. Belangrijk is dat een proof of concept ook opgericht om de geschiktheid te tonen voor in vivo antibiotica assessments tegen M. abscessus 17,20.

De zebravis zijn op grote schaal gebruikt in de laatste twee decennia de interacties tussen verschillende pathogenen en immuunsysteem van de gastheer 21 bestuderen. Het toenemende succes van deze alternatieve gewervelde model is gebaseerd op de grote en unieke mogelijkheden die gemotiveerd en gevalideerd het gebruik ervan voor een beter begrip van een groot aantal virale en bacteriële infecties 19,22,23,24,25,26,27,28,29. In tegenstelling tot de meeste andere diermodellen zebravis embryo's optisch transparant, zodat niet-invasieve fluorescentiebeeldvorming 30. Deze has leidde tot M. studeren abscessus besmet zebravis embryo's met een ongekende gegevens, met als hoogtepunt de beschrijving van extracellulaire cording, dat een voorbeeld van bacteriële morfologische plasticiteit vertegenwoordigen. Cording vertegenwoordigt een nieuw mechanisme van ondermijning van het immuunsysteem en een sleutelmechanisme bevorderen pathogenese van acute M. abscessus infectie 19.

Dit rapport beschrijft de nieuwe instrumenten en methoden met behulp van de zebravis embryo naar de pathofysiologische eigenschappen van M. ontcijferen abscessus infectie en de intieme interactie tussen de bacillen en het aangeboren immuunsysteem bestuderen. Eerst wordt een gedetailleerde micro-injectie protocol dat de verwerking van het bacteriële inoculum, embryo voorbereiding en besmetting zodanig omvat, wordt gepresenteerd. Methoden specifiek aangepast aan M. beoordelen abscessus virulentie door het meten van diverse parameters, zoals de gastheer overleving en bacteriële belasting, worden gepresenteerd. Speciale aandacht wordt gegeven over hoete controleren, op een tijdruimtelijke niveau, het lot en de progressie van de infectie en de gastheer immuunrespons op M. abscessus met behulp van video-microscopie. Bovendien is de bijdrage en de rol van macrofagen tijdens M. onderzoeken abscessus infectie werkwijzen macrofagen-verarmde embryo (via genetically- of chemisch-gebaseerde aanpak) worden beschreven genereren. Tenslotte protocollen bij de specifieke interacties met macrofagen of neutrofielen met behulp van een vaste of levende embryo's worden gedocumenteerd visualiseren.

Het doel van dit rapport is om verder onderzoek te stimuleren om nieuw licht te werpen in M. abscessus virulentie mechanismen en met name de rol van cording in de oprichting van een acute en ongecontroleerde infectie proces.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zebravis experimentele procedures moeten voldoen aan de relevante institutionele en overheidsvoorschriften. Voor de huidige studie, werden zebravis experimenten gedaan aan de Universiteit van Montpellier, volgens de richtlijnen van de Europese Unie voor de behandeling van proefdieren (http://ec.europa.eu/environment/chemicals/lab_animals/home_en.htm) en onder de referentie-goedgekeurde CEEA-LR-13007.

1. Bereiding van reagentia en apparatuur Microinjection

  1. Bereiden vis water door het oplossen van 0,06 g Instant Ocean Zee zout in 1 liter gedestilleerd water 31, dan autoclaaf te steriliseren (120 ° C gedurende 20 min) en bewaar bij 28,5 ° C gedurende maximaal 1 maand.
  2. Bereid methyleenblauwoplossing door het oplossen van 1 g methyleenblauw in 1 liter gedestilleerd water. Voeg 300 ul van methyleenblauw oplossing in 1 liter water om vis blauwe vis water te krijgen, dan autoclaaf te steriliseren en bewaren bij 28,5 ° C gedurende maximaal 1 maand.
    LET OP: De additiop methyleenblauw vis in het water voorkomt schimmelvorming.
  3. Bereiding van fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS)
    1. Bereid een 10 X PBS-voorraadoplossing door het oplossen van 5,696 g Na 2 HPO 4, 680 mg KH 2PO 4, 969 mg KCl en 78,894 g NaCl in 1 liter gedestilleerd water en de pH op 7,0 met HCl. Om 1 X PBS verkrijgen Verdun 100 ml van de 10 X PBS-oplossing in 900 ml gedestilleerd water en autoclaaf gedurende 20 min bij 120 ° C te steriliseren.
    2. Voeg 0,05% Tween 80 tot 1 X PBST verkrijgen en bewaar bij kamertemperatuur gedurende maximaal 1 jaar.
  4. Bereid Oliezuur Dextrose katalase (OADC) verrijkt door het oplossen van 8,5 g NaCl, 50 g runderserumalbumine, 20 g D-glucose, 40 mg catalase uit runderlever en 0,5 g oliezuur in 1 L gedistilleerd water filtreer steriliseren van de oplossing en bewaar bij 4 ° C gedurende maximaal 6 maanden.
  5. Bereid 100 ml van ethyl-3-aminobenzoaat methaansulfonzuur (tricaïne) stock-oplossing, door het oplossen van 400 mg tricaine poeder in 97,9 ml gedestilleerd water. Voeg 2,1 ml van 1 M Tris (pH 9) om de pH op 7,0 en bewaar de oplossing bij -20 ° C.
  6. Bereid de microcapillaire injectienaalden door te trekken borosilicaatglas haarvaten (1 mm OD x 0,78 mm ID) met behulp van een micropipet trekker apparaat met de volgende instellingen: Luchtdruk 650; Verwarm 999; Trek 50; Snelheid 80; Tijd 200.
  7. Bereid een 1,5% agar-oplossing in blauwe vis water en giet 25 ml gesmolten agar in 100 mm petrischaaltjes. Op de bovenkant van het gesmolten agar, plaatst zelfgemaakte mallen om specifieke kanalen prenten. "V" -vormige kanalen worden gebruikt om positie embryo tijdens de "U" -vormige gebruikt voor eieren (figuur 1) 31. Eenmaal gestold, verwijder voorzichtig de afdruk.
    OPMERKING: Bedek de agar met blauwe vis water om uitdroging te voorkomen en op te slaan bij 4 ° C gedurende maximaal 2 maanden.

figure-protocol-1
Figuur 1. Positionering kamers voor zebravis injecties. (A) U-vormige kanalen voor eieren (linker paneel) en V-vormige kanalen van embryo's (rechterpaneel). Zebravis eitjes / embryo's worden gelegd in de kanalen en uitgelijnd langs dezelfde as. (B) Viewing kamers voor microscopische observatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

2. Voorbereiding en opslag van de M. abscessus Inoculum

  1. M. abscessus groeiomstandigheden
    1. Plaat uit M. abscessus uit -80 ° C glycerol voorraad op een Middlebrook 7H10 agar bevattende 10% van OADC en 0,5% glycerol (7H10 OADC) en aangevuld met de juiste antibiotica naargelang de resistentiemerker de vector codeert voor het fluorescerende eiwit uitgevoerd. Incubeer de platenbij 30 ° C gedurende 4-5 dagen.
    2. Pick-up een fluorescentie-positieve mycobacteriële kolonie en te enten 1 ml Middlebrook 7H9 bouillon, aangevuld met OADC, 0,2% glycerol, 0,05% Tween 80 (7H9 OADC / T) met de vereiste antibioticum in een 15 ml steriele plastic buis. Incubeer bij 30 ° C gedurende 1 week zonder schudden.
      OPMERKING: Tween 80 beperkt klonteren en bacteriële aggregatie.
    3. Resuspendeer de voorkweek verkregen 2.1.2 in 50 ml Middlebrook 7H9 OADC / T in 150 cm2 weefselkweek kolven tot een uiteindelijke 0,1 OD 600 (overeenkomend met ongeveer 5,10 7 bacteriën / ml) en incubeer verder bij 30 ° C gedurende 4 dagen om een exponentieel groeiende kweek (OD 600 = 0,6 tot 0,8) te verkrijgen.
      OPMERKING: Om klontering te minimaliseren, met name van de ruwe variant moet incubatie niet meer dan 5 dagen. Zowel gladde en ruwe varianten vertonen een vergelijkbaar groeitempo.
  2. Bereiding van de M. abscessus inocula60;
    OPMERKING: Vanwege de hoge neiging van ruwe M. abscessus om grote aggregaten en koorden produceren, een specifieke behandeling noodzakelijk is homogeen en kwantitatief gecontroleerd inocula genereren vóór micro-injecties in het embryo. Deze behandeling wordt ook toegepast op bacteriën die aggregaten, zij het in mindere mate dan de ruwe stam glad.
    1. Harvest exponentieel groeiende kweken van 150 cm2 weefselkweek kolven door centrifugatie bij 4, 000 xg gedurende 15 min bij kamertemperatuur in een 50 ml steriele plastic buis en resuspendeer de bacteriële pellet in 1 ml 7H9 OADC / T. Aliquot 200 ul van bacteriële suspensies in 1,5 ml microcentrifuge buisjes.
      OPMERKING: Werken met kleine volumes in 1 ml injectiespuiten is het noodzakelijk om zeer homogene schorsingen te verkrijgen.
    2. Homogeniseer de bacteriële suspensies met een 26-G naald (15 up-and-down sequenties), ultrasone trillingen driemaal gedurende 10 sec (10 sec pauze tussen elke sonicatie sequence) met behulp van een waterbad sonicator. Voeg 1 ml van 7H9 OADC / T en vortex kort. Centrifugeer 3 min bij 100 x g.
    3. Zorgvuldig verzamelen-mycobacteriën bevattende supernatanten aan de klonten te voorkomen en bundelen de homogene suspensies in een 50 ml steriele plastic buis.
    4. Controleer visueel op de aanwezigheid van eventuele resterende bacteriële aggregaten.
      OPMERKING: Als aggregaten zijn nog steeds aanwezig, gaat een extra stap te centrifugeren bij 100 xg gedurende 2 minuten, en het verzamelen van de bovenstaande vloeistof.
    5. Centrifugeer de suspensie bij 4000 xg gedurende 5 min, resuspendeer de pellet in 200 ul 7H9 OADC / T en naar de injectie.
    6. Beoordeel de uiteindelijke bacteriële concentratie plateren seriële verdunningen (1 in x PBST) op OADC 7H10 agar en tellen van kolonievormende eenheden (CFU) na 4 dagen incubatie bij 30 ° C. CFU moeten worden voor elke nieuwe partij.
    7. Bereid bevroren inocula voorraden door de opslag van 5 ul aliquots bij -80 & #176; C.
      Opmerking: De CFU beoordeling van -80 ° C ingevroren aliquots is een voorwaarde voor het exacte aantal levende bacteriën te bepalen zoals bevriezen / ontdooien bacteriële levensvatbaarheid van het entmateriaal kan beïnvloeden. Deze bevroren inocula zijn klaar om te worden gebruikt voor de volgende injecties. Aangezien alle fracties bevatten hetzelfde aantal CFU, ze laten injecteren bacteriën op reproduceerbare wijze van de ene proef naar de andere.
  3. Inoculum kwaliteitscontrole
    OPMERKING: Ziehl-Neelsen-kleuring (specifiek voor mycobacteriën) kan worden gebruikt om de kwaliteit van de bacteriële suspensies te vergelijken voor en na de homogenisering procedures in 2,2 is beschreven.
    1. Spot en verspreid één druppel van het gehomogeniseerde bacteriële suspensie op een glasplaatje en laat het drogen, fix het uitstrijkje voor ten minste 30 minuten op een hete plaat ingesteld op 65-70 ° C en vlekken met behulp van een Ziehl-Neelsen kleuringsprotocol .
    2. Let op de bacteriële uitstrijkje met een microscoop met behulp van een 100X objectief en vergelijken met een uitstrijkje van een onbewerkte bacteriesuspensie (figuur 2).

figure-protocol-2
Figuur 2. Bereiding van gedispergeerde M. abscessus inocula. Ziehl-Neelsen-kleuring van R of S varianten gekweekt op kweekmedium voorafgaand aan enige behandeling (bovenste panelen) of na behandeling (onderste panelen) om de grootte en aantal mycobacteriële aggregaten (opeenvolgende stappen van uitspuiten, sonificatie en decanteren) verminderen . Bacteriën werden waargenomen met behulp van een microscoop met 100 X APO olie 1.4 NA doelstelling). Schaal bars. 20 urn Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

3. Voorbereiden van zebravis embryo's

  1. Paai en het verzamelen van de zebravis eieren
    1. De dag voor sverpanden, ras volwassen zebravissen door het plaatsen van 2 mannen en 1 vrouw (meestal een 2: 1 ratio laat optimale bemesting rate) in een fokkerij kamer, bestaande uit een apart aquarium met een ei collectie mand 31.
      OPMERKING: Ei collectie manden worden gebruikt om de eieren worden opgegeten door de ouders en het ei het oogsten te vergemakkelijken.
    2. Op 1 HPF, oogst eieren en alleen goed ontwikkelde embryo's in een schaal van 100 mm Petri gevuld met 25 ml blauwe vis water (maximaal 100 embryo's per gerecht) en houd ze bij 28,5 ° C. Niet-bevruchte eieren worden verwijderd.
  2. Bereiding van zebravis embryo's voor injecties
    1. Om ongeveer 24 uur na de bevruchting (HPF), dechorionate de embryo's met fijne pincet in een 100 mm petrischaal en houd ze bij 28,5 ° C.
    2. Verzamel de 30-48 HPF embryo's met behulp van een pipet en overbrengen naar een "V" -vormige positionering kamer gevuld met 25 ml water vissen met 270 mg / l tricaïne.Leg de embryo's goed in de kanalen met behulp van een zelfgemaakte microloader tip gereedschap (zelfgemaakte geknipt micro loader tip) geoptimaliseerd voor een gemakkelijker micro-manipulatie.
      OPMERKING: Oriënteer de dorsale zijde naar beneden voor intraveneuze injecties in de staart ader of de dorsale zijde naar boven voor de staart spier injecties.

4. Micro-injectie Procedure

LET OP: De micro-injectie procedure voor M. abscessus is gelijk aan die hiervoor beschreven voor M. marinum 32 injecties. Om de chronologie van M. beoordelen abscessus infectie (overleving, bacteriële belastingen en kinetische eigenschappen van infectie), injectie in de staartader van 30 HPF embryo voorkeur. De aanwerving van immuun cel visualiseren, worden injecties uitgevoerd in gelokaliseerde sites zoals is in de staart van de spieren in 48 HPF embryo.

  1. Verdun de mycobacteriële inoculum in 1 X PBST (afhankelijk van het aantal CFUtoegediend worden zoals bepaald in stap 2.2.6), die 10% rood fenol om een ​​goede injectie te controleren.
  2. Laad een microcapillair injectienaald met 5-10 ul van het bacteriële inoculum met een microloader tip, sluit de micro-injectie naald in de houder van de driedimensionale micromanipulator verbonden met de injector en afbreken van de bovenkant van de naald met een fijne pincet verkrijgen opening diameter van 5-10 urn.
  3. Kalibreer het injectievolume door aanpassing van de micro-injectie druk (20-50 hPa) en tijd (0,2 sec).
    Opmerking: De vereiste injectievolume wordt gekalibreerd door visuele bepaling van de diameter van een druppel uitgestoten in de dooier van een embryo.
  4. Voor staartader injectie, plaatst het embryo met de ventrale zijde van de naald (zoals beschreven in paragraaf 3.2.2) en plaats de naald dicht bij de urogenitale opening, gericht op de caudale ader, en duw de punt van de naald in het embryo totdat het gewoon doorboort de caudal ader regio. Lever het gewenste volume van bacteriële voorbereiding, meestal 1-3 nl met daarin ongeveer 100 CFU / nl.
  5. Voor intramusculaire injectie, de positie van de embryo met de dorsale zijde van de naald (zoals in paragraaf 3.2.2), plaatst de naald over één somiet en injecteer een klein volume (1 nl) inoculum.
    LET OP: Als voor staartader injecties, intramusculaire infecties zijn ook uitdagend om uit te voeren. Zorg moet worden genomen om een ​​overbelasting die het omliggende weefsel kunnen verwonden voorkomen.
  6. Aan het einde van de injectieprocedure, om de grootte van het inoculum door injectie van hetzelfde volume bacteriesuspensie in een druppel steriele PBST gevolgd door uitplaten op 7H10 OADC en tellen van CFU. Ongeveer 100 embryo's worden geïnjecteerd met een naald.
    OPMERKING: Omdat ruwe M. abscessus kunnen blijven aggregaten in de naald, moet injecties onmiddellijk na de bereiding van het inoculum worden uitgevoerd.
  7. Breng de besmette fish individueel in 24-well platen met 2 ml / putje vis water en incubeer bij 28,5 ° C. Embryo geïnjecteerd met 1-3 nl 1 X PBST kunnen worden gebruikt als controles.
  8. Een goede infectie van fluorescerende bacteriën in embryo wordt geanalyseerd met een fluorescentiemicroscoop.

5. Generatie van macrofaag Depleted Embryo's

OPMERKING: Selectieve verwijdering van macrofagen uit weefsels wordt gebruikt om hun bijdrage en de rol tijdens infectie te onderzoeken. Om de juiste verwijdering van macrofagen te visualiseren, wordt aanbevolen een transgene lijn met fluorescerende macrofagen, waarbij mCherry bijzonder onder controle van de macrofaag specifieke MPEG1 19 promoter tot expressie gebruikt.

  1. Lipo-clodronaat-gebaseerde procedure
    OPMERKING: De lipo-clodronaat procedure kan een selectieve verwijdering van macrofagen uit weefsels (maar geen neutrofielen) 19. Deze verbinding heeft noch invloed op de overleving van embryo's noch affect de integriteit van bacteriën. Is eerder gerapporteerd 33 Een gedetailleerd protocol voor liposomen ingekapselde clodronaat bereiden.
    1. Bij 24 HPF, dechorionate het embryo en overbrengen naar een "V" -vormige injection schotel gevuld met vis water aangevuld met tricaïne het embryo in een verdoofde toestand te houden tot het einde van de injectieprocedure zoals beschreven in 3.2.2. Oriënteren de dorsale zijde naar beneden.
    2. Plaats een microcapillair injectienaald met-liposoom ingekapselde clodronaat (lipo-clodronaat), sluit u de micro-injectie naald in de houder van de drie-dimensionale micromanipulator en breek de top van de naald met fijn pincet om een ​​tip opening diameter van 10 micrometer te verkrijgen.
    3. Aan de injectie volume te kalibreren, past u de micro-injectie druk om 20 hPa en de injectie tijd om 0,2 sec. Plaats de naald dicht bij de urogenitale opening, gericht op de caudale ader, en duw de punt van de naald in deembryo tot het net doorboort de caudale ader regio en het gewenste volume van de oplossing (2-3 nl, 3 keer) te leveren.
      Opmerking: Het lipo-clodronaat vering erg kleverig en moet vooraf worden gewerveld injectie zonder dat daardoor het vaatstelsel en doden van het embryo. Het is cruciaal om door te gaan naar verschillende opeenvolgende injecties van kleine volumes.
    4. Overdracht van de embryo's in 100 mm petrischalen met vis water en houd ze bij 28,5 ° C tot infectie.
    5. De controle van de juiste verwijdering van macrofagen door fluorescentie microscopie.
      OPMERKING: Compleet macrofaag uitputting is effectief voor 4 dagen na de lipo-clodoronate administratie.
  2. Op morfolino gebaseerde procedure
    1. De dag voor het paaien, ras volwassen zebravissen door het plaatsen van 2 mannen en 1 vrouw gescheiden door een plastic barrière in een voedingsbodem kamer.
    2. De volgende dag, ≈ 30 minuten na dat de branden in de zebravis faciliteit, verwijder de barrière tussenmannetjes en vrouwtjes. Wacht ongeveer 20 minuten na aanvang van de paai de bevruchtingspercentage optimaliseren. Oogst de eieren en remmen de ontwikkeling door ze in een 100 mm petrischaal gevuld met koud blauwe vis water (4 ° C).
      LET OP: De controle van de paai is cruciaal voor de morpholinos-gebaseerde experimenten. Morpholinos kan alleen worden geïnjecteerd in de eieren naar de vier cellen stadium.
    3. Het verzamelen van de eieren met een pipet en het deponeren van de eieren in de "U" -vormige injectie-kamer gevuld met koud blauwe vis water en blokkeren de eieren in de kanalen met behulp van een zelfgemaakte microloader tip tool.
    4. Bereid de PU.1 morfolino oplossing die 10% rood fenol, zoals eerder beschreven 19. Plaats een microcapillair injectienaald met de morfolino voorbereiding en sluit de micro-injectie naald in de houder van de drie-dimensionale micromanipulator, dan breken van de punt van de naald met fijn pincet om obtaina tip opening diameter van 5-10 urn.
    5. Aan de injectie volume te kalibreren, past u de micro-injectie druk 20-50 hPa en de injectie tijd om 0,2 sec. Plaats de naald in de buurt van het ei en duw de punt van de naald door het chorion in het ei en het leveren van de gewenste morfolino oplossing volume, meestal 3-5 nl.
    6. Na micro-injectie, overdracht van de eieren in een 100 mm petrischaal in viswater en incuberen bij 28,5 ° C totdat de infectie begint.
    7. Analyseer de juiste (compleet) depletie van macrofagen in PU.1 morphants door fluorescentie microscopie op 30-48 hpf..
      OPMERKING: Afhankelijk van de concentratie geïnjecteerd, kan p u.1 morpholinos ook van invloed op het aantal vroegtijdige neutrofielen. Om de juiste verwijdering van macrofagen te bevestigen zonder dat het aantal neutrofielen, is het raadzaam om een ​​dubbele transgene zebravis lijn met fluorescerende macrofagen en neutrofielen te gebruiken (met GFPexpressie specifiek gedreven door de MPX promotor) 19.

6. Bacteriële Burden kwantificering

  1. Bepaling door CFU opsomming
    1. Op het gewenste tijdstip, verzamel groepen geïnfecteerde embryo (5 per omstandigheden) in 1,5 ml microcentrifuge buisjes (1 embryo / buis), cryo-verdoven het embryo door incubatie op ijs gedurende 10 min en euthanize via een overdosis tricaïne (300- 500 mg / l)
    2. Was de embryo's met steriel water en tweemaal dispenseren in een nieuwe buis, lyse elk embryo met 2% Triton X-100 verdund in 1 X PBST met een 26-G naald en homogeniseer de suspensie tot volledige lysis. Centrifugeer de suspensie en resuspendeer de pellet in 1 X PBST met 0,05% Tween 80. Seriële verdunningen van de homogenaten worden uitgeplaat op Middlebrook 7H10 OADC en aangevuld met BBL MGIT PANTA, zoals aanbevolen door de leverancier.
      OPMERKING: M. abscessus die meer vatbaar zijn voor NaOH treatment dan M. marinum, ontsmetting van vis lysaten zonder dat M. abscessus groei met succes kan worden bereikt met behulp van de BBL MGIT PANTA antibioticum cocktail.
    3. Incubeer de platen gedurende 4 dagen bij 30 ° C en tellen kolonies.
  2. Bepaling van Fluorescentie Pixeltelling (FPC) metingen in levende embryo's
    OPMERKING: Om de bacteriële ladingen via fluorescentie-emissie te bepalen, seriële beelden van geïnfecteerde embryo's worden verkregen en fluorescentie-intensiteit gemeten door FPC (identificatie van bacteriën door het deeltje analyse) met behulp van een zelfgemaakte macro ontwikkeld voor de ImageJ freeware. Een deeltje analyse vereist een binaire zwart-wit beeld, dat is gebaseerd op een drempel bereik dat het mogelijk maakt om te discrimineren de fluorescerende signaal van interesse van de achtergrond.
    1. Op het gewenste tijdstip, tricain-verdoven geïnfecteerde embryo's (5-10 per conditie) in 35 mm petrischaaltjes zoals beschreven in 3.2.2.
    2. Verwijder water en submeRGE de embryo's en de hele gerecht oppervlak met 1% laag smeltpunt agarose in vis water, dan uitlijnen zijwaarts de embryo's. Bedek de gestolde agarose met vis water met tricaïne.
    3. Verwerven fluorescentie beelden van het hele embryo met behulp van een epifluorescentiemicroscoop met een 10 X doelstelling.
      OPMERKING: Het beeld fluorescentie overname is een belangrijke stap van de FPC metingen procedure. Het is belangrijk om een ​​gekalibreerde monitor met een kleurkalibratie probe. De optimale belichtingstijd aanpassing aan een minimale achtergrond verkrijgen tijdens verwerving voorkomt verzadiging van het signaal. Afbeeldingen moeten in een 8-bit TIFF-formaat. Identieke instellingen gedurende het gehele experiment kwantitatieve bijgehouden.
    4. Verwijder zorgvuldig de agarose uit de embryo's met een zelfgemaakte microloader tip tool. Deze embryo's kunnen worden gebruikt voor verdere analyse indien nodig. Voorafgaand aan de kwantificering van de bacteriële verontreiniging wordt elk beeldkwaliteit worden gecontroleerd. EenAnalyseer de beelden en zetten de fluorescentie-intensiteit in de FPC per vis, open de ImageJ freeware.
      OPMERKING: De FPC waarde reflecteert de bacteriële last zoals eerder met behulp van M. marinum 34.
    5. Bepaal de benodigde drempel voor beeldanalyse met behulp van een afbeelding van een niet-geïnfecteerde embryo (verschillende bedienings- embryo's kunnen worden gebruikt om een ​​gemiddelde drempel te verkrijgen). Ga naar Afbeelding → ​​Aanpassen → Drempel en verplaats de onderste schuif in de drempel venster naar rechts tot de achtergrond wordt volledig zwart (dat wil zeggen, om een achtergrond te krijgen moet op nul). Noteer de overeenkomstige waarde.
    6. Binnen Afbeelding J, opent de FPC macro (aanvullende bestand) en volg de aanwijzingen: zoek de map met afbeeldingen te meten en voer vervolgens de drempel zoals eerder bepaald en klik op "OK".
      OPMERKING: De macro trekt automatisch op de achtergrond. Een drempel wordt dan aangebracht. Fluorescerende signalen identified na de analyse van deeltjes.
    7. Kopiëren en de gegevens van de samenvatting raam te plakken op de gewenste software voor data-analyse.
      Opmerking: In tegenstelling tot CFU bepalingsmethode, de FPC werkwijze is niet-invasief en maakt hergebruik van het embryo vervolgens geanalyseerd en, belangrijker nog, de controle op de dynamiek / kinetiek van de bacteriële belasting op individuele basis. Het, daarom maakt het mogelijk om het aantal dieren aanzienlijk te verminderen, in overeenstemming met de ethische regels.

7. Imaging M. abscessus- besmet Embryo

  1. Live-beeldvorming van M. abscessus infectie
    1. Mount-tricaïne narcose embryo's (zie 3.2.2) in 1% laag smeltpunt agarose in een 35 mm petrischaal voorafgaand aan epifluorescentiemicroscopie observaties. Gebruik een glazen bodem schotel voor omgekeerde confocale microscopie of in één holte depressie glijbaan voor rechtopstaande confocale microscopie. Oriënteren het embryo naar de gewenste positie en afdekkingde gestolde agarose met vis water met tricaïne.
    2. Gebruik een epifluorescentiemicroscoop met een 10 x objectief voor sequentiële fluorescentie-acquisitie en transmissie beelden van het hele embryo. Alternatief gebruik van een confocale microscoop met 40X en 63X doelstellingen om de activiteit van immuuncellen visualiseren na een infectie.
  2. Imaging vaste M. abscessus geïnfecteerde embryo
    1. Euthanize het embryo zoals beschreven in 6.1.1 en overbrengen naar 1,5 ml micro-centrifugebuizen en bevestig de embryo in 4% paraformaldehyde in 1 X PBST gedurende 2 uur bij KT of O / N bij 4 ° C. Verwijder paraformaldehyde door wassen van de embryo tweemaal met 1 x PBST gedurende 10 min.
      OPMERKING: Om de fluorescentie te behouden, moeten vaste embryo's worden beschermd tegen het licht.
    2. Om de integriteit van de weefsels en fluorescentie behouden, worden embryo's successievelijk geïncubeerd bij toenemende concentraties glycerol oplossingen (10, 20, 30, 40 en 50% verdund in 1 X PBST) voor10 min per conditie.
      OPMERKING: Vaste embryo's kunnen worden opgeslagen gedurende enkele maanden in 50% glycerol bij 4 ° C.
    3. Leg de embryo ingebed in 50% glycerol in bezichtiging kamer (Figuur 1B) 31.
    4. Beeld met behulp van 40X of 63X doelstellingen op een confocale microscoop.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hoewel verschillende anatomische sites kunnen worden geïnjecteerd 32 worden staartader injecties vaak gebruikt om systemische infectie voor latere analyses, waaronder de overleving experimenten, bacteriële last vastberadenheid, fagocytose activiteit of koord formatie genereren. Injecties in de staart spieren worden gebruikt om de rekrutering van macrofagen beoordeeld op de plaats van injectie (figuur 3A). Onderzoeken en vergelijk de virulentie van R- en S varianten van M. abscessus w...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De zebravis is recentelijk naar voren gekomen als een uitstekend vertebrate modelsysteem voor het bestuderen van de dynamica van bacteriële infectie met behulp van groot veld en confocale beeldvorming in real-time 36. De combinatie van verspreide mycobacteriële schorsingen (protocol 2.2) samen met micro-injectie methoden (protocol 4) maakt reproduceerbare systemische infecties, en de daaropvolgende monitoring en visualisatie van de progressie van de infectie met een speciale focus op de bacteriële interacties...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs zijn dankbaar K. Kissa voor nuttige discussies en voor het verstrekken van lipo-clodronaat en L. Ramakrishnan voor de gulle gift van pTEC27 en pTEC15 dat de expressie van tdTomato en Wasabi toe, respectievelijk. Dit werk maakt deel uit van de projecten van de Franse Nationale Research Agency (ZebraFlam ANR-10-MIDI-009 en DIMYVIR ANR-13-BSV3-007-01) en de Europese Gemeenschap Zevende Kaderprogramma (FP7-PEOPLE-2011-ITN) onder subsidieovereenkomst nr. PITN-GA-2011-289209 voor de Marie Curie Initial Training Network FishForPharma. We willen ook de Vereniging Gregory Lemarchal en Vaincre La Mucoviscidose (RF20130500835) bedanken voor de financiering van CM Dupont.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
BBL MGIT PANTABD Biosciences245114
Bovine Serum Albumin Euromedex04-100-811-E
Catalase from Bovine Liver Sigma-AldrichC40
Difco Middlebrook 7H10 AgarBD Biosciences262710
Difco Middlebrook 7H9 BrothBD Biosciences271310
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine)Sigma-AldrichA5040
Oleic AcidSigma-AldrichO1008
ParaformaldehydeDelta Microscopie15710
Phenol RedSigma-Aldrich319244
Tween 80Sigma-AldrichP4780
AgarGibco Life Technologie30391-023
Low melting agaroseSigma-Aldrich
Instant Ocean Sea Salts Aquarium Systems Inc
Borosilicate glass capillaries Sutter instrument IncBF100-78-101 mm O.D. X 0.78 mm I.D.
Micropipette puller device Sutter Instrument IncFlamming/Brown Micropipette Puller p-87
MicroinjectorTritech Research Digital microINJECTOR, MINJ-D
TweezersSciences Tools incDumont # M5S 
Microloader TipsEppendorf

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Brown-Elliott, B. A., Wallace, R. J. Clinical and taxonomic status of pathogenic nonpigmented or late-pigmenting rapidly growing mycobacteria. Clinical Microbiology Reviews. 15 (4), 716-746 (2002).
  2. Aitken, M. L., Limaye, A., et al. Respiratory outbreak of Mycobacterium abscessus subspecies massiliense in a lung transplant and cystic fibrosis center. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 185 (2), 231-232 (2012).
  3. Gilljam, M., Lindblad, A., Ridell, M., Wold, A. E., Welinder-Olsson, C. Molecular epidemiology of Mycobacterium abscessus, with focus on cystic fibrosis. Journal of Clinical Microbiology. 45 (5), 1497-1504 (2007).
  4. Roux, A. -L., Catherinot, E., et al. Multicenter study of prevalence of nontuberculous mycobacteria in patients with cystic fibrosis in France. Journal of Clinical Microbiology. 47 (12), 4124-4128 (2009).
  5. Lee, M. -R., Cheng, A., et al. CNS infections caused by Mycobacterium abscessus complex: clinical features and antimicrobial susceptibilities of isolates. The Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 67 (1), 222-225 (2012).
  6. Talati, N. J., Rouphael, N., Kuppalli, K., Franco-Paredes, C. Spectrum of CNS disease caused by rapidly growing mycobacteria. The Lancet Infectious Diseases. 8 (6), 390-398 (2008).
  7. Medjahed, H., Gaillard, J. -L., Reyrat, J. -M. Mycobacterium abscessus: a new player in the mycobacterial field. Trends in Microbiology. 18 (3), 117-123 (2010).
  8. Griffith, D. E., Girard, W. M., Wallace, R. J. Clinical features of pulmonary disease caused by rapidly growing mycobacteria. An analysis of 154 patients. The American Review of Respiratory Disease. 147 (5), 1271-1278 (1993).
  9. Nessar, R., Cambau, E., Reyrat, J. M., Murray, A., Gicquel, B. Mycobacterium abscessus: a new antibiotic nightmare. The Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 67 (4), 810-818 (2012).
  10. Sanguinetti, M., Ardito, F., et al. Fatal pulmonary infection due to multidrug-resistant Mycobacterium abscessus a patient with cystic fibrosis. Journal of Clinical Microbiology. 39 (2), 816-819 (2001).
  11. Griffith, D. E., Aksamit, T., et al. An official ATS/IDSA statement: diagnosis, treatment, and prevention of nontuberculous mycobacterial diseases. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 175 (4), 367-416 (2007).
  12. Howard, S. T., Rhoades, E., et al. Spontaneous reversion of Mycobacterium abscessus a smooth to a rough morphotype is associated with reduced expression of glycopeptidolipid and reacquisition of an invasive phenotype. Microbiology (Reading, England). 152 (Pt 6), 1581-1590 (2006).
  13. Chardi, A., Olivares, F., Byrd, T. F., Julián, E., Brambilla, C., Luquin, M. Demonstration of cord formation by rough Mycobacterium abscessus variants: implications for the clinical microbiology laboratory. Journal of Clinical Microbiology. 49 (6), 2293-2295 (2011).
  14. Byrd, T. F., Lyons, C. R. Preliminary characterization of a Mycobacterium abscessus mutant in human and murine models of infection. Infection and Immunity. 67 (9), 4700-4707 (1999).
  15. Catherinot, E., Clarissou, J., et al. Hypervariance of a rough variant of the Mycobacterium abscessus type strain. Infection and Immunity. 75 (2), 1055-1058 (2007).
  16. Catherinot, E., Roux, A. -L., et al. Acute respiratory failure involving an R variant of Mycobacterium abscessus. Journal of Clinical Microbiology. 47 (1), 271-274 (2009).
  17. Bernut, A., Le Moigne, V., Lesne, T., Lutfalla, G., Herrmann, J. -L., Kremer, L. In vivo assessment of drug efficacy against Mycobacterium abscessus using the embryonic zebrafish test system. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 58 (7), 4054-4063 (2014).
  18. Oh, C. -T., Moon, C., Jeong, M. S., Kwon, S. -H., Jang, J. Drosophila melanogaster for Mycobacterium abscessus infection. Microbes and Infection / Institut Pasteur. 15 (12), 788-795 (2013).
  19. Bernut, A., Herrmann, J. -L., et al. Mycobacterium abscessus cording prevents phagocytosis and promotes abscess formation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (10), E943-E952 (2014).
  20. Dubée, V., Bernut, A., et al. β-Lactamase inhibition by avibactam in Mycobacterium abscessus. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 70 (4), 1051-1058 (2015).
  21. Torraca, V., Masud, S., Spaink, H. P., Meijer, A. H. Macrophage-pathogen interactions in infectious diseases: new therapeutic insights from the zebrafish host model. Disease Models Mechanisms. 7 (7), 785-797 (2014).
  22. Alibaud, L., Rombouts, Y., et al. A Mycobacterium marinum TesA mutant defective for major cell wall-associated lipids is highly attenuated in Dictyostelium discoideum and zebrafish embryos. Molecular Microbiology. 80 (4), 919-934 (2011).
  23. Clay, H., Volkman, H. E., Ramakrishnan, L. Tumor necrosis factor signaling mediates resistance to mycobacteria by inhibiting bacterial growth and macrophage death. Immunity. 29 (2), 283-294 (2008).
  24. Palha, N., Guivel-Benhassine, F., et al. Real-time whole-body visualization of Chikungunya Virus infection and host interferon response in zebrafish. PLoS pathogens. 9 (9), e1003619(2013).
  25. Mostowy, S., Boucontet, L., et al. The zebrafish as a new model for the in vivo study of Shigella flexneri with phagocytes and bacterial autophagy. PLoS pathogens. 9 (9), e1003588(2013).
  26. Prajsnar, T. K., Cunliffe, V. T., Foster, S. J., Renshaw, S. A. A novel vertebrate model of Staphylococcus aureus reveals phagocyte-dependent resistance of zebrafish to non-host specialized pathogens. Cellular Microbiology. 10 (11), 2312-2325 (2008).
  27. Van der Sar, A. M., Appelmelk, B. J., Vandenbroucke-Grauls, C. M. J. E., Bitter, W. A star with stripes: zebrafish as an infection model. Trends in Microbiology. 12 (10), 451-457 (2004).
  28. Vergunst, A. C., Meijer, A. H., Renshaw, S. A., O’Callaghan, D. Burkholderia cenocepacia creates an intramacrophage replication niche in zebrafish embryos, followed by bacterial dissemination and establishment of systemic infection. Infection and Immunity. 78 (4), 1495-1508 (2010).
  29. Levraud, J. -P., Disson, O., et al. Real-time observation of Listeria monocytogenes-phagocyte interactions in living zebrafish larvae. Infection and Immunity. 77 (9), 3651-3660 (2009).
  30. Meijer, A. H., Spaink, H. P. Host-pathogen interactions made transparent with the zebrafish model. Current Drug Targets. 12 (7), 1000-1017 (2011).
  31. Westerfield, M. The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio Rerio). , (2007).
  32. Benard, E. L., van der Sar, A. M., Ellett, F., Lieschke, G. J., Spaink, H. P., Meijer, A. H. Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens. Journal of Visualized Experiments. (61), e3781(2012).
  33. Van Rooijen, N., Sanders, A. Liposome mediated depletion of macrophages: mechanism of action, preparation of liposomes and applications. Journal of Immunological Methods. 174 (1-2), 83-93 (1994).
  34. Adams, K. N., Takaki, K., et al. Drug tolerance in replicating mycobacteria mediated by a macrophage-induced efflux mechanism. Cell. 145 (1), 39-53 (2011).
  35. Ramakrishnan, L. Looking within the zebrafish to understand the tuberculous granuloma. Advances in Experimental Medicine and Biology. 783, 251-266 (2013).
  36. Davis, J. M., Clay, H., Lewis, J. L., Ghori, N., Herbomel, P., Ramakrishnan, L. Real-time visualization of Mycobacterium-macrophage interactions leading to initiation of granuloma formation in zebrafish embryos. Immunity. 17 (6), 693-702 (2002).
  37. Lamason, R. L., Mohideen, M. -A. P. K., et al. SLC24A5, a putative cation exchanger, affects pigmentation in zebrafish and humans. Science (New York, NY). 310 (5755), 1782-1786 (2005).
  38. Renshaw, S. A., Loynes, C. A., Trushell, D. M. I., Elworthy, S., Ingham, P. W., Whyte, M. K. B. A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation. Blood. 108 (13), 3976-3978 (2006).
  39. Hall, C., Flores, M. V., Storm, T., Crosier, K., Crosier, P. The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fish. BMC developmental biology. 7, 42(2007).
  40. Takaki, K., Davis, J. M., Winglee, K., Ramakrishnan, L. Evaluation of the pathogenesis and treatment of Mycobacterium marinum in zebrafish. Nature Protocols. 8 (6), 1114-1124 (2013).
  41. Stoop, E. J. M., Schipper, T., et al. Zebrafish embryo screen for mycobacterial genes involved in the initiation of granuloma formation reveals a newly identified ESX-1 component. Disease Models Mechanisms. 4 (4), 526-536 (2011).
  42. Carvalho, R., de Sonneville, J., et al. A high-throughput screen for tuberculosis progression. PloS One. 6 (2), e16779(2011).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Mycobacterium abscessusZebrafish EmbryosIntravenous InjectionFluorescence MicroscopyConfocal MicroscopyMacrophage DepletionBacterial Inoculum PreparationCording FormationHost Pathogen InteractionVirulence Comparison

Related Articles