Eiwit-eiwit-interacties worden in cellen met een ruimtelijke resolutie van nanometer gevisualiseerd door bimoleculaire fluorescentie-complementatie (BiFC) te combineren met fotogeactiveerde lokalisatiemicroscopie (PALM). Hier wordt het gebruik van BiFC-PALM beschreven voor het beeldvormen van Ras-Raf-interacties in U2OS-cellen voor het visualiseren van de nanoschalige clustervorming en diffusie van individuele Ras-Raf-complexen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Fotogeactiveerde Localization Microscopie met Bimoleculaire Fluorescentie Complementatie (BiFC-PALM)
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Eiwit-eiwit interacties (PPI's) zijn belangrijke moleculaire gebeurtenissen in de biologie. Het blijft echter een uitdaging om PPI's met voldoende resolutie en gevoeligheid in cellen te visualiseren, omdat de resolutie van conventionele lichtmicroscopie beperkt is tot ongeveer 250 nm door diffractie. Door bimoleculaire fluorescentie-complementatie (BiFC) te combineren met fotogeactiveerde lokalisatiemicroscopie (PALM), kunnen PPI's in cellen worden gevisualiseerd met gevoeligheid voor enkele moleculen en een ruimtelijke resolutie van nanometer. BiFC is een veelgebruikte techniek voor het visualiseren van PPI's met fluorescentiecontrast, die het splitsen van een fluorescent eiwit in twee niet-fluorescente fragmenten omvat. PALM is een recente superresolutie microscopietechniek voor het beeldvormen van biologische monsters op de nanometer- en enkele molecuulschaal, die fototransformeerbare fluorescente sondes gebruikt, zoals fotoactiveerbare fluorescente eiwitten (PA-FP's). BiFC-PALM werd gedemonstreerd door het splitsen van PAmCherry1, een PA-FP compatibel met PALM, vanwege zijn monomere aard, goede helderheid voor enkele moleculen, hoge contrastverhouding en bruikbaarheid voor stoichiometrische metingen. Wanneer gesplitst tussen aminozuren 159 en 160, kan PAmCherry1 worden gemaakt tot een BiFC-sonde die efficiënt reconstitueert bij 37 °C met hoge specificiteit voor PPI's en lage niet-specifieke reconstituuring. De Ras-Raf-interactie wordt gebruikt als voorbeeld om te laten zien hoe BiFC-PALM helpt om interacties op nanometerschaal en met resolutie voor enkele moleculen te onderzoeken. Hun diffusie kan ook worden gevolgd in levende cellen met behulp van single molecule tracking (smt-) PALM. In dit protocol worden factoren besproken waarmee rekening moet worden gehouden bij het ontwerpen van de fusie-eiwitten voor BiFC-PALM, worden stapreparatie, beeldverwerving en data-analysestappen uitgelegd, en worden enkele voorbeeldresultaten getoond. BiFC-PALM biedt hoge ruimtelijke resolutie, specificiteit en gevoeligheid, en is een nuttige tool voor het bestuderen van PPI's in intacte biologische monsters.
Inleiding
Eiwit-eiwit interacties (PPI) zijn van fundamenteel belang voor de biologie 1 en zijn strak gereguleerd via spatiotemporele mechanismen heel veel tijd en lengteschalen. Studies on cell signaling op het celmembraan, bijvoorbeeld, zijn dynamische, nanoschaal ruimtelijke compartimenten specifieke PPI en cellulaire processen 2 vergemakkelijken geopenbaard. Vandaar dat de mogelijkheid om protonpompremmers in biologische systemen sonde met voldoende ruimtelijke en temporele resolutie, hoge specificiteit en hoge gevoeligheid is de sleutel tot het bereiken van een mechanistisch begrip van de biologie.
Bimoleculaire fluoresce....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Klonen
- Bepaal de configuraties te klonen en kies een linker. Tag-eiwitten met de fragmenten op het N- of C-terminus zoals hieronder beschreven zodat ze niet de juiste lokalisatie verstoren. Gebruik een flexibele linker, zoals (GGGGS) x2.
- Genetisch tag de eiwitten van belang aan de PAmCherry1 fragmenten. Als een optie, gebruik maken van de klonen in de materialen lijst met de fragmenten RN (PAmCherry1 residuen 1-159) en RC (Met plus PAmCherry1 resten 160-236) met flankerende MCS sequenties vermeld plasmiden.
- Lineariseren de plasmiden die de fragmenten RN en RC inverse PCR (of restrictiedigestie) op het invoegpunt. Primers voor omgekeer....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
De BiFC-PALM getoonde voorbeeld is Kras G12D mutant interactie met de Ras-bindend domein (RBD) van craf (Figuur 1A). Zoals besproken werden de RN of RC fragmenten niet gelabeld aan de C-terminus van Ras omdat de membraanlokalisatie en dus de biologische activiteit van Ras zou verstoren. Dit verminderde de mogelijke combinaties 8-4 (Figuur 1B). Elk van deze vier combinaties werd ingebracht in cellen met behulp U2OS lentivirale infectie. De cellen werden vastgesteld zoals beschreven in he.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
BiFC is een veelgebruikte techniek voor het opsporen en visualiseren van PPI in cellen geweest, terwijl PALM is een recente single molecule superresolutiemicroscopie techniek die nanoschaal beeldvorming van intacte biologische monsters mogelijk maakt. De combinatie van BiFC met PALM bereikt selectieve beeldvorming van PPI's in een cel met nanometer ruimtelijke resolutie en single molecule gevoeligheid. BiFC-PALM breidt het nut van beide technieken, en zoals aangetoond in dit werk toont grote belofte in het openbaren.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
De auteurs danken Drs. Steven Chu en Joe W. Gray voor nuttige discussies, Henry Marr voor zijn initiële werk aan het BiFC-PALM project, en Alexis Shoemaker voor haar technische assistentie. Dit werk wordt ondersteund door opstartfondsen aan X.N. van OHSU. Het onderzoek in het Nan laboratorium werd ook ondersteund door NIH 5U54CA143836-05, de Damon Runyon Cancer Research Foundation, de M. J. Murdock Charitable Trust en de FEI-onderneming.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Microscope frame | Nikon | Ti-U | |
| 60X oil immersion TIRF objective with 1.49 NA | Nikon | CFI Apo TIRF 60x H | |
| EMCCD camera | Andor | iXon Ultra 897 | |
| 561 nm laser | Opto Engine | MGL-FN-561 | |
| 405 nm laser | Coherent | CUBE-405 50mW | |
| 561 nm dichroic mirror | Semrock | Di01-R405/488/561/635-25x36 | |
| 561 nm filter | Semrock | FF01-525/45-25 | |
| 405/561 nm notch filter | Semrock | NF01-405/488/568-25 | |
| Temperature and CO2 controlled stage | Tokai Hit | INUBG2ATW-PLAM | |
| pENTR-D-TOPO-PAmCherry1_1-159-MCS | Addgene | 60545 | |
| pENTR-D-TOPO-PAmCherry160-236-MCS | Addgene | 60546 | |
| pcDNA3.2-DEST | Life Technologies | 12489-019 | |
| pLenti-DEST | Addgene | http://www.addgene.org/Eric_Campeau/ | |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | Thermo Scientific | F-531 | |
| In-Fusion HD Cloning | Clontech | 639649 | |
| LR Clonase | Life Technologies | 11791 | |
| Vira Power Lentivirus Packaging | Life Technologies | K497500 | |
| X-tremeGENE Transfection Reagent | Roche | 13873800 | |
| Lab-Tek II Chambered Coverglass | Thermo Scientific | 155409 | #1.5 glass bottom dishes |
| U2OS cells | ATCC | HTB-96 | |
| 293T/17 cells | ATCC | CRL-11268 | |
| DMEM with phenol red | Life Technologies | 11995 | |
| DMEM no phenol red | Life Technologies | 21063 | |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 10082 | |
| Leibovit's L-15, no phenol red | Life Technologies | 21083-027 | |
| Reduced serum medium | Life Technologies | 31985 | |
| Phosphate Buffered Saline | Life Technologies | 14040 | |
| Syringe | BD Biosciences | 309604 | |
| Syringe filter | Millipore | SLHV033RB | |
| Lentiviral concentrator | Clontech | 631231 | |
| Retroviral concentrator | Clontech | 631455 | |
| 10 cm culture dish | BD Biosciences | 353003 | |
| 6-well culture plate | BD Biosciences | 353046 | |
| Polybrene | Sigma | 107689 | |
| Puromycin | Life Technologies | A11138 | |
| G-418 | Calbiochem | 345812 | Neomycin |
| Doxycyline | Fisher | BP2653 | |
| Tris base | Fisher | BP152 | |
| EDTA | Sigma | EDS | |
| Sodium Hydroxide | Sigma | S5881 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | |
| Glutaraldehyde | Sigma | G6257 | |
| PIPES | Sigma | P6757 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| EGTA | Sigma | 3777 | |
| Magnesium Sulfate | Sigma | M2643 | |
| Potassium Hydroxide | Sigma | 221473 | |
| Sodium chloride | Fisher | BP358 | |
| Magnesium chloride | Fisher | M33 | |
| 100 nm gold particles | BBI Solutions | EM.GC100 | |
| Molecular grade water | Life Technologies | 10977 | |
| Dpn1 | New England Biolabs | R0176 | |
| PCR purification kit | Qiagen | 28104 | |
| Miniprep kit | Qiagen | 27104 | |
| Midiprep kit | Macherey-Nagel | 740410 | |
| 0.6 ml microcentrifuge tubes | Fisher | 05-408-120 | |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | Fisher | 05-408-137 | |
| 15 ml tubes | Fisher | 05-539-12 | |
| 5 ml polypropylene round-bottom tubes | BD Biosciences | 352063 | |
| 14 ml polypropylene round-bottom tubes | BD Biosciences | 352059 | |
| 50 ml tube | BD Biosciences | 352070 | |
| PCR tube | GeneMate | C-3328-1 | |
| SOC medium | Life Technologies | 15544 | |
| LB broth | BD Biosciences | 244610 | |
| Kanamycin sulfate | Fisher | BP906 | |
| Competent cells | Life Technologies | C4040 | |
| Matlab | Mathworks |
Referenties
- Braun, P., Gingras, A. C. History of protein-protein interactions: From egg-white to complex networks. Proteomics. 12, 1478-1498 (2012).
- Lasserre, R., et al. Raft nanodomains contribute to Akt/PKB plasma membrane recruitment and activation.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
