Methodenartikel

Fotogeactiveerde Localization Microscopie met Bimoleculaire Fluorescentie Complementatie (BiFC-PALM)

DOI:

10.3791/53154

⸱

22 december 2015

 ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Oregon Health and Science University, 2Knight Cancer Institute, Oregon Health and Science University, 3OHSU Center for Spatial Systems Biomedicine, Oregon Health and Science University

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Eiwit-eiwit-interacties worden in cellen met een ruimtelijke resolutie van nanometer gevisualiseerd door bimoleculaire fluorescentie-complementatie (BiFC) te combineren met fotogeactiveerde lokalisatiemicroscopie (PALM). Hier wordt het gebruik van BiFC-PALM beschreven voor het beeldvormen van Ras-Raf-interacties in U2OS-cellen voor het visualiseren van de nanoschalige clustervorming en diffusie van individuele Ras-Raf-complexen.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Eiwit-eiwit interacties (PPI's) zijn belangrijke moleculaire gebeurtenissen in de biologie. Het blijft echter een uitdaging om PPI's met voldoende resolutie en gevoeligheid in cellen te visualiseren, omdat de resolutie van conventionele lichtmicroscopie beperkt is tot ongeveer 250 nm door diffractie. Door bimoleculaire fluorescentie-complementatie (BiFC) te combineren met fotogeactiveerde lokalisatiemicroscopie (PALM), kunnen PPI's in cellen worden gevisualiseerd met gevoeligheid voor enkele moleculen en een ruimtelijke resolutie van nanometer. BiFC is een veelgebruikte techniek voor het visualiseren van PPI's met fluorescentiecontrast, die het splitsen van een fluorescent eiwit in twee niet-fluorescente fragmenten omvat. PALM is een recente superresolutie microscopietechniek voor het beeldvormen van biologische monsters op de nanometer- en enkele molecuulschaal, die fototransformeerbare fluorescente sondes gebruikt, zoals fotoactiveerbare fluorescente eiwitten (PA-FP's). BiFC-PALM werd gedemonstreerd door het splitsen van PAmCherry1, een PA-FP compatibel met PALM, vanwege zijn monomere aard, goede helderheid voor enkele moleculen, hoge contrastverhouding en bruikbaarheid voor stoichiometrische metingen. Wanneer gesplitst tussen aminozuren 159 en 160, kan PAmCherry1 worden gemaakt tot een BiFC-sonde die efficiënt reconstitueert bij 37 °C met hoge specificiteit voor PPI's en lage niet-specifieke reconstituuring. De Ras-Raf-interactie wordt gebruikt als voorbeeld om te laten zien hoe BiFC-PALM helpt om interacties op nanometerschaal en met resolutie voor enkele moleculen te onderzoeken. Hun diffusie kan ook worden gevolgd in levende cellen met behulp van single molecule tracking (smt-) PALM. In dit protocol worden factoren besproken waarmee rekening moet worden gehouden bij het ontwerpen van de fusie-eiwitten voor BiFC-PALM, worden stapreparatie, beeldverwerving en data-analysestappen uitgelegd, en worden enkele voorbeeldresultaten getoond. BiFC-PALM biedt hoge ruimtelijke resolutie, specificiteit en gevoeligheid, en is een nuttige tool voor het bestuderen van PPI's in intacte biologische monsters.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Eiwit-eiwit interacties (PPI) zijn van fundamenteel belang voor de biologie 1 en zijn strak gereguleerd via spatiotemporele mechanismen heel veel tijd en lengteschalen. Studies on cell signaling op het celmembraan, bijvoorbeeld, zijn dynamische, nanoschaal ruimtelijke compartimenten specifieke PPI en cellulaire processen 2 vergemakkelijken geopenbaard. Vandaar dat de mogelijkheid om protonpompremmers in biologische systemen sonde met voldoende ruimtelijke en temporele resolutie, hoge specificiteit en hoge gevoeligheid is de sleutel tot het bereiken van een mechanistisch begrip van de biologie.

Bimoleculaire fluorescentie complementatie (BiFC) is één van de weinige bestaande instrumenten voor het visualiseren van PPI's in een cel met subcellulaire resolutie en live-cell compatibiliteit 3-5. De techniek is relatief eenvoudig en omvat splitsing van een fluorescentie-eiwit in twee niet-fluorescerende fragmenten; wanneer genetisch gelabeld twee interagerende eiwitten enin de nabijheid komt, kunnen de fragmenten reconstrueren tot een volledig fluorescent eiwit vormen, waarbij fluorescent signaal. Indien juist ontworpen, mag BiFC probes niet spontaan reconstitueren in afwezigheid van protonpompremmers. Als zodanig zal het fluorescentiesignaal in een BiFC assay alleen voordoen in aanwezigheid van protonpompremmers, die directe visualisatie van protonpompremmers met hoge specificiteit mogelijk maakt. Bijkomende voordelen van het gebruik van fluorescentie als uitlezing zijn hoge gevoeligheid, subcellulaire resolutie, en compatibiliteit met hoge doorvoer en hoge gehalte screeningstesten, onder anderen. Om deze voordelen is een aantal BiFC probes op basis van verschillende bovenliggende fluorescente proteïnen ontwikkeld. Zoals in alle andere detectietechnieken gebaseerd op conventionele lichtmicroscopie echter de ruimtelijke resolutie van BiFC beperkt tot ~ 250 nm door diffractie van licht. Dit maakt het een uitdaging om de regulering van de PPI's bestuderen op nanoschaal, die, zoals eerder gezinspeeld en geïllustreerd door lipid rafts 6 and Ras nanoclusters 7, is een kritische lengte schaal om het begrijpen van vele cellulaire processen zoals signalering.

BiFC is gecombineerd met fotogeactiveerde lokalisatie microscopie (PALM) 8,9 om deze limiet in de ruimtelijke resolutie te overwinnen voor het afbeelden van PPI 10. PALM is een recente superresolutiemicroscopie techniek die de diffractielimiet in fluorescentie beeldvorming door middel van stochastische activering en subdiffractive lokalisatie van enkele fluorescerende moleculen omzeilt. In elke cyclus activatie, een fluorescent molecuul geeft een paar honderd tot een paar duizend fotonen en geeft aanleiding tot een enkel beeld molecule op de detector. Terwijl het beeld buigingsbegrensde (~ 250 nm breed), het zwaartepunt kan worden bepaald met een veel hogere nauwkeurigheid, typisch in de orde van 10-50 nm afhankelijk van het aantal gedetecteerde fotonen. Door het activeren en het lokaliseren van elke fluorescerende moleculen in het monster, kan een hoge resolutie worden gereconstrueerd. Performed op levende cellen, enkel molecuul volgen (smt-) PALM verdere vergunningen overname van duizenden eiwit diffusie trajecten van een enkele cel 11. Belangrijk PALM gebruikt gespecialiseerde fluorescente probes zoals activeerbare fluorescente eiwitten (PA-KP) stochastische activatie bereiken. Aangezien zowel BiFC en PALM gebruik fluorescerende eiwitten, werden zij gecombineerd door het splitsen PAmCherry1, een veelgebruikte PA-FP voor PALM, in twee fragmenten tussen aminozuren 159 en 160.

Het BiFC systeem op basis van split PAmCherry1 toont lage achtergrond signaal van spontane reconstructie van de twee fragmenten. Bij genetisch gelabeld met een paar interagerende eiwitten, de twee fragmenten (RN = residuen 1-159; RC = Met + residuen 160-236) efficiënt gereconstitueerd volledige PAmCherry1 eiwitten ook bij 37 ° C en zonder incubatie bij lagere temperaturen ontstaan, waardoor is niet het geval voor andere BiFC paren 12, zoals de ouder mCherry 13. Furthermoopnieuw, de opgeloste PAmCherry1 eiwit behield de fotofysische eigenschappen van de moedermaatschappij PAmCherry1, zoals hoge contrast ratio, medium foton opbrengst, en snel fotoactivatie, onder anderen, die kritisch zijn voor accurate single molecule lokalisatie en hoge-resolutie PALM beeldvorming zijn.

In dit protocol, het gebruik van BiFC-PALM voor beeldvorming van Ras-Raf interacties in U2OS cellen door het gebruik van split PAmCherry1 (figuur 1A) wordt beschreven. De eerste stap is om de constructen te ontwerpen voor expressie fusieproteïnen tussen PAmCherry1 fragmenten (dat wil zeggen, RN en RC) en de eiwitten van belang. In theorie, voor elk paar kandidaateiwitten (A en B) zijn er acht paren fusie-eiwitten te onderzoeken: RN-A / RC-B; RN-A / B-RC; RC-A / RN-B; RC-A / B-RN; A-RN / RC-B; A-RN / B-RC; A-RC / RN-B; en A-RC / B-RN. Deze werkwijze kan vaak worden vereenvoudigd door rekening te houden met de structurele of biochemische eigenschappen van de kandidaat eiwitten. Bij Ras, het eiwitpost-translationeel gemodificeerd aan het C-terminale CAAX box (C = Cys; A = alifatisch; X = elk), waarna de AAX motief wordt afgesplitst. Vandaar RN of RC kan alleen worden gefuseerd aan de N-terminus van Ras; dit vermindert het aantal fusieproteïne paren vier (Figuur 1B). Voor Raf, de Ras-bindend domein (RBD; resten 51-131) wordt gebruikt en kan worden gelabeld aan beide zijden. Deze vier fusion configuraties werden gegenereerd: RN-KRAS / RC-Raf RBD; RN-KRAS / Raf RBD-RC; RC-KRAS / RN-Raf RBD; en RC-KRAS / Raf RBD-RN.

Bovendien zal de linker tussen de fragmenten en de eiwitten van belang te worden overwogen. Een flexibele linker van ongeveer tien aminozuren wordt vaak gebruikt omdat het voldoende vrijheid complementatie optreden. Een dergelijke linker is (GGGGS) x2, maar er zijn vele anderen die met succes zijn toegepast, met inbegrip van willekeurige sequenties gegenereerd uit een meervoudige kloneringsplaats (MCS) 14. De lengte van de linkers moet mogelijk worden geoptimaliseerd DependinG van de grootte van de eiwitten van belang en de oriëntaties in de omgang.

De PAmCherry1 fragmenten worden opgenomen in een kleine klonen backbone met flankerende MCSs (zie Materials List). Genen van belang kan worden ingebracht via de restrictieplaatsen of een ligatie onafhankelijke methode. Na kloneren en sequentieverificatie, wordt de expressiecassette overgebracht in een expressievector onder toepassing van een recombinase reactie, een klonen met hoge betrouwbaarheid en hoge efficiency.

Vervolgens worden de resulterende expressieconstructen getransfecteerd in de doelwitcellijn of, indien een stabiele cellijn is gewenst, verpakt in lentivirus voor het infecteren van de doelcellijn. Transiënte transfectie maakt een snelle validatie van de BiFC configuraties, maar potentiële problemen worden aangehouden. Transfectie met behulp van chemicaliën vaak benadrukt de cellen, wat resulteert in hoge autofluorescentie; terwijl het gebruik van totale interne reflectie fluorescentie (TIRF) Micrpy kan deze achtergrond signaal te verzachten door het beperken van de verlichting volume, TIRF ideaal wanneer de PPI's vinden plaats op de celmembraan. Bovendien transiënte transfecties leiden vaak tot hoge niveaus van eiwitexpressie, ver boven die van de endogene eiwitten die artefacten in het detecteren van de PPI kan veroorzaken. Daarom wordt aanbevolen dat stabiele cellijnen worden vastgesteld na een passende BiFC configuratie is vastgesteld door de eerste testen. Stabiele cellijnen hebben ook het potentieel voor afstembare expressie via doxycycline inductie 15.

Na infectie worden cellen geselecteerd met antibiotica, meestal puromycine en neomycine, één voor elk construct. De volgende stappen voor de monstervoorbereiding, beeldacquisitie en data-analyse wordt in detail beschreven in de protocollen.

Bij deze benadering worden de vorming van clusters op nanoschaal BiFC-PALM beelden van Ras-Raf RBD routinematig waargenomen (Figuur 2A </ strong>). Consequent, SMT-PALM trajecten van Ras-Raf RBD vertonen een heterogene verdeling in de diffusie staten (figuur 2B-D). Deze resultaten suggereren dat Ras-Raf-complexen bestaan ​​meerdere toestanden op het celmembraan, vermoedelijk als monomeren en clusters, met potentiële biologische implicaties. Dit werk demonstreert de kracht van BiFC-PALM selectieve beeldvorming van protonpompremmers in cellen met nanometer ruimtelijke resolutie en gevoeligheid single molecule, die moeilijk te verkrijgen met gebruikelijke BiFC fluorescentie co-lokalisatie of fluorescentie-energieoverdracht (FRET) zijn.

Bij het ontwerpen van BiFC experimenten en interpretatie van de resultaten, is het belangrijk in het achterhoofd dat de BiFC proces onomkeerbaar is in de meeste gevallen, waaronder split PAmCherry1 te houden. Wanneer de twee fragmenten samen en vormen een volledige PAmCherry1 eiwit, de koppeling tussen de twee fragmenten, en daarmee de PPI permanent wordt. Dit beperkt het gebruik van BiFC en BiFC-PALM toezicht op de dynamiek van de protonpompremmers (bijv bindingskinetiek en niet de diffusie dynamiek van het eiwit complex eenmaal is gevormd) en soms zelfs kan leiden tot mislocalisatie van de PPI complexen.

Een bijkomende factor om te overwegen bij het ontwerpen BiFC PALM-experimenten is de vertraging in rijpingsproces chromofoor die inherent is aan fluorescente proteïnen. Zodra twee eiwitten interageren en de FP fragmenten samenkomen, ze meestal te hervouwen in de orde van seconden (rust van 60 seconden voor EYFP 3). Latere chromofoor rijping en fluorescerend signaal voort in de orde van minuten. Terwijl de fluorescentie detecteerbaar kan zijn binnen 10 minuten na oplossen van split-Venus, een snel vouwen YFP-variant, de half-time voor de rijping in het algemeen vaak rond 60 min 16. Split-PAmCherry1 werd waargenomen op vergelijkbare tarieven. Vandaar BiFC en BiFC-PALM zijn slechte keuzes voor het monitoren van real-time PPI kinetiek; andere methods, zoals FRET en een recent ontwikkelde afhankelijke dimerisatie fluorescent eiwit 17, kunnen meer geschikt voor dit doel.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Klonen

  1. Bepaal de configuraties te klonen en kies een linker. Tag-eiwitten met de fragmenten op het N- of C-terminus zoals hieronder beschreven zodat ze niet de juiste lokalisatie verstoren. Gebruik een flexibele linker, zoals (GGGGS) x2.
  2. Genetisch tag de eiwitten van belang aan de PAmCherry1 fragmenten. Als een optie, gebruik maken van de klonen in de materialen lijst met de fragmenten RN (PAmCherry1 residuen 1-159) en RC (Met plus PAmCherry1 resten 160-236) met flankerende MCS sequenties vermeld plasmiden.
    1. Lineariseren de plasmiden die de fragmenten RN en RC inverse PCR (of restrictiedigestie) op het invoegpunt. Primers voor omgekeerde PCR zijn vermeld in tabel 1. Hieronder is een voorbeeld PCR-protocol dat wordt gebruikt in het lab van de auteur (zie Materials List voor de exacte gebruikte materialen in dit protocol).
      1. Meng de PCR-reactie samen gebracht tot een eindvolume van 50 pl met water: een dunwandigeed PCR-buis, voeg het water, 25 pi 2x master mix, 0,5 pi van elk van de voorwaartse en achterwaartse primers (20 uM verdund voorraad, 0,2 uM uiteindelijke concentratie) en 1 ng van het template. Gebruik de volgende cycling condities: 98 ° C gedurende 30 seconden, 30 cycli van 98 ° C gedurende 7 seconden en 68 ° C gedurende 2 min, en een uiteindelijke verlenging bij 72 ° C gedurende 10 min.
    2. PCR de genen van belang voor insertie met de gelineariseerde plasmiden die RN en RC fragmenten. Voer de PCR zoals in stap 1.2.1 de verlengingstijd bij 68 ° C. Gebruik primers met overhangen die een flexibele linker sequentie bevatten, zoals GGAGGTGGAGGTAGTGGTGGAGGTGGAAGT voor (GGGGS) x2 en 15 basenpaar homologie met de uiteinden van het gelineariseerde RN en RC plasmiden voor recombinatie.
      Opmerking: De primer overhangen voor eiwitten van belang zijn in Tabel 2 bij gebruik van de primers die in Tabel 1 de plasmideskelet lineariseren.
    3. Digest de PCRreactie met Dpn1 de PCR-matrijs te elimineren. Voeg 0,5 gl Dpn1 (20 U / ul) direct naar 50 ul PCR reactie. Incubeer bij 37 ° C gedurende 1 uur en warmte inactiveren bij 80 ° C gedurende 20 min. Als achtergrond sjabloon volhardt in latere stappen, verhoging van het enzym bedrag of het verlengen van de spijsvertering tijd.
    4. Zuiveren de PCR producten via een spin kolom zoals beschreven door de fabrikant.
    5. Voer een onafhankelijke ligatie-reactie op een gelineariseerde plasmide dat een RN of RC fragment met het gen van interesse te combineren. Meet de concentratie van de gezuiverde PCR producten: combineer 50 ng gelineariseerde plasmide en 50 ng van het gen van belang met 1 gl enzym premix en breng het totale volume 5 pl met gedeïoniseerd water. Incubeer bij 50 ° C gedurende 15 min, plaats op ijs en voeg 20 ul TE-buffer.
    6. Transformeren recombinante plasmiden in competente bacteriën 18.
    7. Selecteer 2-4 + (naar wens) kolonies voor O / N cultuur. Voeg 5 mlLB bouillon en 5 ul kanamycine (50 mg / ml voorraad) in een 14 ml polypropyleen buis met ronde bodem en voeg de gekozen bacterie kolonie met een gesteriliseerde entnaald. Incubeer bij 37 ° CO / N onder schudden bij 225 rpm.
    8. Freeze 1 ml O / N kweek van glycerol 19 en miniprep de rest als beschreven door de fabrikant.
    9. Voer sequencing een goede kloon te bepalen. Bij gebruik van plasmiden van de klonen in de Materials List, voorwaartse en achterwaartse M13 gebruiken primers (in afzonderlijke reacties) als nodig is om de volledige sequentie van het fusieconstruct te verkrijgen. Vergelijk met de verwachte volgorde met behulp van een alignment tool zoals BLAST van het National Center for Biotechnology Information (NCBI) - http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/BlastAlign.cgi.
    10. Breng de sequentie geverifieerd constructen een expressieplasmide via een recombinase reactie.
      1. Voeg 75 ng van het plasmide bestemming & #8212; zoals pcDNA voor transiënte transfecties of pLenti voor lentivirale verpakking 20 - en 50 ng van het recombinante plasmide klonen met 1 gl enzym premix en brengen het totale volume 5 pl met gedeïoniseerd water. Incubeer bij 25 ° C gedurende 1 uur, voeg dan 5 ui TE-buffer.
        Opmerking: Voor lentivirale verpakking en stabiele cellijn generatie, gebruikt een andere bestemming plasmide per construct, bijvoorbeeld een met puromycine resistentie en andere neomycine. Dit maakt dubbele selectie van getransduceerde cellen. Ook de promotor voor elk, zoals de constitutieve cytomegalovirus (CMV) promoter voor hoge expressieniveaus of CMV de TetO operator afstembare doxycycline-gereguleerde expressie.
      2. Transformeren 5 ul in competente bacteriën en miniprep de plasmiden als in de stappen 1.2.6 tot 1.2.8, maar met de juiste antibiotica (meestal ampicilline).
  3. Bepaal de optimaleBiFC configuratie.
    1. Co-transfecteren expressieplasmiden in U2OS cellen (of een cel van keuze).
      1. Voeg 350 ul fenol rood-vrij en antibiotica-vrij DMEM aangevuld met 10% FBS in elk putje van een 8-well 1,5 glazen onderkamer slide. Plate ongeveer 7,5 x 10 4 cellen per putje zodat cellen ongeveer 70% -90% confluent de volgende dag.
      2. De dag na plating, co-transfecteren expressieplasmiden met verschillende configuraties in elk putje met behulp van de geprefereerde reagens en zoals beschreven door de fabrikant.
        1. Voor elk putje, voeg 125 ng van elk expressieplasmide in 50 gl serumvrij medium gereduceerd in een 0,6 ml buis pipet op en neer te mengen. Voeg 1 ul van het transfectie reagens in het midden van de buis rechtstreeks in de media. Schud voorzichtig te mengen en laat de reactie te zitten voor 30 min.
        2. Vermindering van de media in elk putje van de kamer dia met ongeveer de helft. Voeg het transfectiemengsel druppelsgewijs aan de putjes en schud gently te mengen. Incubeer cellen bij 37 ° C en 5% CO2 gedurende 24-48 uur. Wijzig de media de dag na transfectie.
    2. Afbeelding cellen op een fluorescentiemicroscoop zoals in protocol 2 vanaf stap 2.1.4.
      Opmerking: Het monster kan worden afgebeeld op een standaard fluorescentiemicroscoop of de expressieniveaus zijn hoog en de camera is gevoelig genoeg voor de relatief lage foton uitgang van PAmCherry1. Opgeloste PAmCherry1 moleculen kunnen worden geactiveerd met een ultra violet filter set (405 nm) voorafgaand aan beeldvorming met een groen excitatie (561 nm) filter set.
  4. Eventueel maakt een negatieve controle door bijvoorbeeld het introduceren van een puntmutatie in een van de eiwitten van belang dat de interactie verstoort. Voer een plaatsgerichte mutagenèse 21 over het klonen plasmide van het eiwit te muteren en de gekozen configuratie.
  5. Genereren van een stabiele cellijn door het verpakken van de constructen in viraledeeltjes en infecteren U2OS cellen (of cellijn naar keuze). Overweeg een induceerbare (tetracycline) expressie systeem 15, zodat expressie kan voorafgaand worden aangezet om het afbeelden wanneer langdurig onomkeerbaarheid van BiFC is een probleem, of als afstembare expressie gewenst is.
    LET OP: Het werken met virussen is geclassificeerd als Biosafety Level 2. Terwijl recente generaties van virale verpakkingssystemen hebben sterk de kans op het produceren van replicatie-competente virussen verminderd, sommige risico's zijn nog steeds aanwezig. Referenties kan gevonden worden op http://www.cdc.gov/biosafety/publications/.
    1. Herhaal stap 1.2.10 met een lenti- of retrovirale bestemming vector 20. Verhoging van de O / N kweek tot 100 ml voor een Midiprep en grotere zuiverheid van de plasmiden.
    2. Op Dag 1: Plate ongeveer 2 x 10 6 293T / 17 cellen in een 10 cm schaal voor elk construct te verpakken.
    3. Op dag 2: Maak een transfectie reactie met behulp van een transfection reagens keuze en zoals beschreven door de fabrikant.
      1. Bereid een voormengsel verpakking plasmiden met eindconcentraties van 250 ng / ul verpakken plasmiden 1 en 2 en 100 ng / ul voor het verpakken plasmide 3 in steriel water. Voeg 10 ul van de pakking plasmide voormengsel en 2,5 ug van het plasmide doel om 1 ml serumvrij medium gereduceerd in een 5 ml polypropyleen buis met ronde bodem en de pipet op en neer te mengen. Voeg 20 ul van transfectie reagens in het midden van de buis rechtstreeks in de media.
        1. Schud voorzichtig te mengen en incuberen bij kamertemperatuur gedurende 30 min. Verwijder ongeveer de helft van de media uit de cellen en voeg de transfectie mengsel in een druppelsgewijze manier. Schud voorzichtig te mengen en incuberen bij 37 ° C en 5% CO2. Incubeer 10 ml van media per plaat in een buis met de dop los voor temperatuur en CO 2 evenwicht brengen.
      2. Op Dag 3: Verander je media met gepreïncubeerd media en return de cellen naar de incubator. Incubate een andere buis van de media met de dop los.
        Opmerking: syncytia of de vorming van grote multi-kernhoudende cellen, een teken dat het verpakkingsmateriaal zal worden. Cellen in een kwetsbare toestand en kan gemakkelijk worden losgemaakt. Ander materiaaltype, kantelt de pipet zodat deze horizontaal en voeg de media druppelsgewijs in een rand van de plaat.
      3. Op dag 4: Oogst het virus door het verwijderen van de media met een spuit en filtreren door een 0,45 urn poriegrootte in een schone 50 ml buis. Vervang het medium voorzichtig met de vooraf geïncubeerd media.
      4. Op dag 5: Harvest weer zoals eerder gedaan in stap 1.5.3.3 en combineer gemeenschappelijke filtraat in dezelfde 50 ml buis. Voeg 6 ml van het virus concentrator aan elke buis en meng. Bewaar bij 4 ° C gedurende ten minste 24 uur totdat het virus precipitaten.
        Opmerking: Afhankelijk van de gezondheid van de cellen, kan een virus 3 keer geoogst.
      5. Concentreer het virus door centrifugeren bij 1500 xggedurende 15 min bij 4 ° C. Zuig het supernatant en resuspendeer de pellet in 250 pl medium. Virus kan direct worden gebruikt voor infectie of opgeslagen in 50 pi aliquots bij -80 ° C gedurende maximaal een jaar.
      6. Plate ongeveer 3 x 10 5 U2OS (of doel) cellen per putje in een 6-wells plaat (2 ml DMEM met 10% FBS per putje) geïnfecteerd, zodat cellen ongeveer 50% confluent op het moment van infectie.
      7. De volgende dag, verwijder de helft van de media, zodat ongeveer 1 ml overblijft. Coinfect met 50 ul geconcentreerd virus voor elk construct. Voeg 1 ul polybreen (8 mg / ml) aan elk putje. Incubeer bij 37 ° C en 5% CO2. Wijzig de media de volgende dag en incubeer gedurende één dag voor antibiotische selectie.
        Opmerking: De hoeveelheid virus te voegen kan variëren afhankelijk van de gewenste omvang van de besmetting. Virussen kunnen worden getitreerd met behulp van qRT-PCR.
      8. Antibiotica toe te voegen om te selecteren voor geïnfecteerde cellen. Aparte putten met niet-geïnfecteerde cellen die niet hebben gezien virus dienen als kanaries om de werkzaamheid van de selectie te testen. Incubeer gedurende 2-7 dagen of totdat de selectie is voltooid.
        Opmerking: Effectieve concentraties moet aanvankelijk worden getitreerd, maar zij typisch 1,0 ug / ml van puromycine en 1,0 mg / ml neomycine.
      9. Uitbreiding van de cellen in een grotere 10 cm schotel en ga verder met Protocol 2.

2. Imaging Vaste Cellen

  1. Bereid een monster voor beeldvorming
    1. Reinig een 8-well 1,5 glazen onderste kamer schuif door toevoeging van 250 gl 1 M NaOH gedurende ten minste 1 uur en grondig wassen met PBS.
      Opmerking: Onbehandelde kamer dia's doorgaans resulteren in hoge achtergrond signaal. Bovendien kunnen cellen gevoelig resterende NaOH en het niet het glasoppervlak grondig reinigen (liefst 10x wassen) kan celhechting moeilijk maken. Eventueel incubeer de gereinigde kamer dia met PBS O / N na het wassen. Voor gevoelige cellijnen, plating op een hogere dichtheid(Bijvoorbeeld op 50% -60% aanvankelijke samenvloeiing) kan helpen.
    2. Plate ongeveer 5,5 x 10 4 van de U2OS stabiele expressie cellen per putje in 350 pl fenolrood-vrij DMEM met 10% FBS, zodat cellen gezond en niet meer confluent bij beeldvorming.
    3. Voer noodzakelijke behandelingen voor het experiment, zoals het toevoegen van tetracycline om eiwitexpressie te induceren.
    4. Bevestig de cellen onmiddellijk voor beeldvorming.
      1. Voorafgaand aan de fixatie, voor te bereiden verse paraformaldehyde (PFA) oplossing - 3,7% PFA in 1x PHEM met 0,1% glutaraldehyde (GA). Voor 10 ml PFA oplossing Weeg 0,37 g PFA en overbrengen naar een 1,5 ml microcentrifugebuis. Voeg 1 ml gedestilleerd water en 30 gl 1 M NaOH en vortex. Verhit bij 70 ° C en vortex elke 1-2 min totdat PFA volledig is opgelost.
      2. Transfer opgelost PFA een 15 ml conische buis en voeg 3,8 ml gedestilleerd water, 5 ml 2 x PHEM-buffer, 20 pl 25% glutaaraldehyde en vortex mengen. Voorraad, 2x PHEM buffer 120 mM PIPES, 50 mM HEPES, 20 mM EGTA en 16 mM MgSO 4, met een pH bijgesteld tot 7,0 met 10 M KOH. Deze fixerende oplossing kan worden bewaard bij 4 ° C gedurende enkele dagen.
        LET OP: PFA en Georgië zijn allebei gevaarlijk. Bereid de oplossing in een zuurkast en draag de juiste beschermende uitrusting bij de omgang met beide chemicaliën. Vermijd inademing of direct contact met de huid.
      3. Verwijder het groeimedium. Snel wassen met 500 pi PBS en voeg 250 ul van de PFA fixeermiddel per putje. Incubeer de cellen gedurende 20 min bij kamertemperatuur.
    5. Verwijder de PFA fixeermiddel uit het monster en voeg 350 ul PBS of imaging buffer (100 mM Tris met 30 mM NaCl en 20 mM MgCl2, pH 8,5) per putje.
    6. Vortex 100 nm gouddeeltjes te breken aggregaten en voeg 35 ul per putje (10x de uiteindelijke verdunning) voor het volgen van het podium drift tijdens de beeldvorming.
  2. Acquire beelden
    1. Schakel de microscoop. Macht op de 405 en 561 nm lasers, maar houd de luiken(intern of extern) gesloten op dit moment. Schakel de EMCCD camera en laat het afkoelen. Zorg ervoor dat de 561 nm filters op hun plaats zitten.
    2. Open de acquisitie software en stel de belichtingstijd tot 100 msec en de EMCCD winst tot 300 (bereik 1 - 1000).
    3. Voeg immersie olie aan het doel en zet het monster op de microscoop podium.
    4. Met ofwel helder veld of 561 nm laser op (~ 1 kW / cm2), breng het monster in focus.
    5. Voor het afbeelden van Ras en andere membraaneiwitten, gebruik dan een 60X Apochromat TIRF doelstelling met 1,49 numerieke opening en breng de microscoop in TIRF configuratie. Stel de excitatie laser, zodat deze off-gecentreerd bij het raken van de achterkant opening van de TIRF doelstelling; Dit zorgt ervoor dat de laser af te buigen bij het bereiken van het monster. Houd het instellen van de laser totdat de kritische hoek bereikt is en de laser wordt teruggekaatst. Zoeken naar een cel om afbeelding met meerdere gouddeeltjes in zicht. Stel een regio van belangdat omsluit de cel (of een gebied in de cel) en de gouddeeltjes.
      Opmerking: TIRF vermindert de penetratie diepte van de excitatie laser en vermindert de achtergrond van de focus signaal. Daarnaast drift correctie waarschijnlijk nauwkeuriger worden wanneer gouddeeltjes in het zicht.
    6. Indien beschikbaar, grijpen het autofocussysteem te corrigeren voor sample drift in de z-richting. Anders, de scherpstelling handmatig gedurende de overname als het beeld gaat onscherp.
    7. Begin verwerving met 405 nm laser uitgeschakeld en de 561 nm laser op (~ 1 kW / cm2) bij voldoende activatie reeds plaatsvindt (gewoonlijk als expressieniveaus zijn hoog). Anders, zet de 405 nm laser aan scherpe fabriek vermogensinstelling (0,02 mW of 0,01 W / cm 2) en geleidelijk te verhogen (0,1 mW per keer) als nodig tot er tientallen moleculen per frame of dat enkele moleculen zijn goed van elkaar gescheiden.
    8. Als data-acquisitie blijft, gradually verhogen 405 nm laservermogen naar de plek dichtheid ongeveer constant te houden.
      Opmerking: Bij lagere 405 nm excitatie kracht, kunnen sommige PAmCherry1 al geactiveerd worden. Omdat deze moleculen photobleach de populatie van resterende licht activeerbare PAmCherry1 moleculen af, die een hogere foton flux dezelfde dichtheid moleculen emitteren fluorescentie in elk frame te behouden.
    9. Doorgaan afbeelding verwerving tot 405 nm hoog vermogen (2,5-10 W / cm2) niet meer activering gebeurtenissen te activeren.
      Opmerking: De totale acquisitietijd afhankelijk van het expressieniveau en de efficiëntie van de complementatie.
  3. Verwerk de afbeeldingen
    Let op: Er zijn veel open source software-opties voor beeldverwerking. Voorbeelden zijn onweersbui (https://code.google.com/p/thunder-storm/) en QuickPALM (https://code.google.com/p / quickpalm /). De typische procedures verwerking van gegevens worden hier kort toegelicht met behulp van een aangepaste Matlab pakket genaamd wfiread voor de verwerking van PALM data als voorbeeld. Echter, toekomstige herzieningen niet precies volgen wat hier beschreven. Voor beeldverwerking met andere software, verwijzen wij u naar de gebruiker documentatie.
    1. Download de software voor beeldverwerking (Company Code File) of de laatste versie van http://www.ohsu.edu/nan. Open Matlab en laadt de wfiread software (die al wordt in het standaard pad).
    2. Bekijk het ruwe beeldsequentie en bepalen van de regio van belang. Selecteer het gebied van de stapel te verwerken door links te klikken en slepen van een kader rond het gewenste gebied. Als de regio van belang niet tijdens de acquisitie (tot ongeveer 256x256 pixels) werd gereduceerd, selecteert u een kleiner gebied op de compute tijd verminderen. Om een ​​gebied te heffen en verwerkt het gehele frame, klik met de rechtermuisknop ergens in thimage e.
    3. Voer de reeks frames te verwerken.
    4. Selecteer een gouden deeltje (een die is geïsoleerd en uniform van vorm) door links te klikken op het beeld en het slepen van een kleine doos omheen. Onder Particle Tracking, klikt u op de Track-knop. Een grafiek weergegeven waarin de positie van de geselecteerde gouddeeltje over de stapel afbeeldingen toont, die de omvang van de drift.
    5. Herhaal dit proces zoveel gouddeeltjes mogelijk te kunnen volgen en bepalen degenen die samen een (de deeltjes wordt kleurcode). Idealiter zou de totale drift in de orde van één pixel maximaal.
    6. Selecteren individueel de gouddeeltjes die samen gevolgd één tegelijk en klik op de knop Add Marker onder Particle Tracking. Een groene kruis weergegeven dat aangeeft dat is toegevoegd als een merker en wordt gebruikt om te corrigeren voor drift.
    7. Pas de Sigma Range, Smoothing Range en Drempel zo nodig door het veranderen van de waarden iets. Klik op de Find Particleknop om de instellingen te testen. De deeltjes die worden verwerkt zal worden verpakt en die dat niet zijn zal worden weggelaten. De PAmCherry1 moleculen, deeltjes die vrij rond en helder moeten worden gekozen.
    8. Beginnen met het verwerken van de beelden door te klikken op de Make Coord knop Bestand en sla het bestand.
      Opmerking: Het programma zal gaan door elk frame binnen de gedefinieerde kader range, vind alle fluorescerende vlekken, en het uitvoeren van Gauss passend bij het zwaartepunt coördinaten te vinden. Een .cor bestand wordt gegenereerd opslaan van alle coördinaten en andere passende parameters van de verwerkte enkel molecuul beelden.
  4. Post-proces imago van de PALM de beelden en maken
    Opmerking: Andere software kan direct maken het beeld na het coördineren extractie.
    1. In Matlab, start de 'palm' pakket en laad het .cor bestand zojuist hebt gemaakt.
    2. Voordat beeld PALM renderen met behulp van de coördinaten, afstand van de individuele coördinaten (elk een 'localizatiOp event '). De optimale sortering waarden kunnen variëren, afhankelijk van de installatie en fluorofoor.
      1. Voor PAmCherry1, gebruik dan de volgende waarden: Het combineren van Frame - 8; Het combineren Afstand (nm) - 100; Minimum RMS - 4; Minimum Fit Goodness - 0,25; en Max. Excentriciteit - 1.4. Zie de sectie Discussie voor bijkomende uitleg van deze parameters.
    3. Klik op de knop Sorteren om een ​​nieuwe set coördinaten klaar voor het renderen van beelden met hoge resolutie te genereren.
    4. Voer waarden in voor de juiste weergave van de uiteindelijke beeld, zoals het ruwe pixelgrootte (nm), de gewenste functie grootte (nm) in het weergegeven beeld en de pixelgrootte van de gerenderde afbeelding.
      Opmerking: De ruwe pixelgrootte moet worden bepaald voor elke installatie. De gesmolten feature size kan willekeurig worden ingesteld, maar wordt typisch ingesteld op een waarde iets hoger dan de gemiddelde lokalisatie nauwkeurigheid. Voor PAmCherry1, de gemiddelde lokalisatie precisie is ongeveer 18 nm, zodat een functie grootte van 20 - 30 nm is Aangepast decorte. Opmerkelijk was de lokalisatie nauwkeurigheid berekend door de standaardafwijking van de lokalisaties van hetzelfde molecuul meerdere frames 22 en niet door de diffractielimiet delen met de vierkantswortel van gedetecteerde aantal fotonen. Als voor de pixelgrootte van het weergegeven beeld, 10 nm is een goed uitgangspunt; het instellen van deze waarde te laag zal resulteren in onnodig grote beeldbestanden voor niet vergroot uitzicht.
    5. Klik op de knop Render het imago van de PALM genereren. Gebruik de +/- vergrootglas pictogrammen in de werkbalk van de figuur-venster om in en uit te zoomen.
    6. Optioneel: Voer cluster analyse van de gereconstrueerde beeld Palm met behulp van Ripley's K-test of andere mechanismen zoals simulatie-aided DBSCAN (SAD) 23. Opmerking: In de aangepaste palm pakket, worden beide Ripley's K en SAD analyse reeds ingebouwd; als coördinaten gegenereerd uit andere software, kunnen dezelfde analyses worden uitgevoerd met aanvullende aangepaste scripts.

3. Single Molecule Tracking in levende cellen

  1. Behandel de weefselkweek oppervlak en de plaat cellen zoals beschreven in protocol 2. Omdat de temperatuur en / of CO 2 gecontroleerde fase kan iets kweekschaal nodig, zorgen ervoor dat het dekglaasje over de juiste dikte (0,17 mm) voor microscopie setup.
    1. Transfecteren van cellen als het doen van een tijdelijke expressie en alle behandelingen die nodig zijn voor het experiment, zoals tetracycline om expressie te induceren voeren en incubeer nodig. Dit is hetzelfde als beschreven in protocol 2.
    2. Plaats de cultuur schotel op een on-stage incubator. Laat het gerecht vestigen op het podium voor een paar minuten tot de temperatuur en de CO 2 -concentratie elke keer te stabiliseren na de montage van de cultuur schotel of verhuizen naar een nieuwe regio van belang. Blok lasers bij deze stap. Als CO 2 is niet beschikbaar, veranderen in een CO 2 onafhankelijke media vlak voor beeldvorming, zoals LeibovItz's L-15.
      Opmerking: Fenol-rood-vrij medium wordt aanbevolen voor deprimerende achtergrond fluorescentie.
  2. Acquire beelden zoals in protocol 2. Stel de juiste belichting tijd (meestal 25-50 msec voor PAmCherry1).
    Opmerking: De molecule dichtheid moet lager zijn dan voor gefixeerde cellen zodat trajecten kunnen opgenomen worden zonder elkaar overlappen. De gespecificeerde enkele tientallen moleculen typisch is voor een 256x256 pixel verkrijgen met een resolutie van ongeveer 160 nm. De 561 nm laser vermogensdichtheid werd ingesteld op 0,8 kW / cm 2 een goede signaal-ruisverhouding behouden bij een lagere fototoxiciteit cellen en verhoging van de gemiddelde trajectlengte.
  3. Verwerk de afbeeldingen.
    1. Extract coördinaten van enkele moleculen met de wfiread pakket zoals beschreven in Protocol 2, of met een ander pakket.
    2. Reconstrueren enkel deeltje trajecten met behulp van verschillende enkel deeltje volgen pakketten (SPT) op basis van verschillende algoritmes gevondenelders 24. Opmerking: Als alternatief kan deze stap worden uitgevoerd met behulp van zelfgebouwde Matlab-pakket (eventueel in toekomstige herzieningen op http://www.ohsu.edu/nan.
    3. Optioneel: Na de reconstructie, gebruik een SPT pakket 24 tot verplaatsing en diffusieconstanten berekenen op basis van de trajecten. Bovendien gebruiken variationele Bayes single-particle tracking (vbSPT) 25 diffusie staten van de doeleiwitten te bepalen. vbSPT Matlab-pakket en de documentatie is te vinden op de officiële website Sourceforge: http://vbspt.sourceforge.net/.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De BiFC-PALM getoonde voorbeeld is Kras G12D mutant interactie met de Ras-bindend domein (RBD) van craf (Figuur 1A). Zoals besproken werden de RN of RC fragmenten niet gelabeld aan de C-terminus van Ras omdat de membraanlokalisatie en dus de biologische activiteit van Ras zou verstoren. Dit verminderde de mogelijke combinaties 8-4 (Figuur 1B). Elk van deze vier combinaties werd ingebracht in cellen met behulp U2OS lentivirale infectie. De cellen werden vastgesteld zoals beschreven in he...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

BiFC is een veelgebruikte techniek voor het opsporen en visualiseren van PPI in cellen geweest, terwijl PALM is een recente single molecule superresolutiemicroscopie techniek die nanoschaal beeldvorming van intacte biologische monsters mogelijk maakt. De combinatie van BiFC met PALM bereikt selectieve beeldvorming van PPI's in een cel met nanometer ruimtelijke resolutie en single molecule gevoeligheid. BiFC-PALM breidt het nut van beide technieken, en zoals aangetoond in dit werk toont grote belofte in het openbaren...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs danken Drs. Steven Chu en Joe W. Gray voor nuttige discussies, Henry Marr voor zijn initiële werk aan het BiFC-PALM project, en Alexis Shoemaker voor haar technische assistentie. Dit werk wordt ondersteund door opstartfondsen aan X.N. van OHSU. Het onderzoek in het Nan laboratorium werd ook ondersteund door NIH 5U54CA143836-05, de Damon Runyon Cancer Research Foundation, de M. J. Murdock Charitable Trust en de FEI-onderneming.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Microscope frameNikonTi-U
60X oil immersion TIRF objective with 1.49 NANikonCFI Apo TIRF 60x H
EMCCD cameraAndoriXon Ultra 897
561 nm laserOpto EngineMGL-FN-561
405 nm laserCoherentCUBE-405 50mW
561 nm dichroic mirrorSemrock Di01-R405/488/561/635-25x36
561 nm filterSemrockFF01-525/45-25
405/561 nm notch filterSemrockNF01-405/488/568-25
Temperature and CO2 controlled stageTokai HitINUBG2ATW-PLAM
pENTR-D-TOPO-PAmCherry1_1-159-MCSAddgene60545
pENTR-D-TOPO-PAmCherry160-236-MCSAddgene60546
pcDNA3.2-DESTLife Technologies12489-019
pLenti-DESTAddgenehttp://www.addgene.org/Eric_Campeau/
Phusion High-Fidelity DNA PolymeraseThermo ScientificF-531
In-Fusion HD CloningClontech639649
LR ClonaseLife Technologies11791
Vira Power Lentivirus PackagingLife TechnologiesK497500
X-tremeGENE Transfection ReagentRoche13873800
Lab-Tek II Chambered CoverglassThermo Scientific155409#1.5 glass bottom dishes
U2OS cellsATCCHTB-96
293T/17 cellsATCCCRL-11268
DMEM with phenol redLife Technologies11995
DMEM no phenol redLife Technologies21063
Fetal bovine serumLife Technologies10082
Leibovit's L-15, no phenol redLife Technologies21083-027
Reduced serum mediumLife Technologies31985
Phosphate Buffered SalineLife Technologies14040
SyringeBD Biosciences309604
Syringe filterMilliporeSLHV033RB
Lentiviral concentratorClontech631231
Retroviral concentratorClontech631455
10 cm culture dishBD Biosciences353003
6-well culture plateBD Biosciences353046
PolybreneSigma107689
PuromycinLife TechnologiesA11138
G-418Calbiochem345812Neomycin
DoxycylineFisherBP2653
Tris baseFisherBP152
EDTASigmaEDS
Sodium HydroxideSigmaS5881
ParaformaldehydeSigma158127
GlutaraldehydeSigmaG6257
PIPESSigmaP6757
HEPESSigmaH4034
EGTASigma3777
Magnesium SulfateSigmaM2643
Potassium HydroxideSigma221473
Sodium chlorideFisherBP358
Magnesium chlorideFisherM33
100 nm gold particlesBBI SolutionsEM.GC100
Molecular grade waterLife Technologies10977
Dpn1New England BiolabsR0176
PCR purification kitQiagen28104
Miniprep kitQiagen27104
Midiprep kitMacherey-Nagel740410
0.6 ml microcentrifuge tubesFisher05-408-120
1.5 ml microcentrifuge tubesFisher05-408-137
15 ml tubesFisher05-539-12
5 ml polypropylene round-bottom tubesBD Biosciences352063
14 ml polypropylene round-bottom tubesBD Biosciences352059
50 ml tubeBD Biosciences352070
PCR tubeGeneMateC-3328-1
SOC mediumLife Technologies15544
LB brothBD Biosciences244610
Kanamycin sulfateFisherBP906
Competent cellsLife TechnologiesC4040
MatlabMathworks

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Braun, P., Gingras, A. C. History of protein-protein interactions: From egg-white to complex networks. Proteomics. 12, 1478-1498 (2012).
  2. Lasserre, R., et al. Raft nanodomains contribute to Akt/PKB plasma membrane recruitment and activation. Nat. Chem. Biol. 4 (9), 538-547 (2008).
  3. Hu, C. D., Chinenov, Y., Kerppola, T. K. Visualization of interactions among bZIP and Rel family proteins in living cells using bimolecular fluorescence complementation. Mol. Cell. 9 (4), 789-798 (2002).
  4. Kerppola, T. K. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) analysis as a probe of protein interactions in living cells. Annu. Rev. Biophys. 37, 465-487 (2008).
  5. Kodama, Y., Hu, C. D. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC): a 5-year update and future perspectives. Biotechniques. 53, 285-298 (2012).
  6. Lingwood, D., Simons, K. Lipid Rafts As a Membrane-Organizing Principle. Science. 327 (5961), 46-50 (2009).
  7. Tian, T., Harding, A., Inder, K., Plowman, S., Parton, R. G., Hancock, J. F. Plasma membrane nanoswitches generate high-fidelity Ras signal transduction. Nat. Cell Biol. 9 (8), 905-914 (2007).
  8. Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
  9. Hess, S. T., Girirajan, T. P. K., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophys. J. 91 (11), 4258-4272 (2006).
  10. Nickerson, A., Huang, T., Lin, L. J., Nan, X. Photoactivated Localization Microscopy with Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC-PALM) for Nanoscale Imaging of Protein-Protein Interactions in Cells. PloS one. 9 (6), e100589(2014).
  11. Manley, S., Gillette, J. M., Lippincott-Schwartz, J. Single-particle tracking photoactivated localization microscopy for mapping single-molecule dynamics. Methods Enzymol. 475, 109-120 (2010).
  12. Shyu, Y. J., Hu, C. D. Fluorescence complementation: an emerging tool for biological research. Trends Biotechnol. 26 (11), 622-630 (2008).
  13. Fan, J. Y., et al. Split mCherry as a new red bimolecular fluorescence complementation system for visualizing protein-protein interactions in living cells. Biochem. Biophys. Res. Commun. 367 (1), 47-53 (2008).
  14. Kerppola, T. K. Design and implementation of bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assays for the visualization of protein interactions in living cells. Nat. Protoc. 1, 1278-1286 (2006).
  15. Gomez-Martinez, M., Schmitz, D., Hergovich, A. Generation of stable human cell lines with Tetracycline-inducible (Tet-on) shRNA or cDNA expression. J. Vis. Exp. March. (73), e50171(2013).
  16. Robida, A. M., Kerppola, T. K. Bimolecular fluorescence complementation analysis of inducible protein interactions: effects of factors affecting protein folding on fluorescent protein fragment association. J. Mol. Biol. 394 (3), 391-409 (2009).
  17. Ding, Y., et al. Ratiometric biosensors based on dimerization-dependent fluorescent protein exchange. Nat. Methods. 12 (3), (2015).
  18. Seidman, C. E., Struhl, K., et al. Introduction of plasmid DNA into cells. Curr. Protoc. Protein Sci. Coligan, J. E., et al. Appendix 4, 4D(2001).
  19. Morrison, S. L. Preparing frozen bacterial stocks. Curr. Protoc. Immunol. Coligan, J. E., et al. Appendix 3, Appendix 3M(2001).
  20. Campeau, E., et al. A versatile viral system for expression and depletion of proteins in mammalian cells. PloS One. 4 (8), e6529(2009).
  21. Liu, H., Naismith, J. H. An efficient one-step site-directed deletion, insertion, single and multiple-site plasmid mutagenesis protocol. BMC Biotechnol. 8 (91), (2008).
  22. Deschout, H., et al. Precisely and accurately localizing single emitters in fluorescence microscopy. Nat. Methods. 11 (3), 253-266 (2014).
  23. Nan, X., et al. Single-molecule superresolution imaging allows quantitative analysis of RAF multimer formation and signaling. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 110 (46), 18519-18524 (2013).
  24. Chenouard, N., et al. Objective comparison of particle tracking methods. Nat. Methods. 11 (3), 281-289 (2014).
  25. Persson, F., Lindén, M., Unoson, C., Elf, J. Extracting intracellular diffusive states and transition rates from single-molecule tracking data. Nat. Methods. 10 (3), 265-269 (2013).
  26. Liu, Z., et al. Super-resolution imaging and tracking of protein–protein interactions in sub-diffraction cellular space. Nat. Commun. 5, 1-8 (2014).
  27. Xia, P., et al. Super-resolution imaging reveals structural features of EB1 in microtubule plus-end tracking. Mol. Biol. Cell. 25 (25), 4166-4173 (2014).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Eiwit eiwitinteractiessingle molecule trackingsuperresolutiemicroscopienanometer ruimtelijke resolutielive cell imagingfluorescerende eiwitfragmentenfototransformeerbare probesRas Raf interactie

Gerelateerde artikelen