Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Levensvatbaarheid van Bioprinted Cellular constructen met behulp van een drie Dispenser cartesiaanse Printer

10K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/53156

⸱

22 september 2015

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Surgery, Medical University of South Carolina, 2Department of Regenerative Medicine and Cell Biology, Medical University of South Carolina, 3Department of Bioengineering, Clemson University

In dit artikel

Samenvatting

Een Cartesische bioprinter werd ontworpen en gemaakt om multi-materiaal depositie in nauwkeurige, reproduceerbare geometrieën mogelijk te maken, terwijl ook controle van omgevingsfactoren wordt toegestaan. Met behulp van de driedimensionale bioprinter kunnen complexe en levensvatbare constructies worden afgedrukt en gemakkelijk worden gereproduceerd.

Samenvatting

Weefsel engineering heeft zijn focus gecentraliseerd op de constructie van vervangingen voor niet-functioneel of beschadigd weefsel. Het gebruik van driedimensionale bioprinting in weefsel engineering heeft nieuwe methoden opgeleverd voor het afdrukken van cellen en matrix om biomimetische weefselconstructies te fabriceren. De solid freeform fabricatie (SFF) methode, ontwikkeld voor driedimensionale bioprinting, gebruikt een additieve fabricagebenadering door druppels cellen en hydrogels laag voor laag te deponeren. Bioprinting fabricage is afhankelijk van de specifieke plaatsing van biologische materialen in driedimensionale architectuur, en de afgedrukte constructies zouden de complexe organisatie van cellen en extracellulaire matrixen in natuurlijk weefsel nauw moeten nabootsen. Dit artikel benadrukt het gebruik van de Palmetto Printer, een Cartesische bioprinter, evenals het proces van het produceren van ruimtelijk georganiseerde, levensvatbare constructies terwijl tegelijkertijd controle van omgevingsfactoren wordt toegestaan. Deze methodologie maakt gebruik van computerondersteund ontwerp en computerondersteunde fabricage om deze specifieke en complexe geometrieën te produceren. Ten slotte maakt deze aanpak de reproduceerbare productie van gefabriceerde constructies mogelijk, geoptimaliseerd door beheersbare afdrukparameters.

Inleiding

Tissue engineering gebruikt de principes van de biologie en techniek in de ontwikkeling van functionele substituten te behouden, herstellen of versterken natief weefsel en. Het vermogen van het opwekken van drie-dimensionale biomimetische constructen on demand zou wetenschappelijke en technologische vooruitgang in tissue engineering en in cel-gebaseerde sensoren, geneesmiddel / toxiciteitsscreening, weefsel of tumormodellen en andere vergemakkelijken. De driedimensionale organisatie van weefselengineering constructs is een fundamentele component van de fabricagemethode omdat het nauw de zeer georganiseerde interactie van cellen en extracellulaire matrix in natief weefsel moet nabootsen.

Biologisch afbreekbaar en vorm vormende driedimensionale scaffolds zijn kritische factoren bij het genereren van nieuwe weefselconstructen omdat cellen migreren naar een tweedimensionale laag van cellen vormen, maar missen het vermogen te groeien in ontwikkelde driedimensionale. De steiger dient als tijdelijke basis voor cellgehechtheid en proliferatie, dus het moet worden opgebouwd uit materialen met een controleerbare porositeit en biologische afbreekbaarheid, en voldoende mechanische integrit. De scaffold materialen mogen niet cytotoxisch zijn of tot een negatieve reactie van de gastheer. Hydrogels zijn gewoonlijk in tissue engineering technieken en door hun hydrofiliciteit, hydrogels mogelijk vocht en gasuitwisseling gehele structur. Door het combineren van verschillende hydrogels, de eigenschappen van het gesynthetiseerde hydrogel zijn aanpasbaar aan verschillende applicatie eis te voldoen.

De conventionele tissue engineering aanpak omvat de oprichting van acellulaire poreuze offer steigers die zijn ingezaaid met cellen post-fabricatio. Veel technieken zijn toegepast, zoals vezelbinding, oplosmiddelgieten, en smelt vormen, maar bleek minimaal succesvol tissue engineering toepassingen. Vezelbinding methoden toe vezels worden uitgelijnd in bepaalde vormen, maar zijn alleen in staat producing zeer dun schavot. Oplosmiddelgieten werkwijzen geproduceerd zeer poreuze constructies, maar de grootste geproduceerde membraan bedroeg slechts 3 mm thic. Derhalve creëren driedimensionale constructies niet mogelijk met behulp van deze technieken. Melt giettechnieken succesvol gebleken bij het produceren van drie-dimensionale stellage, maar zulke hoge temperaturen nodig die biologische materialen niet tijdens het productieproces kunnen worden opgenomen. Stellingen geënt postfabricage zijn beperkt in hun vermogen om de eisen van tissue engineering voldoen driedimensionale scaffolds te produceren met vooraf gedefinieerde of microstructuren en controleerbaar. Een ander groot probleem met stevige steiger zaaien technologieën is het tekort aan vascularisatie en slechte mechanische.

Bioprinting is sindsdien uitgebreid tot drie dimensies door middel van niet-toxische, biologisch afbreekbare, thermo-reversibele gels om de nadelen van conventionele overwinnen. Een paar van de vaste freeform fabricage techniques momenteel werkzaam zijn laser-assisted bioprinting en inkjetprinters. Laserinstrumenten bioprinting technieken een gepulste laserbron, een trefplaat, en een ontvangend substraat driedimensionale genereren. Echter, deze techniek beperkt door lage doorvoer, lage levensvatbaarheid van de cellen en kan slechts beperkte regeling van gefabriceerde structuren omdat alleen fotoverknoopbaar prepolymeren kunnen worden gebruikt om een ​​verknoopte hydrogel. Inkjetprinten werd ontwikkeld als een contactloze werkwijze die digitale beelddata reproduceert op een substraat door afzetten picoliter inkt. Echter, inkjet printing produceert geen hoge-resolutie construct, construeert ervaring snelle eiwitdenaturatie, en veel van de cellen worden gelyseerd in de afzetting.

Op dit moment zijn er nieuwe additive manufacturing bioprinting methoden ontwikkeld. In deze systemen cellen, eiwitten, groeifactoren en biomimetische hydrogels worden typisch geïntegreerd in matrix materials tijdens het fabricageproces en gelijktijdig neergeslagen terwijl computergestuurde actuators driedimensionale scaffold-based cell beladen constructen die de microarchitectuur van natieve nauw nabootsen genereren. De cel-beladen hydrogels vormen de bioink, die heterogeen kan zijn, die uit meerdere celtypen of homogeen. Additive productiesystemen deposit bioink druppel voor druppel of layer-by-layer via wegwerpspuiten en tips op een computergestuurde stadium kan bewegen in de x, y en z-richtingen. Door middel van computersoftware, kan de architectuur van afgedrukte scaffolds gemakkelijk worden gemanipuleerd afhankelijk van de vereisten van de toepassing. In tegenstelling tot conventionele technieken, kunnen driedimensionale medische technologieën (magnetische resonantie beeldvorming, computer tomografie) in de ontwerpen worden opgenomen genereren patiëntspecifieke construct. Deze werkwijzen ook de mogelijkheid van het produceren gevasculariseerde vervanging toe omdat constructen worden geproduceerd met een hogere lokale celdichtheid, waardoor cel-cel interacties en verbetering van de waarschijnlijkheid van implantatie Surviva.

De Palmetto printer is een maat gebouwde driedimensionale meerdere dispensersysteem programmeerbare robot productiemethoden gebruikt om driedimensionale heterogeen weefselconstructen (figuur 1) te genereren. Het maakt gebruik van een veelheid van materialen in unieke combinaties heterogene structuren te produceren. De initialisatie van de bioprinter is één van de belangrijkste stappen in bioprinting, omdat het stelt u in staat om een ​​verscheidenheid van parameters instellen om de bedrukbaarheid van de bioprinted constructies te optimaliseren.

De bioprinter bestaat uit een batch soort proces opstarten, bediening en afsluiten sequenties gecontroleerd door een Programmable Logic Controller (PLC), die de gebruiker werkt door middel van een interactieve touch-screen bedieningspaneel (figuur 1, A). Om besmetting van bio voorkomenlogische materialen het bioprinter is ingesloten in een positieve-druk poly (methylmethacrylaat) (PMMA) kamer met een hoog rendement deeltjes arrestance (HEPA) -filtered luchtcirculatiesysteem (Figuur 1, B, C). De binnenkant van de printer kan worden gesteriliseerd met behulp van het ingebouwde ultraviolet lichtbronnen (Figuur 1 D). De centrale component van de bioprinter een volledig programmeerbaar positionering robot die reproduceerbaar kan plaats een druppelaar met een nauwkeurigheid van 10 micrometer (Figuur 1 E). Er zijn drie dispensers, die in staat zijn de volumes zo klein 230 nl met behulp van een roterende schroef (figuur 1, F) stort zijn. Ze zijn onafhankelijk programmeerbaar via aparte computers die afdrukparameters bepalen voor elke inrichting (figuur 1 G). Rotary-schroef uitgifte maakt gebruik van de rotatie van een motor aangedreven schroef bioink beneden een spuit en uit de spuit te verplaatsen. Deze dispensers zijn gemonteerd op een pneumatischly gecontroleerde Tool Nest (Figuur 2A, B), zodat de robot dispenser gemonteerd op de Z-as robotarm onder geprogrammeerde controle (Figuur 1, H) schakelaar.

De XYZ robot instructies afdrukken ontvangt vanaf een computer met design software (figuur 1 I). Elk programma bevat doseren locaties, kalibratie routines en-dispenser veranderende protocollen. Het ontwerp van de gegenereerde constructies voornamelijk bestaat uit de XYZ-coördinaten waar elke dispenser materiaal zal storten. De bioprinter bestaat uit twee optische lichtsensoren (figuur 2C) die bepalen de XYZ-coördinaten van de spuit end. Deze sensoren zenden coördinaatgegevens de robot, die deze gebruikt om posities van de dispenser punteinden berekenen. Er is een extra verplaatsing laser (figuur 2D) die een 633 nm diode rode laserstraal van vlekgrootte projecteert 30 x 100 micrometer om afstand te meten met een Accuracy van 0,1 micrometer. Wanneer de bundel sterk gericht de robot bepaalt de Z-afstand van het printoppervlak. Deze meting en de optische lichtsensoren meten van het uiteinde in Z, maakt berekening van accurate Z coördinaten gebruikt om de dispenser tip plaatsen ten opzichte van het afdrukoppervlak. De dispensertips bewegen lateraal en verticaal door de X-as gerichte optische lichtsensor aan de Y- en Z centra, en lateraal door een Y-as sensor naar het midden van de X-as zijn. Het drukoppervlak wordt toegewezen met de formule voor een plat vlak in xyz ruimte: ax + by + cz = d te bepalen waar het oppervlak ten opzichte van de positie van het afgifte-uiteinde. De fase printer (Figuur 1, J) houdt een monster petrischaal tot 80 mm in diameter en gebruikt een recirculerende waterbad tot de ingestelde temperatuur (Figuur 1, K) te handhaven. Stage temperatuur kan worden ingesteld binnen een bereik van -20 en stabiel blijft binnen. Er is een USB camera gemonteerdop de robot Z-arm een vergrote weergave van het afgifte-uiteinde tijdens het drukproces (figuur 1, L) leveren. Er is een tweede camera gemonteerd aan de bovenkant van de kamer interieur dat een compleet beeld van het bioprinter geeft tijdens het drukproces (figuur 1, L).

Een computer-aided design tekening software bepaalt de depositiepatroon en kan de gebruiker stapsgewijs afstand druppels en complexe structuren (figuur 3) genereren. Driedimensionale paden kan handmatig worden gecodeerd in de printer-compatibele design software of een aparte computer-aided design tekensoftware (Figuur 4, tabel 1) geïmporteerd. De printer-compatibele software kunnen variaties van druk parameters zoals de afzetting methode (enkele druppel depositie of continu traject afzetting), driedimensionale geometrie van de paden, depositiesnelheid, afstand tussen de spuit uiteinde en substrate afdrukoppervlak, de tijd aan een individu vallen, en de hoogte storten en snelheid van de spuit wordt opgeheven tussen afzetting van de druppels. Elk programma bevat XYZ doseren locaties, tip kalibratieroutines en-dispenser veranderende protocollen om een ​​steriele omgeving te bieden, zonder tussenkomst van een operator, tijdens het afdrukken. De Programmable Logic Controller (PLC) van de robot ontvangt instructies van de computer waarop het ontwerp-software en controleert de timing van gebeurtenissen uit de externe controllers (bijv, de dispensers). Om dit te doen, de PLC maakt gebruik van een looping mechanisme om de automaten te controleren , robotachtige positionering apparaat, en omgevingsfactoren.

Driedimensionale direct-write bioprinting gebruikmaking van een roterende schroef, vloeistof doseersysteem maakt het proces van het afzetten van cellen efficiënter, nauwkeuriger en eenvoudiger dan eerdere methoden zijn. Deze studie toont de maat gebouwde bioprinter kan genereren cell beladen hydrogel constructies met levensvatbaarheid hoge cel.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Voorbereiding van de Gelatine bevattend substraat voor driedimensionale Bioprinting alginaat Hydrogels

  1. Bereid de calcium / gelatine substraat volgens de calcium / gelatine substraat beschreven door Pataky et al 11 tot verminderde levensvatbaarheid geassocieerd met een hoog gehalte voorkomen. De calcium / gelatine substraat methode hieronder.
    1. Combineer calciumchloride dehydraat (1,5 gew%), natriumchloride (0,9 gew%) en varkensgelatine (2 gew%) in gedestilleerd water en kook 2 min een 100 mM gelatine-oplossing te creëren.
  2. Giet 5 ml gelatine / calciumoplossing in 100 mm standaard petrischalen, zwenk de oplossing rond om een ​​gelijkmatige laag op het oppervlak en op een plat oppervlak in de koelkast gel O / N (laten geleren ten minste 8 hr voor gebruik).
  3. Om de dichtheid van het substraatoppervlak te verhogen, voeg titanium dioxide (0,3 gew%) aan de gelatine / CaCl 2-oplossing. Roer gedurende 10 min. Autoclave de gelatine / TiO 2 oplossing vloeistoffen cyclus gedurende 30 min te steriliseren.
    1. Voeg 3 ml van de gelatine / TiO 2-oplossing aan het oppervlak van de eerder bereide gelatine platen. Zwenk het mengsel om te verzekeren dat wordt gelijkmatig verdeeld over het oppervlak. Laat gel in het 4 ° C koelkast O / N (laat minstens 8 uur vóór gebruik geleren). De ondergrond moet binnen 3 dagen.

2. Alginaat Oxidatie

  1. Oxideert natriumalginaat bioink volgens de methode voor het gedeeltelijk geoxideerd alginaat door Bouhadir et al 30 hieronder beschreven.
    1. Een 5% geoxideerd alginaatoplossing maken, los op in 100 ml gedestilleerd water 1 g natriumalginaat. Voeg een waterige oplossing van natriumperjodaat (0,25 M, 0,25 mmol), het oxidatiemiddel, een 5% oplossing leidt oxidatie. Roer gedurende 19 uur bij KT. Voeg 40 ml ethyleenglycol aan de oplossing na 24 uur het einde reactie.
    2. Los 2,5 g natriumchloride in de oplossing. Voeg een overmaat ethanol (2: 1 verhouding) tot de geoxideerde alginaten precipiteren. Centrifugeer de oplossing bij 1000 xg om het neerslag te verzamelen en opnieuw te lossen in gedestilleerd water. Herhaal de ethanol wassen.
    3. Vriesdrogen geoxideerde alginaat pellets en bewaar bij -20 ° C tot aan gebruik.
  2. Bepaal de mate van oxidatie door de procentuele natriumperjodaat verbruikt voordat eindigt op ethyleenglycol.
    1. Bereid een kaliumjodide-oplossing (20% w / v, pH 7,0 natriumfosfaatbuffer) en een thyodene oplossing (10% w / v, pH 7,0 natriumfosfaatbuffer). Meng de twee oplossingen met de geoxideerde alginaat bij KT.
    2. Successievelijk de gereageerde alginaat en natriumperjodaat oplossing in het mengsel van kaliumjodide en theodyne oplossingen. Meet de absorptie van het mengsel spectrofotometrisch bij 426 nm. Wanneer deze tot eenmaximum Noteer de gebruikte hoeveelheid alginaat en natriumperjodaat oplossing V 1.
    3. De reactie is figure-protocol-1 . De hoeveelheid ongereageerde natriumperjodaat is figure-protocol-2
    4. Trek de hoeveelheid ongereageerd natriumperjodaat van de oorspronkelijke concentratie de hoeveelheid natriumperjodaat verbruikte bepalen. Met de voorgaande formule, bepalen de uiteindelijke oxidatiegraad van het alginaat.

3. Alginaat Peptide Conjugation

  1. Conjugaat liganden met een blootgestelde arginine-glycine-aspartaat sequentie (peptide) in de vooraf bereide geoxideerde alginaat door de RGD-Alginaat conjugatie methode Rowley et al 31 hieronder beschreven celhechting en spreiding bevorderen.
  2. Gebruik waterige carbodiimide chemie met G 4 RGDSPto conjugaat 31.
  3. Los 1 g 5% geoxideerd alginaat in een 0,1 M 2- (N-morfolino) ethaansulfonzuur (MES) buffer, pH = 4. Voeg 1-ethyl- (dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC, 0,54 mmol) en N-hydroxysuccinimide ( NHS, 0,27 mmol) in 2: 1 verhouding amide tussenproduct te vormen.
  4. Voeg 0,28 mmol peptide koppeling met de ruggengraat van het polymeer alginaat via de terminal amine. Roer bij kamertemperatuur O / N.
  5. Stop de koppelingsreactie door toevoeging van 2,5 g natriumchloride aan de oplossing. Voeg een overmaat ethanol (2: 1 verhouding) tot de geoxideerde alginaten precipiteren. Centrifugeer het mengsel bij 4000 xg gedurende 5 min naar de precipitaten te verzamelen. Zuigen de media in de celkweek kap en opnieuw ontbinding van de neerslag in gedestilleerd water. Herhaal de ethanol wassen.
  6. Vriesdrogen de precipitaten totdat het volledig wordt gedroogd (weergegeven als een witte poederachtige substantie) en bewaar in de koelkast -20 ° C voor latergebruiken.

4. Human VetWeefsel stromale cellen (hADSC's) Cell Culture

  1. Culture menselijk vetweefsel stromacellen (hADSC's) in 75 cm behandelde celkweekkolven (T75 kolven), bedekt met 15 ml lage glucose DMEM met 10% foetaal runderserum en 1% penicilline-streptomycine, 1% glutamine en 1% antimycin. Wijzig de media, in de celkweek kap, om de twee dagen, totdat zij confluentie (80-90%) hebben bereikt.
  2. Eenmaal samenvloeiing, de overdracht van de T75 flessen om de celkweek kap en schorten de hADSC met behulp van de trypsine enzymdigestie methode.
    1. In de kap, zuigen al het celkweekmedium uit de cellen. Spoelen met 5 ml Dulbecco's fosfaat-gebufferde zoutoplossing met calcium en magnesium (DPBS ++). Zuig het DPBS ++ off van de cellen.
    2. Terwijl in de afzuigkap moeten een oplossing van trypsine en DPBS ++ door het mengen van 1 ml trypsine en 4 ml DPBS ++. Elke kolf vereist 5 ml van de solution, dus maak er het juiste volume voor het aantal confluente flessen. Voeg 5 ml van het trypsine / DPBS ++ aan elke kolf en zet ze in de incubator gedurende 2 minuten.
    3. Na 2 minuten, verwijder de kolven en licht tik op de zijkanten van hen om de cellen los te maken van de bodems. Bekijk elke kolf onder een microscoop te zorgen voor de cellen gesuspendeerd. Plaats de kolven terug in de celkweek kap en voeg 3 ml van de juiste media voor celkweek aan elke kolf. Dit beëindigt de trypsine reactie.
    4. Breng de cel beladen media uit elke kolf en in een 50 ml conische. Centrifugeer bij 1000 xg ze gedurende 5 min. De cellen moeten verschijnen als kleine witte pellet op de bodem van de conische. Transfer terug naar de celkweek kap en zuig de media. Resuspendeer de cellen in 2 ml celkweekmedium.
    5. Tel de cellen met een hemocytometer onder de microscoop. Nadat de cellen werden geteld, in de cultuur kap, aliquot de hoeveelheid media die ~ 1,3 million cellen en overdracht aan een 15 ml conische. Centrifugeer de 15 ml conische met de cellen opnieuw gedurende 5 min bij 1000 x g.
    6. In de kweek kap, reseed de overige cellen in meerdere T-75 kolven, het toevoegen van een concentratie van ~ 350.000 cellen per kolf. Voeg 15 ml DMEM media en opnieuw in de incubator tot samenvloeiing.
    7. Zodra de centrifuge is voltooid, keren de 15 ml conische aan de celkweek. Zuig het medium van de cel pellet en resuspendeer de cellen in waterige alginaatoplossing in een concentratie van 1,3 miljoen cellen per milliliter bioink, terteriating de oplossing vaak zodat er een homogene verdeling van cellen in de bioink. Laad de cel-beladen oplossing in een steriele printer-compatibele 3 ml spuit en schroef op de steriele 22 G plastic tip.

5. Bioprinter Setup

  1. Zet de bioprinter elk van de dispenser computers en de recirculating waterbad.
    1. Handmatig de recirculerende waterbad temperatuur voor de geleringsmechanisme.
    2. Handmatig afdrukparameters per dispenser op het correleren dispenser computer. Stel het afzien volume tot 230 nl, het aantal backsteps naar 0, en het afzien tarief -sec 10 pl.
  2. Open de ontwerpsoftware en het programma voor het bekijken van het scherm van de USB camera op de computer.
    1. Met behulp van de software handmatig invoeren van de coördinaten voor een 5 x 5 dot array met 2,4 mm afstand tussen de druppels.
    2. Stel de grafische parameters zijn: afstand tussen uiteinde en substraatoppervlak = 0,1 mm; hoogte spuit wordt opgeheven tussen de afzettingen = 20 mm; de tijd per afzetting = 1 sec.
    3. Sla het programma en stuur het naar de robot.
  3. Plaats de gelatine / TiO 2 bevattende petrischaal op het podium 4 ° C printer. Sluit en vergrendel de kamerdeur.
  4. Gebruik de PLC om initialize het ultraviolette lichtbronnen, en steriliseer de kamer voor 90 sec.
  5. Zodra sterilisatie is voltooid, opent u de kamer en laad de spuit met hADSC opgeschort in alginaat in Gun 1. Sluit en vergrendel de kamerdeur.
  6. Gebruik de PLC aan te zetten de ventilator systeem, wacht 30 seconden voor evenwicht interne druk.
  7. Op de computer, start het programma met de geometrische route en druk parameters.
  8. Gedurende het drukproces, kijken naar het scherm van de USB-camera's op de computer om nauwkeurige en uniforme afdrukken te bevestigen.
  9. Zodra het afdrukken is voltooid, kan de constructies om gel voor 40 min.

6. Cel levensvatbaarheid Assessment

  1. Bedek de constructies die niet zullen worden afgebeeld onmiddellijk na het afdrukken in DMEM en op te slaan in de incubator op het moment van beeldvorming.
  2. Om de levensvatbaarheid van de constructen kwantificeren vlekken ze met behulp van een fluorescentie-gebaseerde levensvatbaarheid / cytotoxiciteit assay, eennd beeld met behulp van confocale microscopie.
    1. De instructies te volgen kit, bereiden een kleuring oplossing met calceïne AM en ethidiumhomodimeer-1. Aan 10 ml kleuroplossing, voeg 20 ul van de ethidium homodimeer-1 en 5 pl van de calceïne am tot 10 ml steriel, weefselkweek-grade Dulbecco's fosfaat-gebufferde zoutoplossing (+ magnesium + calcium; DPBS ++).
    2. Dompel de bioprinted constructen in de kleuroplossing gedurende 15 min in het donker.
    3. Afbeelding de gekleurde constructies met behulp van een confocale microscoop systeem op dag 0 en 8. Neem meerdere foto's van elke bioprinted constructie, met behulp van Z-stack parameters van 30 optische schijfjes over een 300 micrometer diep, en handmatig de cellen te tellen. Als cellen blijken geel of groen ze tellen als in leven, en als rode, tel ze als dood.
  3. Bereken het percentage cellevensvatbaarheid het aantal levende cellen gedeeld door het totale aantal cellen in het construct; Cel levensvatbaarheid = aantallevende cellen (groen + geel) / totaal aantal cellen (groen + geel + rood) x 100%.
  4. Bereken de hoeveelheid celproliferatie voor elk monster als het aantal cellen van dag 8 gedeeld door het aantal cellen op dag 0; Celproliferatie = levend celgetal op dag 8 / levende cellen rekenen op dag 0 x 100%.

7. RGD Peptide Conjugation Analyse

  1. Om het succes van RGD peptide conjugatie aan het alginaat te analyseren, vergelijk RGD-alginaat geconjugeerde en niet-geconjugeerde alginaat. Om dit beeld de gedrukte constructies doen met behulp van (4 ', 6-diamidino-2-fenylindol, Dihydrochloride) (DAPI) en phalloidin vlekken.
    1. Maak de phalloidins werkende oplossing door het verdunnen van 5 ui van de methanol voorraad oplossing met 200 ul van DPBS ++. Bewaren bij -20 ° C tot gebruik.
    2. Voeg een 300 uM voorraadoplossing van de DAPI kleuring volgens de vergelijking: (0,10509 g / L) / (350,3 g / mol) = 3 x 10 -4 M = 0,0003 M = 0,300 mM = 300 pM. Maak the DAPI werkoplossing door verdunning van de voorraad oplossing 1: 100 in DPBS ++ tot 3 uM oplossing te verkrijgen. Bewaren bij -20 ° C tot gebruik.
  2. Volledig onderdompelen van het monster in 4% paraformaldehyde. Incubeer gedurende 1 uur bij KT. Was drie keer met DPBS ++, waardoor de oplossing te zitten gedurende 5 min per wasbeurt. Breng de gel monster uit de put tot een glasplaatje, wegknippen van de gel over het proces. Dompel de gel in 0,1% Triton X-100 (0,1 g / 100 ml) in DPBS ++ gedurende 10 min. Was drie keer met DPBS ++, waardoor 5 min voor elke wasbeurt.
  3. Vlekken op de afgedrukte constructies met phalloidin door ze onder te dompelen in de werkende oplossing. Dek af met folie en incubeer gedurende 4 uur. Verwijder de phalloidin vlek en was drie keer met DPBS ++. De eerste wasbeurt moet snel zijn, de laatste wast dient te zitten voor 5 minuten elk.
  4. Vlekken op de afgedrukte constructies met DAPI door ze onder te dompelen in de DAPI werkende oplossing. Dek af met folie en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 min. Wassendrie keer met DPBS ++, waarbij elke wasbeurt zitten gedurende 5 min. Observeren en het beeld van de monsters op een confocale microscoop systeem.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

De resultaten tonen de bioprinter kan afzetten cellen beladen hydrogels in bepaalde driedimensionale locaties nauwkeurig en consistent gebruik van computerondersteunde software. Deze software bepaalt de plaatsing van elke druppel en controleren vele van de parameters voor het afgeven (figuur 3,4). De herhaalbaarheid van de bioprinter om adequaat biomaterialen storten is van fundamenteel belang voor het succes ervan in tissue engineering-toepassingen.

Levensvatbaarheid van de...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De primaire focus van tissue engineering is om de kloof tussen de tekorten orgel en transplantatie behoeften te overbruggen door het ontwikkelen van biologische substituten te kunnen herstellen, handhaven of verbeteren van inheemse weefsel functio. Dit heeft geleid tot de directe vervaardiging van steigers met een complex anatomisch juiste externe geometrie en nauwkeurige controle over de interne geometr. Driedimensionale bioprinting is een methode voor het genereren van driedimensionale constructies van verschillende m...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door de regering steun onder Grant No. EPS-0903795 toegekend door de National Science Foundation, NIH NIDCR R01-DE019355 (MJY PI) ​​en Grant 8P20 GM103444 (YM PI).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Positioneringsrobot (JR2000 XYZ)Janome 
Dispensers: SDAV Linear Drive SmartDispensersFishman Corporation
Optische lichtsensoren: Keyensce
Verplaatsingslaser: OD MiniSICK
Circulatiewaterbad: PolystatCole-ParmerEW-12122-02
USB-camera's: Dino-Lite Premier 5MPAnMo Electrionics/YSC TechnologiesAD7013MT
Printer-compatibel computerontwerpsoftware: JR-C PointsJanomeKomt bij aankoop van Janome Robot
Computerondersteunde ontwerptekensoftware: Visual PathBuilderRatioServKan worden gedownload op: www.ratioserv.com/index.php/downloads
Printer 3 cc-spuiten: Fishman Corporation122051
22 G dispensertipsFishman CorporationZ520122 
CalciumchloridedihydraatSigma-Aldrich10035-04-8
NatriumchlorideSigma-Aldrich7647-14-5
Porcine gelatineSigma-Aldrich9000-70-8
TitaniumdioxideSigma-Aldrich13462-67-7
Protanal LF 20/40 alginaat (natriumalginaat)FMC BioPolymer9005-38-3
ZoutzuurSigma-Aldrich7647-01-0
EthyleenglycolMallinckrodt Baker, Inc9300-01
NatriumperiodaatSigma-Aldrich7790-28-5
hADSCLonzaPT-5006Bewaar in flacons in vloeibaar stikstof tot gebruik.
Dulbecco's aangepast Eagle's mediumGibco Life Technologies11965-092Verwarm in 37 °C water voor gebruik.
Trypsine/EDTALonzaCC-5012Verwarm in 37 °C water voor gebruik.
Calcein AMGibco Life TechnologiesC3100MPBewaar in het donker bij -80 °C tot gebruik.
Live/Dead ZoogdierlevensvatbaarheidskitInvitrogen Life TechnologiesL-3224Bewaar in het donker bij -80 °C tot gebruik.
MES HydrateSigma-AldrichM2933
N-HydroxysuccinimideSigma-Aldrich130672
1-ethyl-(dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC)Sigma-AldrichE1769 10 G
Dulbecco's fosfaatgebufferde zoutoplossing, +Calcium, +MagnesiumLife Technologies14040133Verwarm in 37 °C water voor gebruik.
Dulbecco's fosfaatgebufferde zoutoplossing, -Calcium, -MagnesiumLife Technologies14190144Verwarm in 37 °C water voor gebruik.
RGD-peptidenInternational Peptides
Alexa Fluor 546 Phalloidin StainInvitrogen Life TechnologiesA22283Bewaar bij -20 °C tot gebruik
(4’, 6-Diamidino-2-fenylindole, dihydrochloride) (DAPI) StainLife TechnologiesR37606Bewaar bij -20 °C tot gebruik

Referenties

  1. Langer, R., Vacanti, J. P. Tissue Engineering. Science. 260 (5110), 920-926 (1993).
  2. Derby, B. Review: Printing and Prototyping of Tissues and Scaffolds. Science. 338 (6109), 921-926 (2012).
  3. Kachurin, A. M., et al. Direct-Write Construction of Tissue-Engineered Scaffolds. Mat. Res. Soc. Symp. Proc. 698, 10-1557 (2002).
  4. Sachlos, E., Czernuszka, J. T. Making Tissue Engineering Scaffolds Work. Review on the Application of Solid Freeform Fabrication Technology to the Production of Tissue Engineering Scaffolds. European Cells and Materials. 5, 29-40 (2003).
  5. Yeong, W. Y., Chua, C. K., Leong, K. F. Rapid Prototyping in Tissue Engineering. Challenges and Potential. Trends Biotechnol. 22 (12), 643-652 (2004).
  6. Landers, R., Pfister, A., Hubner, U., John, H., Schmelzeisen, R., Mulhaupt, R. Fabrication of Soft Tissue Engineering Scaffolds by means of Rapid Prototyping Techniques. Journal of Materials Science. 37 (15), 3107-3116 (2002).
  7. Murphy, S. V., Skardal, A., Atala, A. Evaluation of Hydrogels for Bio–Printing Applications. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 101A (1), 272-284 (2013).
  8. Burg, K. J. L., Boland, T. Minimally Invasive Tissue Engineering Composites and Cell Printing. IEEE Eng Med Biol Mag. 22 (5), 84-91 (2003).
  9. Billiet, T., Vandenhaute, M., Schelfhout, J., Van Vlierberghe, S., Dubruel, P. A Review of Trends and Limitations in Hydrogel-Rapid Prototyping for Tissue Engineering. Biomaterials. 33 (26), 6020-6041 (2012).
  10. Khalil, S., Nam, J., Sun, W. Multi–Nozzle Deposition for Construction of 3D. Biopolymer Tissue Scaffolds. Rapid Prototyping Journal. 11 (1), 9-17 (2005).
  11. Pataky, K., Braschler, T., Negro, A., Renaud, P., Lutolf, M. P., Brugger, J. Microdrop Printing of Hydrogel Bioinks into Three–Dimensional Tissue–Like Geometries. Adv Mater. 24 (3), 391-396 (2011).
  12. Pati, F., Shim, J. H., Lee, J. S., Cho, D. W. Three-Dimensional Printing of Cell–Laden Constructs for Heterogeneous Tissue Regeneration. Manufacturing Letters. 1 (1), 49-53 (2013).
  13. Gruene, M., et al. Laser Printing of Three–Dimensional Multicellular Arrays for Studies of Cell–Cell and Cell–Environment Interactions. Tissue Eng. 17 (10), 973-982 (2011).
  14. Khalil, S., Sun, W. Bioprinting Endothelial Cells With Alginate for 3D Tissue Constructs. J Biomed Eng. 131 (11), 1-8 (2009).
  15. Xu, T., et al. Hybrid Printing of Mechanically and Biologically Improved Constructs for Cartilage Tissue Engineering Applications. Biofabrication. 5 (1), 1-10 (2012).
  16. Zhang, T., Yan, K. C., Ouyang, L., Sun, W. Mechanical Characterization of Bioprinted in vitro Soft Tissue Models. Biofabrication. 5 (4), 1-10 (2013).
  17. Chung, J. H. Y., et al. Bio–ink Properties and Printability for Extrusion Printing Living Cells. J. Biomater. Sci., Polym. Ed. 1 (7), 763-773 (2013).
  18. Yang, S., Leong, K. F., Du, Z., Chua, C. K. The Design of Scaffolds for Use in Tissue Engineering. Part II. Rapid Prototyping Techniques. Tissue Engineering. 8 (1), 1-11 (2002).
  19. Ferris, C. J., Gilmore, K. G., Wallace, G. G., Panhuis, M. Biofabrication: An Overview of the Approaches Used for Printing of Living Cells. Appl. Microbiol. Biotechnol. 97 (10), 4243-4258 (2013).
  20. Lu, L., Mikos, A. G. The Importance of New Processing Techniques in Tissue Engineering. MRS Bull. 21 (11), 28-32 (1996).
  21. Wake, M. C., Gupta, P. K., Mikos, A. G. Fabrication of pliable biodegradable polymer foams to engineer soft tissues. Cell Transplant. 5, 465-473 (1996).
  22. Mironov, V., Visconti, R. P., Kasyanov, V., Forgacs, G., Drake, C. J. Organ Printing: Tissue Spheroids as Building Blocks. Biomaterials. 30 (12), 2164-2174 (2009).
  23. Norotte, C., Marga, F. S., Niklason, L. E. Scaffold–free Vascular Tissue Engineering Using Bioprinting. Biomaterials. 30 (30), 5910-5917 (2009).
  24. Devillard, R., et al. Cell Patterning by Laser–Assisted Bioprinting. Methods Cell Biol. 119, 159-174 (2014).
  25. Binder, K. W., Allen, A. J., Yoo, J. J. Drop–on–Demand Inkjet Bioprinting: a Primer. Gene Ther Reg. 6 (1), 33(2011).
  26. Xu, T., et al. Viability and Electrophysiology of Neural Cell Structures Generated by the Inkjet Printing Method. Biomaterials. 27 (19), 3580-3588 (2006).
  27. Calvert, P. Inkjet Printing for Materials and Devices. Chem Mater. 13 (10), 3299-3305 (2001).
  28. Chang, C. C., Boland, E. D., Williams, S. K. Direct–Write Bioprinting Three–Dimensional Biohybrid Systems for Future Regenerative Therapies. J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 98 (1), 160-170 (2011).
  29. Li, M. G., Tian, X. Y. A Brief Review of Dispensing–Based Rapid Prototyping Techniques in Tissue Scaffold Fabrication: Role of Modeling on Scaffold Properties Prediction. Biofabrication. 1 (3), 1-10 (2009).
  30. Bouhadir, K. H., Lee, K. Y., Alsberg, E., Damm, K. L., Anderson, K. W., Mooney, D. J. Degradation of Partially Oxidized Alginate and its Potential Application for Tissue Engineering. Biotechnol Prog. 17 (5), 945-950 (2001).
  31. Rowley, J. A., Madlambaya, G. Alginate Hydrogels as Synthetic Extracellular Matrix Materials. Biomaterials. 20 (1), 45-53 (1999).
  32. Smith, C. M., Christian, J. J., Warren, W. L. Characterizing Environmental Factors that Impact Viability of Tissue–Engineered Constructs Fabricated by a Direct–Write Bioassembly Tool. Tissue Engineering. 13 (2), 373-383 (2007).
  33. Ozbolat, I., Yu, Y. Bioprinting Towards Organ Fabrication: Challenges and Future Trends. IEEE Trans Biomed Eng. 60 (3), 691-699 (2012).
  34. Peltola, S. M., Melchels, F. P., Grijpma, D. W., Kellomaki, M. A. A Review of Rapid Prototyping Techniques for Tissue Engineering Purposes. Annals of Medicine. 40 (4), 268-280 (2008).
  35. Malda, J., et al. 25th Anniversary Article: Engineering Hydrogels for Biofabrication. Adv Mat. 25 (36), 5011-5028 (2013).
  36. Murphy, S. V., Atala, A. 3D Bioprinting of Tissues and Organs. Nat Biotech. 32 (8), 773-785 (2014).
  37. Jia, J., et al. Engineering Alginate as Bioink for Bioprinting. Acta Biomaterialia. 10 (10), 4323-4331 (2014).
  38. Forty, R. A., Steinberg, M. S. The Differential Adhesion Hypothesis: a Direct Evaluation. Developmental Biology. 278 (1), 255-263 (2005).
  39. Wang, L., Shansky, J., Borselli, C., Mooney, D., Vandenburgh, H. Design and Fabrication of a Biodegradable, Covalently Crosslinked Shape–Memory Alginate Scaffold for Cell and Growth Factor Delivery. Tis Eng Part A. 18 (19-20), 2000-2007 (2012).
  40. El–Sherbiny, I. M., Yacoub, M. H. Hydrogel Scaffolds for Tissue Engineering: Progress and Challenges. Global Cardiology Science, & Practice. 3 (38), 316-342 (2013).
  41. Smith, C. M., et al. Three–Dimensional BioAssembly Tool for Generating Viable Tissue-Engineered Constructs. Tissue Engineering. 10 (9–10), 1566-1576 (2004).
  42. Ozbolat, I. T., Chen, H. Development of a ‘Multi-arm Bioprinter’ for Hybrid Fabrication of Tissue Engineering Constructs. Robotics and Computer–Integrated Manufacturing. 30 (3), 295-304 (2014).
  43. Kolesky, D. B., Truby, R. L., Gladman, A. S., Busbee, T. A., Homan, K. A. Three-Dimensional Bioprinting of Vascularized, Heterogeneous Cell–Laden Tissue Constructs. Adv Mater. X. Adv Mater. X, x-y (2014).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Printer met drie dispensersstromale cellen uit menselijk vetweefselgeoxideerde RGD-geconjugeerde alginaat bio-inktconfocale microscopie-analysecelviabiliteit proliferatie migratiecomputerondersteund ontwerp en fabricagesolid freeform fabricagemethoderuimtelijk georganiseerde constructenreproduceerbare productieparameters
Levensvatbaarheid van Bioprinted Cellular constructen met behulp van een drie Dispenser cartesiaanse Printer
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.