Generatie van Integratie-vrije mens geïnduceerde pluripotente stamcellen Met behulp van Hair-afgeleide keratinocyten

Samenvatting

Dit manuscript geeft een stapsgewijze procedure voor het verkrijgen en onderhouden van humane keratinocyten uit getrokken haar en de daaropvolgende generatie van integratievrije menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSC's) door middel van episomale vectoren.

Samenvatting

Recente ontwikkelingen in herprogrammering stellen ons in staat somatische cellen om te zetten in humane geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSC's). Ziektemodellering met behulp van patiëntspecifieke hiPSC's maakt de studie van het onderliggende mechanisme voor pathogenese mogelijk, en biedt ook een platform voor de ontwikkeling van in vitro geneesmiddelscreening en gentherapie om behandelingsopties te verbeteren. Het veelbelovende potentieel van hiPSC's voor regeneratieve geneeskunde is ook duidelijk uit het toenemende aantal publicaties (>7000) over iPSC's in recente jaren. Verschillende celtypen uit verschillende lijnen zijn met succes gebruikt voor de generatie van hiPSC's, inclusief huidfibroblasten, hematopoiëtische cellen en epidermale keratinocyten. Terwijl huidbiopsieën en bloedafname routinematig worden uitgevoerd in veel laboratoria als bron van somatische cellen voor de generatie van hiPSC's, zijn de verzameling en daaropvolgende derivatie van haarkeratinocyten minder gebruikelijk. Haarafgeleide keratinocyten vertegenwoordigen een niet-invasieve benadering om celmonsters van patiënten te verkrijgen. Hier beschrijven we een eenvoudige niet-invasieve methode voor de derivatie van keratinocyten uit getrokken haar. We geven ook instructies voor het onderhoud van keratinocyten en de daaropvolgende herprogrammering om integratievrije hiPSC te genereren met behulp van episomale vectoren.

Inleiding

De ontdekking van de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSCs) heeft een revolutie op het gebied van regeneratieve geneeskunde, die een haalbare methode voor het genereren van patiënt-specifieke stamcellen ^1-3. hiPSCs succes gegenereerd uit verschillende somatische celtypen, waaronder fibroblasten ^{4,5, 6,7} hematopoëtische cellen, epitheelcellen van nier urine ⁸ en keratinocyten ^9,10. Tot op heden huidfibroblasten en hematopoietische cellen zijn de meest gebruikte cel voor het genereren van patiëntspecifieke iPSCs. Dit is wellicht te wijten aan het feit dat de huid biopten en bloedafname zijn routinematige medische procedures en grote biobanken van de patiënt bloed of huidmonsters hebben in veel landen vastgesteld.

In tegenstelling tot bloedcellen en de huid fibroblast die invasief extractie vereisen, keratinocyten vormen een gemakkelijk toegankelijke celtype voor iPSC generatie. Keratinocytes zijn keratine-rijke epitheliale cellen die de buitenkant epidermale barrière van de huid te vormen en zijn ook gevonden in nagels en haren ^11. In het bijzonder kunnen keratinocyten te vinden op de buitenste wortelschacht (BHS) van haarfollikels, een uitwendige cellaag die de haarschacht bedekt met de binnenste schede (IRS) cellen ^(12, figuur 1). Zoals haar collectie is een eenvoudige procedure die de hulp van medisch personeel niet vereist, het biedt een mogelijkheid voor patiënten te verzamelen en sturen hun eigen haar monsters naar laboratoria, die sterk het verzamelen van monsters van patiënten voor iPSC generatie zou vergemakkelijken. Epidermale keratinocyten hebben ook een hogere efficiëntie en snellere herprogrammering herprogrammering kinetiek vergeleken met fibroblasten, waardoor de voordelen van het gebruik keratinocyten als uitgangspunt cellen voor iPSC productie ^9,13. Bovendien kan hiPSCs ook opgeroepen met andere celpopulaties in de haarfollikel,waaronder de dermale papilla cellen aan de onderkant van de haarfollikel ^14,15.

Vorige meldingen van iPSC generatie met behulp van haar afgeleide cellen gebruiken vaak retrovirale of-lentivirale gebaseerde herprogrammering methoden ^9,14,15. Echter, deze virale methoden introduceren ongewenste genomische integratie van buitenlandse transgenen tijdens het herprogrammeren. Ter vergelijking, het gebruik van episomale vectoren vertegenwoordigt een mogelijke, niet-virale herprogrammering methode-integratie vrije iPSCs ⁴ te genereren. We hebben eerder ontwikkelde een eenvoudige, kosteneffectieve en non-virale methode om efficiënt herprogrammeren keratinocyten in hiPSCs middels episomale vectoren ^13. Hier geven we een gedetailleerd protocol voor het genereren van uit keratinocyt verkregen hiPSCs, waaronder de afleiding van keratinocyten uit geplukt haren, uitbreiding en onderhoud van de keratinocyten en daaropvolgende herprogrammering hiPSCs genereren.

Protocol

De collectie van menselijk haar steekproef van individuen vereist ethische goedkeuring door het menselijk onderzoek ethische commissie in de ontvangende instellingen en moet worden gedaan in overeenstemming met de institutionele richtlijnen.

1. Isolatie van keratinocyten uit geplukt Hair

1. Thaw extracellulaire matrix (ECM) oplossing (dat wil zeggen, Matrigel) op ijs O / N.
2. Met voorgekoeld pipetpunten, voeg 200 ul ECM oplossing 12 ml koud DMEM / F12 medium. Coat een 12-wells plaat met 1 ml verdunde ECM oplossing in elk putje. Incubeer de gecoate plaat O / N bij 37 ° C. Was de beklede plaat met voorverwarmde DMEM / F12-medium vóór gebruik.
3. Verzamel primaire menselijke haren uit het hoofd van het individu door het plaatsen van de vingers dicht bij de wortel van het haar en het plukken van het haar in een snelle en vloeiende beweging. Controleer bevestigen dat elke verzamelde haar bevat een haarfollikel intact en bepaalt de groeifase van het haar under een dissectie microscoop (Figuur 1).
   1. Verzamel 5-10 anagene haren van ieder individu om keratinocyten te halen. Werkwijze geplukt haren zo spoedig mogelijk succesvolle afleiding van keratinocyten waarborgen.
      Opmerking: Figuur 1 illustreert de morfologie van haren in verschillende fasen van de groeicyclus. Anagene haren in de groeifase, een zichtbare buitenlaag van epitheel rond de lengte van het haar, zogenaamde ORS. Anderzijds, telogen haar vertegenwoordigt haar in de rustfase en heeft geen zichtbare ORS, maar een duidelijke klompje cellen die de wortel van het haar, zogenaamde telogene bobbel.
4. Plaats de haarmonsters in een petrischaal met 10 ml van antibiotica Mix te wassen gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
5. Met behulp van gesteriliseerde schaar en pincet, afgesneden overmatige haarschacht, waardoor er een haar-fragment met een intact haarfollikel en rond 0,5-1 cm van de haarschacht.
6. Zorgvuldig transfer 1 haar fragment in elk putje van de ECM-gecoate plaat met behulp van een tang.
7. Met behulp van een pipet 1 ml, voeg ongeveer 3 druppels Knockout Serum Vervangende (KSR) medium (~ 100-200 ul) om het haar monsters.
   Let op: Houd het haar fragmenten in nauw contact met de plaat oppervlak mogelijk te maken voor bevestiging en de daaropvolgende keratinocyten uitgroei. Schade aan het medium toevoegen van deze stap kan het haar veroorzaakt fragmenten te drijven en vermindert de kans op succesvolle hair attachment.
8. Incubeer de haarmonsters in een 37 ° C incubator met 5% CO ₂ en laat de haarzakjes O bevestigen / N. De volgende dag, voeg voorzichtig nog 3 druppels KSR medium (~ 100-200 ul) aan de haarmonsters vochtig.
9. Observeer het haar monsters dagelijks te bevestigen dat de haarzakjes met succes hebben aangesloten. In het algemeen bevestiging van de haarzakjes blijkt binnen 1-3 dagen. Dikke haren zijn meestal gemakkelijker te hechten vergeleken met fijne haartjes, zoals fijne haartjes hebben een hogereneiging om te drijven die het hechtingsproces belemmeren.
   1. Zodra het haar aan de beklede plaat zijn bevestigd, voeg 500 pl KSR medium naar de bron. Wees extra voorzichtig bij het toevoegen van het medium als haren monsters niet goed kan zijn bevestigd. Vanaf dit punt, verandert de media om de 2 dagen.
      Opmerking: Keratinocyte uitwassen moet zichtbaar zijn van de ORS regio van het haar fragment na 3-7 dagen (Figuur 2A-B). Laat de keratinocyten te groeien tot 14 dagen vóór passage van de cellen zoals beschreven in de volgende paragraaf.

2. Onderhoud en passage van keratinocyten

1. Pre-coat een 6-wells plaat met de bekledingsmatrix Kit. Voeg 680 ul van het verdunningsmiddel uit de set aan elk putje, gevolgd door 6,8 pi matrixoplossing Coating. Schud de plaat om een ​​gelijkmatige verdeling van de coating Matrix oplossing op de plaat te garanderen.
2. Laat de beklede platen incuberen gedurende 30 min bij kamertemperatuur. VerwijderenCoating Matrix oplossing vóór de beplating van keratinocyten.
3. Dissociëren keratinocyten in een enkele celsuspensie met 500 pi 0,25% trypsine per putje gedurende 2-5 minuten bij 37 ° C. Inactivatie van het trypsine met 500 pl medium dat serum (bijvoorbeeld, foetaal runderserum (FBS) gemiddeld) en verzamelen in een steriele 15 ml buizen. Verwijder het haar fragment gebruikt gesteriliseerde pincet.
4. Bepaal het aantal geoogste cellen met een hemocytometer.
5. Centrifugeer de cellen gedurende 3 minuten bij 200 x g. Was de cellen met PBS en herhaal centrifugeren. Zuig het PBS en resuspendeer de cel pellet in verse Keratinocyte medium.
6. Plaat naar beneden 4 × 10 ⁴ keratinocyten in een put van ECM-gecoate plaat in de aanwezigheid van Keratinocyte medium. Bewaar de keratinocyten in een 37 ° C incubator met 5% CO ₂ (figuur 2C). Wijzig de media elke dag en passage cellen wanneer de cultuur is ~ 80% confluent, which kan ongeveer 2-7 dagen duren, afhankelijk van de passage nummer en proliferatie snelheid van de keratinocyten. De afgeleide keratinocyten moet worden uitgebreid om voldoende bevroren voorraden te genereren met behulp van standaard slow-bevriezing cryopreservatie methodes ^16.
   Opmerking: De beschreven kweekomstandigheden ondersteunen de uitbreiding van homogene bevolking van keratinocyten met typische geplaveide morfologie (figuur 2C). Af en toe, kan een paar gedifferentieerde keratinocyten, met grote en platte morfologie en replicatieve potentieel hebben verloren, worden waargenomen in cultuur. Karakterisering van keratinocyten kan door immunokleuring met behulp van antilichamen tegen cytokeratine 14 zoals eerder beschreven ^17. Gevestigde cellijnen keratinocyt moet worden getest mycoplasma na 1-3 passages in de handel verkrijgbare kit.

3. Generatie van hiPSCs uit keratinocyten behulp Episomaal Vectoren

1. Pre-coat a 6-well plaat met0,1% gelatine (2 ml / putje). Laat gelatine coaten ten minste 20 min bij kamertemperatuur.
2. Herprogrammering experiment gebruikt keratinocyten uiterlijk passage 6. keratinocyten dissociëren tot een enkele celsuspensie met 1 ml van 0,25% trypsine per putje gedurende 2-5 minuten bij 37 ° C. Inactiveer trypsine met 1 ml medium met serum (bijv FBS media) en laat in een 15 ml buis.
3. Centrifugeer cellen gedurende 3 minuten bij 200 xg en resuspendeer cellen in Keratinocyte medium. Plaat 1 × 10 ⁵ -1,5 × 10 ⁵ keratinocyten per putje in een verstijfselde plaat O / N.
4. Op de volgende dag (dag 0), controleer dan de plaat om ervoor te zorgen cellen 50-60% confluent.
   Opmerking: Als keratinocyten minder dan ~ 50% confluent ze misschien niet goed groeien na transfectie.
5. Op dag 0, voert transfectie van episomale vectoren herprogrammering van de keratinocyten, met een verhouding van 8 ul transfectie reagens 2 ug totaal plasmide DNA.
   1. Neem 0,5 ug van elk van de 4 plasmiden (pCXLE-eGFP, pCXLE-hOct3 / 4-shP53F, pCXLE-hSK, pCXLE-HUL) en verdund in 100 ui verlaagde serum medium (bijv OPTI-MEM).
      Opmerking: Het plasmide pCXLE-eGFP wordt gebruikt om de efficiëntie van de transfectie in keratinocyten volgen en is niet vereist voor een succesvolle herprogrammering.
   2. Voeg 8 pi transfectie reagens om de verdunde DNA. Meng door flicking de buis. Laat het DNA reactiemengsel onverstoorde rusten bij kamertemperatuur gedurende 15 min.
   3. Vervang de Keratinocyte medium met vers medium.
   4. Voeg voorzichtig de DNA reactiemengsel te keratinocytkweek en incuberen in een 37 ° C incubator met 5% _CO2 gedurende 4 uur.
      Opmerking: Het is niet aan te raden om een ​​langdurige transfectie O / N presteren in keratinocyten als ze vertonen lage overlevingskans na transfectie.
   5. Na 4 uur na transfectie vervangen keratinocyt medium door vers medium.
6. Op dag 1 (1 dag post-transfection), verander de keratinocyten medium en check transfectie-efficiëntie van het schatten van het percentage eGFP positieve cellen onder een fluorescentiemicroscoop. Typisch> 60-70% transfectie efficiëntie waargenomen voor primaire keratinocyten met dit protocol.
7. Op dag 2, herhaalt transfectie zoals beschreven in stap 3.5. Twee achtereenvolgende transfecties zouden typisch de> 90% transfectie efficiëntie. Keratinocytkweek bereikt meestal samenloop tegen het einde van de tweede transfectie.
   1. Bereid een 10 cm schotel van muis embryonale fibroblasten (MEF) feeder voor elke herprogrammering reactie. Bereid mitotisch geïnactiveerd MEF feeders zoals eerder beschreven ^18.
   2. Pre-coat een 10 cm schaal met 5 ml 0,1% gelatine gedurende tenminste 20 minuten. Plate 4 × 10 ⁶ mitotisch geïnactiveerde MEF per 10 cm schotel in FBS medium. Laat de cellen bezinken en bevestigen O / N in een 37 ° C incubator met 5% CO _2.
8. Op dag 3, harvest de keratinocyten met 0,25% trypsine, zoals beschreven in stap 3.2 en 3.3. Resuspendeer de keratinocyten in KSR medium en plaat 90% van de keratinocyten van 1 putje van een 6-wells plaat in een 10 cm MEF feeder schotel met KSR medium.
9. Vanaf dag 4, verandert de KSR medium elke dag.
   1. Ook na dag 18, vervangen kweekmedium elke tweede dag.
      Let op: Niet-geherprogrammeerd keratinocyten zal ophouden te vermenigvuldigen, terwijl iPSC kolonies met gedefinieerde grens die menselijke embryonale stamcellen (hESC 's) lijken zal ontstaan ​​vanaf dag 14-21.
10. Isoleer iPSC kolonies door handmatige dissectie van Day 21 en later. Vermijd iPSC kolonies die nauw met elkaar zijn geclusterd en alleen halen iPSC kolonies die duidelijk gescheiden zijn van anderen.
    Opmerking: iPSC kolonies kan eerder worden opgehaald, maar de kolonie met gedefinieerde grenzen misschien niet duidelijk in eerdere tijdstippen zijn, gezien de kleine kolonie grootte. Herprogrammering efficiëntie kan variëren tussen diffErent patiënt keratinocyten en wordt ook beïnvloed door andere factoren zoals het aantal passages of proliferatiesnelheid van keratinocyten.
    1. Voor handmatige dissectie van iPSC kolonies, gebruik dan een 26G naald om iPSC kolonies snijden onder een dissectie microscoop. Snijd een iPSC kolonie in kleine stukjes rond 300-600 micrometer in lengte. Breng de stukken van de ene iPSC kolonie in een nieuwe MEF feeder plaat (2,5 × 10 ⁴ MEF / ^cm2) om een klonale lijn van hiPSCs vast te stellen. Aanvankelijk elkaars cultuur iPSC klonale lijn in een putje van een 12 well plaat of orgelcultuur gerechten, vervolgens uit te breiden naar 6 well plaat formaat.
    2. Handhaaf opgericht klonale lijnen van hiPSCs in KSR medium op MEF feeders. Nadat de kweek bereikt 70-80% confluentie met iPSC kolonies ~ 1,5 mm in diameter, doorgang hiPSCs toepassing van standaard werkwijzen enzymatische passage (Accutase, Dispase of Collagenase IV) volgens de instructies van de fabrikant.
11. Karakteriseren opgericht iPSC lijns om pluripotentie en hun vermogen om te differentiëren in cellen representatief voor de drie kiemlagen in vitro en / of in vivo ^13,19 bevestigd. Ook routinematig proef opgericht iPSC lijnen voor mycoplasma met behulp van commercieel verkrijgbare kits te zorgen dat ze zijn pathogeen vrij. Routinematig monitoren genomische stabiliteit van iPSC lijnen door karyotypering of array-gebaseerde copy number variation (CNV) analyse.

Resultaten

Het haar gaat door 3 verschillende fasen van de groeicyclus: anagen (de groeifase), catagene (de regressie fase) en telogen (de rustfase) ^20,21. De anagene haarfollikels bevat meerdere lagen epitheel; Deze lagen omvatten ORS, IRS en de haarschacht (figuur 1). Anagen haar uiteindelijk ondergaat de overgang naar de catagene fase, die wordt gekenmerkt door apoptose van de ORS en beëindiging van de haarschacht differentiatie. Tenslotte catagene haar overgang naar de telogene fase, waarin apoptose...

Discussie

Generatie van patiënt-specifieke hiPSCs biedt een unieke benadering voor het bestuderen van de pathogenese van de zieke celtypen in vitro, en biedt ook een platform voor drug discovery om nieuwe moleculen die de ziekte fenotypes kan redden identificeren. Deze ziektemodel benaderingswijze via hiPSCs heeft veelbelovende resultaten opgeleverd voor diverse ziekten, waaronder lange QT-syndroom, ziekte van Huntington, ziekte van Parkinson en amyotrofe laterale sclerose ^22. Diverse initiatieven zijn al aan ...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Antibiotic Mix:
250 ng/ml Antimycotic amphotericin B	Sigma	A2942-20ml	Antibiotic mix is gemaakt in PBS.
1X Penicillin/Streptomycin	Invitrogen	15140-122
PBS (-)	Invitrogen	14190-144
Knockout Serum Replacement (KSR) medium:			KSR medium wordt gefilterd met behulp van Stericup (Millipore, #SCGPU05RE) voor gebruik. bFGF wordt vers toegevoegd aan het medium voor gebruik.
20% knockout serum replacement (KSR)	Invitrogen	10828-028
DMEM/F12 met glutamax	Invitrogen	10565-042
1× MEM niet-essentiële aminozuur	Invitrogen	11140-050
0.5× Penicillin/Streptomycin	Invitrogen	15140-122
0.1 mM β-mercaptoethanol	Invitrogen	21985
bFGF (10 ng/ml, vers toegevoegd)	Millipore	GF003
Keratinocyten medium:
EpiLife met 60 µM Calcium	Invitrogen	M-EPI-500-CA
1× Human keratinocyte growth supplement (HKGS)	Invitrogen	S-001-5
Fetal Bovine Serum (FBS) medium:			FBS medium wordt gefilterd met behulp van Stericup (Millipore, #SCGPU05RE) voor gebruik.
10% foetaal bovien serum (FBS)	Invitrogen	26140079
DMEM	Invitrogen	11995-073
0.5x Penicillin/Streptomycin	Invitrogen	15140-122
2 mM L-glutamine	Invitrogen	25030
0.25% trypsin-EDTA	Invitrogen	25200-056
Extracellulaire Matrix (ECM):
Matrigel	Corning	354234	Deel Matrigel stock op en bewaar in -80°C volgens de instructies van de fabrikant. De stockconcentratie van Matrigel varieert lichtjes per batch (~9mg/ml). We raden aan om 200µl matrigel te gebruiken voor het coaten van een 12-well plate (~150µg/well).
Coating Matrix Kit	Invitrogen	R-011-K
Plasmids:			Let op dat pCXLE-eGFP alleen wordt gebruikt voor het controleren van de transfectie-efficiëntie en is niet vereist voor herprogrammering.
-          pCXLE-eGFP	Addgene	27082
-          pCXLE-hOct3/4-shP53F	Addgene	27077
-          pCXLE-hSK	Addgene	27078
-          pCXLE-hUL	Addgene	27080
Transfectiereagens Fugene HD	Promega	E231B
Gelatine (van porcine huid)	Sigma	G1890	Maak 0,1% gelatine in gedistilleerd water. Autoclaveer voor gebruik.
Reduced Serum medium: OPTI-MEM	Invitrogen	31985062
Accutase	Sigma	A6964-100ml
Mouse embryonic fibroblast (MEF) feeder			MEF kan worden ingeactiveerd door behandeling met mitomycin C of bestraling zoals eerder beschreven 16.
26G naald	Terumo	NN2613R
6-well plate (behandeld voor weefselkweek)	BD Biosciences	353046
12-well plate (behandeld voor weefselkweek)	BD Biosciences	353043
10 cm schaal (behandeld voor weefselkweek)	BD Biosciences	353003
Dispase	Invitrogen	17105-041	Gebruik bij 10 mg/ml
Collagenase IV	Invitrogen	17104-019	Gebruik bij 1 mg/ml
TRA-160 antilichaam	Millipore	MAB4360	Gebruik bij 5 µg/ml
OCT4 antilichaam	Santa Cruz	SC-5279	Gebruik bij 5 µg/ml
NANOG antilichaam	R&D Systems	AF1997	Gebruik bij 10 µg/ml
MycoAlert Detectiekit	Lonza	LT07-418