Levering van eiwitten, peptiden of Cell-ondoordringbare Kleine moleculen in levende cellen door incubatie met de endosomolytisch reagens dfTAT

Samenvatting

We beschrijven hoe eiwitten en cel-ondoorlatende kleine moleculen in gekweekte zoogdiercellen kunnen worden afgeleverd door middel van een eenvoudig co-incubatieprotocol met een reagens dat ervoor zorgt dat endocytische organellen lekkend worden.

Samenvatting

Macromoleculaire levering strategieën gebruiken meestal de endocytische route als een route van cellulaire binnenkomst. Echter, endosomale entrapment ernstig beperkt de efficiëntie waarmee macromoleculen dringen de cytosolische ruimte van de cellen. Onlangs hebben we dit probleem omzeild door het identificeren van het reagens dfTAT een disulfidebinding dimeer van het peptide TAT gemerkt met de fluorofoor tetramethylrhodamine. We hebben een fluorescent gemerkt dimeer van de prototypische celpenetrerende peptide (CPP) TAT, dfTAT die levende cellen doordringt en de cytosolische ruimte van cellen met een bijzonder hoog rendement bereikt gegenereerd. Cytosolische levering van dfTAT wordt bereikt in meerdere cellijnen, met inbegrip van primaire cellen. Bovendien is de levering niet merkbaar beïnvloeden levensvatbaarheid van de cellen, proliferatie of genexpressie. dfTAT kan leveren kleine moleculen, peptiden, antilichamen, biologisch actieve enzymen en een transcriptiefactor. In dit rapport beschrijven we de betrokken DFTA protocollenT synthese en cellulaire levering. Het manuscript beschrijft hoe de hoeveelheid eiwit afgegeven aan de cytosolische ruimte van de cellen te regelen door het variëren van de hoeveelheid eiwit extracellulair toegediend. Tenslotte, de karakteristieken van deze nieuwe technologie en stappen die betrokken zijn bij het valideren aflevering besproken. De beschreven protocols zou zeer nuttig zijn voor cel-gebaseerde testen en voor de ex vivo manipulatie en herprogrammering van cellen.

Inleiding

De afgifte van proteïnen, peptiden of cel-doorlaatbare kleine moleculen in levende cellen vaak gewenst in veel biologische of biotechnologische toepassingen (cellulaire beeldvorming, functionele testen, cellulaire herprogrammering, enz.) ^1-4. Vele benaderingen levering reeds gemeld, waaronder micro-injectie, elektroporatie, of het gebruik van carrier middelen (bv., Celpenetrerende peptiden zoals TAT, lipiden) ^5-7. Elke techniek heeft meestal specifieke voor- en nadelen die deze benaderingen voldoende voor sommige toepassingen, maar niet voor anderen kunnen maken. Veelvoorkomende problemen impliceren slechte levering efficiëntie en / of gebrek aan controle over hoeveel materiaal wordt afgeleverd ^8,9, toxiciteit of nadelige fysiologische gevolgen ^10,11, gebrek aan temporele controle levering weinig cellen, maar niet in een gehele populatie (bijv., micro-injectie) ^12, en de complexe chemische conjugatie of formulering regelingen ^11.

s = 'jove_content "> Onlangs hebben we een nieuwe leveringsstrategie Deze beperkingen omzeilt ontwikkeld. Deze strategie is gebaseerd op een peptide genaamd dfTAT (dimeer fluorescerende TAT) ^13. dfTAT is afgeleid van de bekende cel-penetrerende peptide (CPP) TAT. dfTAT bevat twee disulfide gebonden kopieën van TAT gemerkt met de fluorofoor tetramethylrhodamine. Ondanks hun gelijkenissen, TAT en dfTAT aanzienlijk verschillen in activiteit. TAT typisch geïnternaliseerd in cellen door endocytose. Dit CPP blijft echter meestal opgesloten in endosomen (dit meestal leiden tot een punctata verdeling van het peptide in de cellen wanneer onderzocht door fluorescentiemicroscopie). Zoals TAT ​​wordt dfTAT efficiënt endocytose door cellen. Echter, dfTAT niet blijven zitten in endosomen. In plaats daarvan bemiddelt op een wijze die zeer efficiënt endosomale lekkage. De endosomolytisch activiteit van dfTAT kan vervolgens worden benut om macromoleculen te leveren door een simpele incubatie assay.

ntent "> De huidige begrip van het leveringsproces is als volgt. dfTAT induceert macropinocytose. Hierdoor cellen geïncubeerd met dfTAT nemen oplosbare eiwitten, peptiden of kleine moleculen (moleculen plaats, MOI) aanwezig in media door vloeistoffase endocytose (zie figuur 1). Interacties tussen dfTAT en MOI niet nodig zolang beide entiteiten verkeer tezamen in de endocytische route. Als dfTAT een bepaalde drempel binnen het lumen van endocytische organellen bereikt, zijn endosomale lekkage activiteit (de moleculaire details uitdrukt blijven volledig gekarakteriseerde te zijn). De inhoud van het lumen van lekkende organellen, en dus de MOI, wordt dan losgelaten in de cellen. Deze benadering is daarom erg handig omdat geen conjugatie of formulering stelsels met MOI vereist. Omdat bovendien dfTAT is niet direct modificeren van een MOI moet ook niet storen MOI functie eenmaal intracellulaire afgifte wordt bereikt. Ook de concentratie vandfTAT gebruikt levering is onafhankelijk van die van de MOI in de media. Zo kan dfTAT concentratie constant tussen verschillende experimenten worden gehouden reproduceerbare efficiëntie in endosomale lekkage te garanderen. Daarentegen kunnen concentratie MOI in media geleidelijk worden veranderd om gewenste niveau bereiken van MOI geleverd cytosol.

De hoge endosomale lekkage efficiency bereikt met dfTAT opmerkelijk onschadelijk zijn voor veel van de tot op heden geteste cellen. Dit is verrassend omdat endosomale organellen belangrijke component van de cellen en men zou verwachten dat de dramatische lekkage veroorzaakt door dfTAT gepaard zou gaan met schadelijke cellulaire responsen. Toch behandelde cellen woekeren in hetzelfde tempo als onbehandelde cellen en geen significante veranderingen in hun transcriptoomanalyse niet weergegeven. Bovendien kan de levering worden herhaald binnen enkele minuten met reproduceerbare levering efficiëntie, wat aangeeft dat de cellen kan ofwel tolereren of herstellen van het leveringsproces zonder verlieshun capaciteit voor endocytose of endosomale lekkage. Subtiele cellulaire reacties kunnen plaatsvinden tijdens dfTAT levering en de moleculaire details van wat deze reacties zou kunnen nog worden onderzocht. Maar door het combineren hoge efficiëntie, gemak protocollen, en gebrek aan toxiciteit, dient deze levering benadering blijken onmiddellijk bruikbaar in vele cel-gebaseerde applicaties. De hierin gepresenteerde protocollen zijn gericht op het maken van deze technologie toegankelijk voor de onderzoeksgemeenschap.

Protocol

1. SPPS: CK (TMR) TATG (fTAT) Synthese

Opmerking: dfTAT wordt in twee stappen: synthese van het monomeer fTAT door vaste fase peptidesynthese, gevolgd door disulfidebinding dimerisatie te dfTAT vormen.

1. Zwellen 500 mg rink amide MBHA hars in dimethylformamide (DMF) in een standaard 50 ml SPPS vaartuig 1 uur.
2. Voer Fmoc ontscherming door het incuberen van de Fmoc beschermde hars in een 20% piperidine-oplossing (20% piperidine in DMF, 10 ml (0,30 mmol). Voer deprotectiestappen tweemaal (1 x 5 min en 1 x 15 min) met een wasstap met behulp DMF (de wasstap omvat meerdere keren spoelen van de hars met een totaal volume van ongeveer 150 ml DMF en het oplosmiddel door vacuum filtratie) daartussen reacties.
3. Synthetiseren CK (TMR) RKKRRQRRRG (fTAT) op de ijsbaan amide MBHA hars. Gebruik de volgende Fmoc beschermde aminozuren: Fmoc-Lys (MTT) -OH (alleen N-terminus), Fmoc-Lys (Boc) -OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Arg (Pbf) -OH, Fmoc Gln (Trt) -OH en Fmoc-Cys (Trt) -OH. Het uitvoeren van de reactie met behulp van _N2 (20 PSI) om de reactie te ageren. Voer alle reacties bij kamertemperatuur.
   1. Het uitvoeren van elk aminozuur koppeling reactie gedurende 4 uur. Voor elke koppeling met de Fmoc beschermde aminozuur (1,2 mmol), N, N, N ', N' -Tetramethyl- O- (1H-benzotriazol-1-yl) uroniumhexafluorfosfaat (HBTU) (0,44 g, 1,1 mmol ) en diisopropylethylamine (DIEA) (0,51 ml, 3,0 mmol) opgelost in DMF. Na de 4 uur koppeling, was de hars met DMF en voer de Fmoc ontscherming stap zoals beschreven in stap 1.2.
   2. Herhaal dit totdat het lineaire peptide keten van fTAT (Linear peptideketen: CKRKKRRQRRRG geen TMR) werd gesynthetiseerd.
   3. Daarna wassen hars grondig met eerste DMF en na die met dichloormethaan (DCM). Spoel de hars meerdere keren met een totaal volume van ongeveer 150 ml DMF en DCM en verwijder het oplosmiddel door vacuum filtratie.
   4. Use MALDI-TOF te bevestigen dat de verkregen peptide de juiste molecuulgewicht.
      1. Wordt matrix mengsel door toevoeging van 1 mg matrix aan een oplossing bestaande uit 50 gl van 0,01% TFA in water oplossing en 50 gl acetonitril.
      2. Lineaire peptideketen massa te bevestigen, gebruik α-cyaan-4-hydroxykaneelzuur. Uitvoeren van een analytische HPLC van het ruwe peptide en het verzamelen van 50 gl van de top van de zuivere piek.
      3. Om het monster te bereiden op plaat op de MALDI plaat: Voeg 8 pi van het peptide aan 2 pl van de matrix-oplossing en plaats op de MALDI plaat te droog of op een 37 ° C hitte plaat lucht.
         Opmerking: Arginine speelt een aminozuur moeilijk paar SPPS zijn. Succesvolle koppeling wordt vastgesteld door het uitvoeren van een Kaiser-test ¹⁴ (bijvoorbeeld ninhydrine test). Deze test maakt de detectie van vrije amines die losgekoppeld kunnen blijven op de hars. Indien wordt een blauwe kleur (indicatief voor de aanwezigheid van vrije aminen) gedetecteerd, koppeling sTEP's worden herhaald.
4. Voor CK (-NH-TMR) TATG (fTAT), klieven Mtt beschermende groep op de aminogroep van Lys CK (-NH-Mtt) TATG met een oplossing bestaande uit 1% trifluorazijnzuur (TFA) en 2% triisopropylsilaan (TIS) in DCM.
   1. Het verwijderen van MTT beschermgroep leidt tot het verschijnen van een gele kleur, incubeer de hars met 20 ml van bovenstaande oplossing 5 min Herhaal dit totdat er geen gele kleur waargenomen. Was de hars met DCM en DMF daartussen. Bovendien aangezien TIS is een scavenger dat de MTT zouden vangen zodra geen gele kleur wordt weergegeven in de oplossing in aanwezigheid van MTT.
   2. Voeg een extra oplossing met 1% TFA in DCM (geen TIS) aan de hars niet meer MTT verzekeren is verwijderd en de oplossing helder is.
5. Los de drie componenten: Carboxytetramethylrhodamine (TMR), HBTU en DIEA (4, 3,9 en 10 equivalentie ten opzichte van de hoeveelheid hars (in mg)) in DMF en voeg dit mengselde hars en het uitvoeren van de reactie O / N droge _N2 roeren verschaffen.
6. Na Fmoc-ontscherming en aminozuur conjugatie was de hars met DCM en laten drogen. Voor volledige afsplitsing van het peptide van de hars, voeg een oplossing van 92,5% TFA, 2,5% _H2O, 2,5% TIS, en 2,5% ethaandithiol (EDT) (totaal volume = 4 ml) om het peptidyl-hars 3 uur bij KT mondiale deprotectie en klieving van de hars te bereiken.
   1. Precipiteren van het ruwe peptide producten met koud watervrije ethylether (Et ₂ O) door het laten uitlekken van de oplossing uit stap 1.6 in 40 ml Et ₂ O, draaien dit neer op 4 ° C en 4000 g gedurende 20 - 25 min. Herhaal deze stap om het wassen van de neerslag met koud watervrij Et ₂ O. toe
   2. Resuspendeer de precipitaten in water (5 ml of totdat neerslag volledig is opgelost) en Lyophilize. Vervolgens resuspendeer de verkregen waterige 0,1% TFA / acetonitrile producten.
7. Voer een HPLC-analyse met een analytische C18-kolom (5 urn, 4 x 150 mm) aan elk peptide te analyseren. Met een stroomsnelheid van 1 ml / min en detectie bij 214 nm en 550 nm.
8. Voer semi-preparatieve HPLC op een C18-kolom 10 x 250 mm voor peptide zuiveren. Met een stroomsnelheid van 4 ml / min en detectie bij 214 nm en 550 nm. Voor alle runs, gebruiken lineaire gradiënten van 0,1% waterig TFA (oplosmiddel A) en 90% acetonitril, 9,9% water en 0,1% TFA (oplosmiddel B).
9. Bevestig de juiste identiteit van de peptiden door MALDI-TOF volgens de fabrikant protocol: fTAT, verwachte massa: 2,041.17, waargenomen massa: 2.040,66. DEAC-K9, verwachte massa: 1,412.97, waargenomen massa: 1,415.59. Gebruik een α- cyano-4-hydroxykaneelzuurmatrix voor de MALDI-TOF.

2. Oxidatie Reactie: dfTAT Generation

1. Beluchten fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) pH 7,4 gedurende 1 uur (minimaal 5 ml voor de onderstaande reactie).
2. Ontbinden fTAT (0,3 mg, 1,5 x 10 ^-4 mmol) in Aerated PBS pH 7,4 (5 ml). Zorg ervoor dat de pH tussen 7,0 - 7,5 na toevoeging van het peptide. Indien niet natriumhydroxide toe (1 M, in kleine stappen 1 - 5 pi) om de pH terug te brengen tot 7,4.
3. Opmerking: zuurstof opgelost in PBS werkt om de thiolgroepen op fTAT oxideren en vormen een disulfidebinding.
4. Nutate de reactie O / N om te reageren totdat voltooid (100% opbrengst gebaseerd op HPLC analyse). Zuiver het product met behulp van omgekeerde fase HPLC en geanalyseerd met massaspectrometrie (MALDI-TOF) als in stap 1,9. Verwachte massa: 4,080.34, waargenomen massa: 4,084.21.
5. Lyophilize pure dfTAT (0,71 x10 ^-4 mmol) en resuspendeer in 200 ul water (concentratie pure dfTAT = 356,3 uM).

3. Meten dfTAT Concentratie

1. Resuspendeer een hoeveelheid van de gezuiverde dfTAT (kenmerkend 1 ul, afhankelijk van de hoeveelheid peptide gezuiverd) in een 149 ui 50 mM TCEP oplossing.
2. Opmerking: In deze stap dfTAT verlaagd tot zijn monomer tegenhanger fTAT de absorptie quenching die optreedt elimineren vanwege de nabijheid van het TMR fluorofoor in dfTAT (de extinctiecoëfficiënt ε van TMR in dfTAT is in vergelijking met de ε van TMR verminderd fTAT gereduceerd).
3. Laat het monster reageren ongeveer 20 min (analytische HPLC kan worden gebruikt om de vorming van fTAT bevestiging).
4. Voeg de oplossing van het kwarts cuvet en meet de absorptie bij 556 nm.
5. Met behulp van de wet van Beer (A = εcl: ε = 91.500 M ^-1 cm ^-1) om de concentratie van fTAT berekenen, het gehalte aan dfTAT en verdeel [fTAT] twee.

4. Cellular Levering Experimenten

1. Zaad de cellen (HeLa, HDF, enz.) In een schotel met een confluentie van 80 - 90% (bijvoorbeeld 8-well of 24-putjes). Groei cellen in een geschikt medium (bijvoorbeeld DMEM aangevuld met 10% FBS en Pen / Strep) tot 80 - 90% confluentie in een 37 ° Cbevochtigde atmosfeer met 5% _CO2.
2. Was de cellen driemaal (3x) met PBS (door toevoeging van 200 pi PBS en vervolgens verwijderen driemaal).
3. Wordt 5 uM werkende concentratie dfTAT door verdunning van een voorraad dfTAT (in water) in NRL-15 media (voor 8 putjes het totale volume moet 200 pi zijn). Een concentratie van 5 uM dfTAT leidt tot efficiënte levering (hoog cytosolische levering in meer dan 90% van de cellen aanwezig in een schotel) in de meeste celtypen getest date (figuur 3). Echter, kunnen lagere of hogere concentraties meer voldoende voor celtypen met een hoge of lage neiging tot penetratie.
   Opmerking over Media: NRL-15 wordt gebruikt voor het verrichten van dfTAT omdat het niet cysteïne waarin de disulfidebinding in dfTAT kunnen verminderen bevatten. Echter, onze gegevens blijkt dat zowel normale L-15 (met cysteïne) en DMEM kan worden gebruikt als de aflevermedia. L-15 bevat het reducerend aminozuur cysteïne maar cysteïne presumably oxideert in de media te vormen cystine (DMEM wordt geformuleerd met cystine). dfTAT blijft dus intact in deze media en de levering werkt op dezelfde efficiency als die verkregen met nrL15.
4. Incubeer de cellen met dfTAT (5 uM) met of zonder lading (bijv., EGFP (10 uM)) en houdt bij 37 ° C gedurende 1 uur (incubatietijd kan worden verminderd, maar dfTAT vereist normaliter ongeveer 30 tot 45 min tot endosomale lekkage induceert ).
5. Was de cellen met heparine (1 mg / ml) in L-15 (3 wasbeurten wordt aanbevolen) om dfTAT verwijderen gebonden aan het plasmamembraan van cellen.
6. Incubeer cellen met cel-impermeabele kern vlek, bijv., Sytox blauw, Sytox Groen (2 uM in NRL-15), om te bepalen of het plasmamembraan van cellen is aangetast (dode cellen zullen worden gekleurd terwijl levende cellen niet) volgens protocol van de fabrikant.
7. Afbeelding cellen met behulp van een fluorescentie microscoop (100X olie onderdompeling of 20X objectief). Afbeelding dfTAT gebruik van een RFP filter (Ex =560 ± 20 nm / Em = 630 ± 35 nm).
   Opmerking: Succesvolle levering leidt tot een diffuse fluorescentie van dfTAT gedurende de cel (het beoordelen van de levering van eiwit of peptide van belang is afhankelijk van de toepassing). Kleuring van nucleoli door fTAT (het gereduceerde product van dfTAT bij cytosolische entry) kan worden gebruikt als een indicatie dat de gedetecteerde fluorescentie intracellulair is. fTAT zal degraderen binnen enkele uren. Op dit punt zal de fluorescentie van de afbraak fragmenten verschijnen punctata. Dit moet niet verward worden voor de gestippelde distributie die ook wordt gezien als dfTAT blijft tevergeefs opgesloten in endosomen (dit kan gebeuren als dfTAT aanwezig op een te laag van een concentratie is).

5. Controling Concentratie van MOI Geleverd

1. Identificeer de "optimale levering" concentratie die nodig is om een ​​efficiënte cytosolische release van dfTAT in de gebruikte celtype te bereiken. Voer fluorescentiemicroscopie op cellen geïncubeerd met increasing concentraties dfTAT. De optimale dfTAT concentratie wordt gedefinieerd als de minimale concentratie die leidt cytosolische wissen "diffuse" TMR fluorescentie bij ongeveer 100% van de cellen in een kweek.
2. Varieert de concentratie van MOI gebruikt in co-incubatie protocol terwijl de concentratie dfTAT constant (bijvoorbeeld met behulp van optimale toediening concentratie dfTAT's). Het veranderen van de incubatietijd tot minder dan 1 uur kan ook een optie om de hoeveelheid variëren van MOI geleverd.

Resultaten

Het verschil tussen fTAT en dfTAT beoordelen worden HeLa-cellen gedurende 1 uur bij elk peptide op het verschil in hun cellulaire lokalisatie te bepalen. De internalisatie van de twee CPP werd bepaald met fluorescentiemicroscopie. Figuur 2 laat zien dat fTAT (20 uM) lokaliseert in een gestippelde distributie. Deze verdeling is in overeenstemming met het peptide blijft ingevangen binnen endosomen. In tegenstelling, het fluorescentiesignaal van dfTAT (5 uM) wordt een homogene verdeling in het cytosol en d...

Discussie

De cellen die voor dfTAT afgifte moet niet al confluent zijn (> 90% confluentie) omdat dit kan hebben op de levering efficiency. De cellen moeten ook gezond zijn: dode cellen in de cultuur kan apoptotische fragmenten waarmee dfTAT kan communiceren (bijvoorbeeld DNA van afgebroken kernen) vrij te geven. Hierdoor kan interfereren met de levering efficiëntie en de kwaliteit van de beeldvorming. De cellen moeten grondig worden gewassen om FBS te verwijderen voordat u dfTAT. BSA aanwezig in FBS kan binden aan dfT...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Heparine	Sigma	CAS 9041-08-1
SYTOX Blue	Invitrogen	S11348
SYTOX Green	Invitrogen	S7020
nrL15 L-15 (–) cysteïne	Hyclone		Speciale bestelling
Fmoc-beschermde aminozuren	Novabiochem
dfTAT			Steekproeven worden verstrekt op verzoek (contact: pellois@tamu.edu)
Bioveiligheidskast
Omgekeerde epifluorescentiemicroscoop	Olympus	model IXB1	uitgerust met een verwarmingsplatform op 37 °C en met een Rolera-MGI Plus back-verlichte elektronen vermenigvuldigende ladingsgekoppelde apparaat (EMCCD) camera (Qimaging).
37 °C bevochtigde, 5% CO2 incubator
Peptidesynthetaser of vat om handmatige peptide synthese uit te voeren