Beoordeling van Perigenital Sensitivity en Prostatic mestcelactivatie in een muismodel van Neonatale Maternal Separation

Samenvatting

Wij meten perigenital mechanische gevoeligheid en mestcel activering in de prostaat van mannelijke C57BL / 6 muizen die een vroege levensspanning paradigma ondergingen - neonatale maternale scheiding teneinde een preklinisch model van chronische prostatitis / chronisch bekkenpijnsyndroom induceren.

Samenvatting

Chronische prostatitis / chronische bekkenpijn syndroom (CP / CPPS) heeft een prevalentie van 14% en is de meest voorkomende urologische diagnose voor mannen onder de leeftijd van 50, maar het is de minst begrepen en studeerde chronische pijn in het bekken stoornis. Een aanzienlijk deel van de patiënten met chronische pijn in het bekken rapport vroege leven stress of misbruik, die sterk kan invloed hebben op het functioneren en de regulering van de hypothalamus-hypofyse-bijnier (HPA-as) hebben meegemaakt. Mestcelactivatie, waarvan is aangetoond worden verhoogd in zowel urine als uitgedrukt prostatic afscheidingen van CP / CPPS patiënten wordt gedeeltelijk gereguleerd door stroomafwaartse activering van de HPA-as. Neonatale moeder scheiding (NMS) is gebruikt voor meer dan twee decennia aan de uitkomsten van het vroege leven van stress studeren in knaagdiermodellen, waaronder veranderingen in de HPA-as en viscerale gevoeligheid. Hier geven we een gedetailleerd protocol voor het gebruik NMS als preklinisch model van CP / CPPS bij mannelijke C57BL / 6-muizen. We beschrijven de methodologievoor het uitvoeren van NMS, beoordelen perigenital mechanische allodynie en histologisch bewijs van de mestcel activering. We hebben ook aangetoond dat vroege psychologische stress langdurige effecten op het mannelijke urogenitale stelsel bij muizen hebben.

Inleiding

Chronische pijn in het bekken op zich geen ziekte, maar een begrip in verband met de voortdurende spontaan en / of opgeroepen pijn die patiënten met irritable bowel syndrome (IBS), interstitiële cystitis / pijnlijke blaas syndroom (IC / PBS), vulvodynia, of chronische prostatitis / chronische bekkenpijn syndroom (CP / CPPS). Deze syndromen worden vaak comorbide en hebben veel kenmerken gemeen, dat ze geen geassocieerde pathologie of geïdentificeerd onderliggende etiologie, maar disfunctie in het immuunsysteem, centraal zenuwstelsel en perifere zenuwstelsel is aangetoond bij te dragen aan het behoud en progressie van deze aandoeningen ^{1 -3.} Patiënten met chronische bekkenpijn vaker met symptomen echter extra, niet-bekken-gerelateerde functionele pijn stoornissen en stemmingsstoornissen, waaronder angst, depressie en paniekstoornis ^4-6, die is geassocieerd met veranderde werking van de hypothalamus hypofysebijnier (HPA-as) ^7-10. Blootstelling aan vroege leven stress of trauma is een belangrijke risicofactor voor het ontwikkelen HPA afwijkingen en bijbehorende chronische pijn syndromen ^10,11 en als zodanig, rapporteren een significant deel van de patiënten met functionele bekkenpijn aandoeningen hebben ondervonden nadelige jeugd evenementen, zoals mishandeling of verwaarlozing ^12-14.

Knaagdiermodellen van neonatale maternale scheiding (NMS), wat inhoudt dat het verwijderen van de pups van de dam voor een bepaalde tijd tijdens de het spenen periode, zijn gebruikt voor de afgelopen twee decennia aan de uitkomsten van het vroege leven stress te bestuderen. Over het algemeen is NMS aangetoond dat activatie HPA as en resulterende angst-achtig gedrag vergroten door direct beïnvloeden genexpressie in de hypothalamus, en verstoren stroomafwaartse regulering van limbische structuren ^15-18. Verstoring van goede HPA-as werking is aangetoond bij te dragen aan verhoogde colorectale ^19-22 En vaginale ¹⁶ gevoeligheid weergegeven door knaagdieren NMS-modellen, maar ondanks uitgebreide karakterisering van de lange-termijn effect van postnatale blaasontsteking ^23-25, is de impact van vroege leven spanning grotendeels verdwenen unstudied in de urogenitale organen. Daarom zal de volgende studie beschrijven hoe NMS presteren bij muizen en later perigenital mechanische gevoeligheid en mestcellen infiltratie / activatie evalueren de prostaat het gebruik van mannelijke muizen NMS valideren als preklinisch model voor de CP / CPPS.

Van alle van de diagnose chronische pijn in het bekken aandoeningen, CP / CPPS is misschien wel het minst goed herkend en gekarakteriseerd syndroom, ondanks het feit dat een prevalentie van ongeveer 14% ²⁶ en de jaarlijkse patiënt de kosten geschat op $ 4400 (tweemaal die van lage rugpijn of reumatoïde arthritis ^27). Patiënten met CP verslag / CPPS pijn in het perineum, het rectum, prostaat, penis, testikels, en / of buik ^28, ervaring een higher mate van psychologische stress dan controle patiënten ^29, en vaak aanwezig met symptomen van of zijn gediagnosticeerd met comorbide chronische pijn in het bekken of stemmingsstoornissen ^5,29-31. Terugkerende infectie, lekkende epitheel, neurogene ontsteking en autoimmuniteit zijn allemaal vermoed als mogelijke oorzaken van CP / CPPS ^2,32,33, alsmede mestcel activering en degranulatie ^34. Uitgedrukt prostaat afscheidingen van mannen met CP / CPPS had mestceltryptase en zenuwgroeifactor (NGF) niveaus verhoogd ^34, en een latere studie bevestigde dat tryptase en carboxypeptidase A (CPA3), een marker van mestcel activering, werden ook verhoogd in de urine van CP / CPPS patiënten ^35. De potentiële rol van mestcellen in het ontstaan ​​en de instandhouding van CP / CPPS is een belangrijke focus van dieronderzoek dit syndroom tot nu toe geweest. De meest gebruikte knaagdieren model gebruikt om CP studeren / CPPS is een experimentele auto-immune prostatitis (EAP) model generated door subcutane injectie van prostate antigeen in complete Freund's adjuvans, wat leidt tot verschillende graden van prostaat ontsteking afhankelijk van soort en stam gebruikt ^34,36-39. Mestcel infiltratie en activering / degranulatie is aangetoond dat na inductie van EAP ^34,35,40 verhogen. Transgene muizen deficiënt in beide mestcellen ³⁴ of de tryptase receptor PAR2 ³⁵ niet ontwikkelen prostaat tactiek gevoeligheid volgende EAP, in tegenstelling tot wildtype EAP muizen. Terwijl dit preklinisch model repliceert veel van de kenmerken van de menselijke CP / CPPS, de inductie protocol is geen indicatie van de menselijke conditie, die een divers etiologie heeft en vaak niet gepaard gaat met directe ontsteking, infectie, of letsel van de prostaat.

De invloed van vroege leven nadruk op de ontwikkeling van CP / CPPS mens grotendeels niet onderzocht gegaan; Maar een studie van Hu et al. ⁴¹ aangetoond dat men die meldde een geschiedenis van de kindertijd fysieke, emotionele en / of seksueel misbruik waren significant meer kans om de symptomen die wijzen op CP / CPPS ervaren. Bovendien toonden ze aan dat zowel pijn als urine scores werden verhoogd bij patiënten met een voorgeschiedenis van fysieke en emotionele misbruik. We hebben eerder aangetoond dat dezelfde NMS paradigma vrouwelijke C57BL / 6-muizen produceert vaginale overgevoeligheid en abnormale genexpressie in zowel de vagina en de blaas wijzen op disfunctionele HPA uitgang ^16. Deze gegevens in combinatie met de hoge prevalentie van CP / CPPS patiënten met andere comorbiditeiten ^42, zoals IC / PBS en stemmingsstoornissen, dat duidelijker is aangetoond dat gekoppeld met vroege levensspanning exposure ^12-14, voorziet de rationale voor het gebruik van een NMS model te onderzoeken CP / CPPS bij muizen.

Protocol

Alle experimenten beschreven in dit protocol te voldoen aan NIH richtlijnen in overeenstemming met de door de Universiteit van Kansas Medical Center Institutional Animal Care en gebruik Comite richtlijnen.

1. Neonatale Maternal Separation (NMS)

1. Monitor zwanger dammen dagelijks voor zwerfafval geboorten.
   Opmerking: De dag van het nest is geboren wordt beschouwd P0.
2. Op P1, verwijder de dam van de kooi en plaats in een schone secundaire container.
3. Wrijf een handvol beddengoed tussen de clean-gehandschoende handen om geur van de kooi houden.
4. Voeg een diepte van 1-2 cm van de kooi bedden in een schone, de juiste label 2 L glazen beker. Voeg ongeveer de helft van de extra verrijking strooisel die in de kooi is, bijvoorbeeld nestlet, kreukdocument aan een bekerglas.
5. Plaats voorzichtig alle pups uit één nest, afzonderlijk, in dezelfde beker.
6. Onmiddellijk plaatshet bekerglas in een incubator gehouden op 33 ^{° C} en 50% vochtigheid gedurende 180 min.
7. Verwijder de dam van de secundaire container en haar terug naar de kooi. Zet de kooi om zijn passende huisvesting locatie in het terrarium.
8. Herhaal deze procedure voor elk nest ondergaan NMS, met behulp van schone handschoenen en secundaire containers voor elk nest / dam.
9. Aan het einde van de 180 min separatieperiode terug de nesten naar hun kooien in de volgorde waarin ze werden verwijderd.
10. Haal de kooi van het eerste nest, dat eerder op de dag werd gescheiden. Verwijder de dam van de kooi en plaats in een schone secundaire container.
11. Verwijder de eerste beker uit de incubator en wrijf een handvol beddengoed tussen schone gehandschoende handen geur van de kooi te handhaven, terwijl de behandeling van de pups.
12. Beweeg de pups, individueel, uit de beker naar de kooi.
13. Terugkeer enige verrijking en beddengoed nog in de beker opde kooi.
14. Terugkeer de dam van de secundaire container naar de kooi en terug te sturen binnen het terrarium om zijn passende huisvesting locatie.
15. Spoel de beker met water en terug te sturen naar de incubator. Gebruik dezelfde beker voor elk nest gedurende de scheidingsprocedure.
16. Herhaal deze procedure voor elk nest ondergaan NMS in dezelfde volgorde als in de incubator geplaatst.
17. Herhaal deze hele procedure voor elk nest ondergaan NMS elke dag door middel van P21.
18. Spenen NMS en naïef pups op P22 door het plaatsen van nestgenoten van hetzelfde geslacht met elkaar in schone kooien, compleet met voedsel en water. Naïve pups geboren zou worden en gehuisvest onder dezelfde voorwaarden als NMS muizen, maar ondergaat geen aanvullende behandeling buiten de normale veehouderij taken.

2. Perigenital Mechanische gevoeligheid

1. von Frey Apparatuur Setup
   1. Breng de muizen om de testkamer en hen in staat stellen om te acclimatiseren voor 30min terwijl die nog in hun huis kooien.
   2. Bereid de testruimte door het plaatsen van een absorberende onderlegger onder verhoogde wire mesh-tafel (79 cm x 28 cm), die voldoende ruimte biedt om de onderzoeker te benaderen vanaf de onderzijde zonder schrikken de muizen, ongeveer 55 cm hoog.
   3. Plaats maximaal 12 muizen individueel onder heldere, geperforeerde kunststoffolie kamers (11 cm x 5 cm x 3,5 cm) bovenop het gaas tabel. Plaats een zwaar voorwerp op de top van de kamers om muizen te voorkomen ontsnappen.
   4. Acclimatiseren de muizen gedurende nog 30 min op het scherm vóór onttrekkingsdrempel assessment.
2. Perigenital Mechanische gevoeligheid Assessment
   1. Voer de up-down-methode met behulp van een standaard set van gesorteerde von Frey monofilamenten ^43. Gebruik de volgende monofilamenten: 1,65 g, 2,36 g, 2,83 g, 3,22 g, 3,61 g, 4,08 g, 4,31 g en 4,74 g.
      1. Houd de basis van de 3,22 g monofilament en de teruggetrokken mono blootfilament.
         Opmerking: Sommige modellen kunnen niet over een teruggetrokken monofilament.
      2. Situeren probe zodat het monofilament verticaal georiënteerd en als de muis alert, onbeweeglijk en het lichaamsgewicht gelijkmatig verdeeld tussen de achterpoten toepassen op de linker- of rechterkant van het scrotum, het vermijden van de middellijn, totdat een lichte kromming wordt waargenomen in het filament.
      3. Houd de Monofilament voor 10 seconden of totdat het dier is een positieve reactie.
         Opmerking: Een positieve respons wordt beschouwd als een stevige schok of springen in reactie op monofilament aanvraag of likken of bijten gedrag gericht op het monofilament. Als de muis beweegt tijdens de 10 sec monofilament toepassing zonder weergave van deze gedragingen, moet de monofilament worden opnieuw getest na een minimum 1 min-lange rustperiode. Als een muis niet beweegt, noch vertoont geen van bovenstaande gedragingen tijdens de 10 sec monofilament toepassing, wordt het beschouwd als een negatief antwoord.
      4. Noteer de reactie, hetzij negatief of positief, in een laboratorium notebook of laptop en herhaal deze procedure voor alle resterende muizen met de 3,22 g monofilament.
      5. Test alle van de muizen opnieuw met de volgende geschikte monofilament. Opmerking: Als de muis vertoonde een negatieve reactie op de 3,22 g monofilament, toepassen 3,61 g monofilament op dezelfde wijze en noteer de respons. Als de muis vertoonde een positieve reactie op de 3,22 g monofilament, toepassen 2,83 g monofilament en noteer de respons.
   2. Doorgaan testen elke muis met behulp van de volgende groter of kleiner monofilament, in voorkomend geval, voor een extra 4-toepassingen na de eerste positieve reactie wordt waargenomen.
   3. Terug muizen naar huis kooien.
   4. Met de waarde van de laatste toegepaste von Frey monofilamenten in de reeks proeven log eenheden van een 50% g onttrekkingsdrempel berekend zoals beschreven in Chaplan et al. ^43.

title "> 3. Aangezuurd toluïdineblauw Mast cel kleuring

1. Weefsel Processing
   1. Ontleden prostaatweefsel ⁴⁴ van muizen die zijn intracardiaal geperfuseerd met ijskoud 4% paraformaldehyde ^45. Postfix het weefsel in 4% paraformaldehyde gedurende 1 uur bij KT en vervolgens cryoprotect in 30% sucrose in 1 x PBS bij 4 ° CO / N.
   2. Maak een klein (30 ml) bad van heptaan en plaats het op droog ijs.
   3. Spoel de prostaatweefsel in 1x PBS en droog met een lichte vegen.
   4. Plaats het prostaatweefsel in de koude heptaan totdat het bevroren.
   5. Plaats onmiddellijk de bevroren prostaatweefsel in een cryomold met montage media en plaats op droog ijs tot bevroren.
   6. WINKEL cryomolds bij -20 ° C.
   7. Dwars snijden de prostaat weefsel in 7 urn dikke cryosecties met behulp van een cryostaat.
   8. Plaats 8-12 non-serial cryosecties dat de lengte van het weefsel omvatten, op positief geladen objectglaasjes.
   9. WINKEL eindigde slides bij -20 ° C tot verdere verwerking.
2. Voorbereiding Aangezuurd toluïdineblauw
   1. Voeg 1 g Toluidine Blue O 100 ml 70% ethanol en vortex totdat in oplossing tot een 1% voorraadoplossing te bereiden. De voorraadoplossing kan worden opgeslagen bij kamertemperatuur gedurende maximaal drie weken.
   2. Voeg 1 g NaCl tot 100 ml water in een bekerglas geplaatst op een roerplaat.
   3. Stel de pH van de NaCl-oplossing met 12 M HCl totdat een pH van 0,5-1,0 bereikt.
   4. Bereid de 0,25% toluidineblauw werkoplossing door het combineren van 8 ml van de voorraadoplossing toluidineblauw en 32 ml van de 1% NaCl-oplossing. Pipet op en neer om de totale opname van de toluidineblauw voorraad oplossing te zorgen en meng met behulp van een vortex. De werkende oplossing moet vers worden gemaakt en na gebruik weggegooid.
3. Kleuring Prostaat Weefsel secties
   1. Haal de objectglaasjes uit de vriezer te verwerken om de temperatuur tot kamertemperatuur gedurende ongeveer 30 min.
   2. Was de weefselcoupes door afzonderlijk dompelen van de objectglaasjes gedurende ongeveer 1 seconde in een 50 ml conische buis met een voldoende hoeveelheid van 1 x PBS zodat de slede gemonteerde weefselcoupes volledig wordt ondergedompeld. Laat slides droge lucht op een papieren handdoek.
   3. Plaats de glaasjes in een glazen pot met weinig kleuring 0,25% werkzaam Toluidine Blue oplossing zodat de slede gemonteerde weefselcoupes volledig wordt ondergedompeld Incubeer 10-15 minuten terwijl op een platform rocker ingesteld op 15 rpm.
   4. Dip dia's in 1x PBS gedurende ongeveer 1 seconde uit te spoelen overtollige toluïdineblauw.
   5. Plaats objectglaasjes in een dia doos of rek zodanig dat de schuiven op de kanten van het toestel drainage.
   6. Droog de objectglaasjes in een oven bij 37 ° C gedurende ten minste 2 uur of O / N bij kamertemperatuur.
   7. Uitdrogen glijbanen snel het gebruik van alcohol, waardoor de dia's volledig droog tussen alcohol blootstellingen. Droge dia door het laten uitlekken op keukenpapier eennd vegen ruggen en randen met een lichte vegen.
      1. Dompel de dia's in 95% EtOH ongeveer 1 seconde en volledig laten drogen. Herhaal deze procedure 1 - 10 keer tot weefsel droogt meer blauw dan paars.
      2. Dompel de dia's in 100% EtOH gedurende ongeveer 1 seconde en laat het volledig droog. Herhaal deze procedure 1-10 keer totdat weefsel is donker tot medium blauw, maar niet paars.
   8. Bevestig de vlek door het incuberen van de objectglaasjes in 100% xyleen gedurende 3 min. Laten drogen.
   9. Coverslip de dia's met glycerol, PBS, of xyleen gebaseerde permanente montage media. Giet overtollige media en bewaar bij kamertemperatuur.
4. Kwantificeren mestcellen
   1. Visualiseren toluïdine Blue gekleurde weefselcoupes op 20x vergroting middels lichtmicroscopie (figuur 2).
   2. Tel het aantal mestcellen aanwezigheid in het gevisualiseerde stippellijn onderscheid tussen niet-degranulated en degranulated mestcellen. 40X magnification kan nodig zijn om granulatie status aantal mestcellen bevestigen.
      Let op: Niet-degranulated mestcellen vertonen dichte metachromasie met geen of vage nucleaire overzicht en / of geen korrelige extrusie rond de cel. Degranulated mestcellen vertonen minder intens metachromasie en hangt natuurlijk duidelijk overzicht van de nucleus en / of granules in het cytoplasma en buiten de cel grens.
   3. Blijf het totale aantal niet-degranulated en degranulated mestcellen beoordelen in het geheel van de huidige weefselsectie. Herhaal deze procedure op ten minste 7 bijkomende aparte secties, verspreid over de lengte van elk weefsel.
   4. Bereken het percentage degranulated (DG) aan totale mestcellen voor elk weefsel / muis volgens de volgende vergelijking: (DG mestcellen / Total mastcellen) x 100.

Resultaten

Muizen die NMS hebben ondergaan bleek behavioral bewijs indicatie van CP / CPPS. Wanneer daarop een gegradeerde reeks van von Frey monofilamenten, 8 weken oude NMS muizen (n = 4) weergegeven perigenital mechanische allodynie in vergelijking met naïeve tegenhangers (n = 5, Figuur 2). Dit blijkt een significante reductie (p <0,01, Student's t-test) in de mechanische onttrekkingsdrempel een positieve gedragsmatige respons opgewekt, geregistreerd als stevige schok of springen naar aanleiding...

Discussie

Dit protocol voorziet methodologie voor het gebruik van neonatale stress, in de vorm van NMS, te symptomology indicatief CP / CPPS induceren in volwassen mannelijke muizen. Als volwassenen, de NMS muizen tonen significant perigenital mechanische allodynie alsook bewijs van mestcel degranulatie in prostaatweefsel. Het gebruik van NMS is een nieuwe benadering voor de ontwikkeling van een preklinisch model van CP / CPPS doordat het de vroege leven stress die vaak wordt gemeld door patiënten met chronische bekkenpijn ^1...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Zwangere C57BL/6 vrouwelijke muizen	Charles River	027	Getimede of ongetimede zwangere vrouwtjes moeten dagelijks worden gecontroleerd op geboorten binnenshuis.
2 L glazen beker(s)	Sigma-Aldrich	CLS10002L	Elke NMS-nest zal gedurende de 21 dagen durende scheidingsperiode in dezelfde beker worden bewaard.
VWR Forced Air Incubator, Basic	VWR International	414005-124	De incubator moet worden gehouden op 33°C en 50% luchtvochtigheid.
Touch Test Sensory Evaluator, Kit of 20 (Semmes-Weinstein Von Frey Aesthesiometer voor aanraakbeoordeling)	Stoelting	58011	De volgende monofilamenten moeten worden gebruikt voor perigenitale gevoeligheidsbeoordeling: 1,65 g, 2,36 g, 2,83 g, 3,22 g, 3,61 g, 4,08 g, 4,31 g en 4,74 g.
Dierenkooi (12 muizen 6 ratten)	IITC	435	Zorg ervoor dat u een zwaar voorwerp op de individuele, acryl dierenkooien legt om te voorkomen dat muizen ontsnappen.
Gaasstandaard voor muizen en ratten (12 muizen 6 ratten)	IITC	410	Plaats de standaard op een stabiele tafel voor comfortabele toegang.
Fosfaat gebufferde zoutoplossing	Sigma-Aldrich	P5493	Verdun de 10x PBS-voorraad tot 1x PBS.
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148	Een 4% paraformaldehyde-oplossing is nodig om muizen intracardiaal te perfunderen en weefsel te postfixeren ter voorbereiding op mastcelkleuring.
Sucrose	Sigma-Aldrich	S5016	Cryoprotect gefixeerd weefsel in 30% sucrose-oplossing bij 4°C een nacht lang.
Heptaan	Sigma-Aldrich	246654	Koel heptaan op droog ijs om weefsel te bevriezen.
Standaard Cryomold	VWR International	4557	Om het bevriezen van prostaatweefsel te helpen voorafgaand aan cryostat sectie.
Tissue-Tek OCT Compound	Sakura	4583	12 x 125 ml
VWR Superfrost Plus Micro Slide	VWR International	48311-703	75 x 25 x 1 mm
Toluidine Blue O	Sigma-Aldrich	198161	Gecertificeerd door de Biological Stain Commission. Geschikt voor gebruik als metachromatische kleuring voor mastcellen.
Ethanol, Absoluut (200 Proof)	Fisher Scientific	BP2818-4	Molecuulbiologie Kwaliteit, Fisher Bioreagents; 95% en 100% oplossingen zullen nodig zijn om geverfde cryosecties te dehydrateren voor mastcelvisualisatie.
Natriumchloride	Sigma-Aldrich	S9888	Verzuurde NaCl-oplossing moet vers worden gemaakt voordat cryosecties worden gekleurd.
GeneMate Sterile 50 ml Centrifuge Tubes	BioExpress	C-3394	Wegwerpbuizen die worden gebruikt om toulidineblauw elementen of dipslides in 1xPBS te mengen.
Coplin kleuringsschaal voor 10 dia's, met geslepen glazen deksel	Fisher Scientific	08-815	Houd maximaal 10 standaard 3 x 1 inch (75 x 25mm) dia's rug aan rug. Gebruik aparte schalen voor Toluidine Blue werkoplossing, 95% EtOH, 100% EtOH en xyleen.
Xyleen (histologisch)	Fisher Scientific	X3P	Na droging wordt weefsel verdund met xyleen.
Microscoopdia's, 100-plaats	VWR International	82003	De dozen kunnen worden gebruikt voor opslag en transport van dia's.
Fisherbrand Microscoopdia's	Fisher Scientific	22-363-400	Deze dia's zijn meestal klein genoeg om in een cryostaat te passen.
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516	Glycerol is een traditioneel montagemedium.
Montagemedium, Richard-Allan Scientific	VWR International	4111	Montagemedium hecht de dekplaat stevig aan de schuif.
Micro Dekglazen, Rechthoekig, Nr. 1	VWR International	48393-106	Een dekplaat wordt over het gedehydrateerde en verdunde weefsel geplaatst om het monster te beschermen.
Lichtmicroscoop	Nikon		De Advanced Automated Research Microscope Eclipse 90i, gebruikt door ons laboratorium, is stopgezet en vervangen door Eclipse Ni-E.