Het doel van deze video wijzen voor geautomatiseerde DNA-extractie van formaline gefixeerde in paraffine ingebedde (FFPE) referentiestandaard cellijnen en digitale druppeltje PCR (ddPCR) analyse zeldzame mutaties te detecteren in een klinische setting voeren. Detecteren van mutaties in FFPE monsters toont de klinische bruikbaarheid van ddPCR in FFPE monsters.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Gebruikmakend Digital Droplet PCR om BRAF V600E Mutaties Detect in formaline gefixeerde paraffine-ingebedde Reference Standard cellijnen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
ddPCR is een zeer gevoelige PCR-methode die gebruikmaakt van een water-olie emulsiesysteem. Met behulp van een druppelgenerator wordt een geëxtraheerd nucleïnezuurmonster verdeeld in ongeveer 20.000 nanogrootte, water-in-olie druppels, en PCR-amplificatie vindt plaats in afzonderlijke druppels. De ddPCR-aanpak wordt gebruikt voor het identificeren van sequentiemutaties, kopienummervariaties en bepaalde structurele herschikkingen van gerichte genen. Hier demonstreren we het gebruik van ddPCR als een krachtige techniek voor het nauwkeurig kwantificeren van zeldzame BRAF V600E mutaties in FFPE referentiestandaard cellijnen, wat nuttig is voor het identificeren van individuen met kanker. Kortom, de ddPCR-techniek biedt de mogelijkheid om de specifieke zeldzame mutaties in verschillende genen in verschillende soorten FFPE-monsters nauwkeurig te profileren.
Inleiding
De accumulatie van genetische mutaties in genen sleutelregulatoren wijzigt normale cel programmeertaal zoals celproliferatie, differentiatie en overleving, wat leidt tot kanker 1. De RAS-RAF-MAP kinase route bemiddelt cellulaire reactie op groeisignalen. Oncogene BRAF mutaties kunnen resulteren uit driver mutaties in het BRAF gen, dat de BRAF oncoprotein kan veroorzaken 2 overactief worden. Mutaties in het BRAF gen ook tot overactieve stroomafwaartse signalering via MEK en ERK 3, die op zijn beurt leidt tot excessieve celgroei en proliferatie onafhankelijk van groeifactor gemedieerde regulering 4-6.
Verschillende instrumenten zijn voor DNA-mutatie profileren, zoals kwantitatieve real-time BRAF V600E mutaties in formaline gefixeerde, in paraffine ingebedde (FFPE) referentiestandaard cellijnen door ddPCR. ddPCR is een PCR-methode voor absolute kwantificeringmet hogere nauwkeurigheid in vergelijking met conventionele kwantitatieve real-time PCR (qPCR) 7,8. ddPCR ook hoger oplossend vermogen en nauwkeurigheid van de detectie van zeldzame mutaties in DNA-matrijzen, waardoor informatiever kankeronderzoek en diagnostiek 9. Bijkomende voordelen van ddPCR opzichte van conventionele qPCR onder meer de verbeterde gevoeligheid en nauwkeurigheid bij het bestuderen van lage template kopie-aantallen 10-12. Hierin wordt een protocol voor het automatisch extraheren van DNA uit FFPE referentienorm cellijnen, gevolgd door bepaling van de aanwezigheid of afwezigheid van BRAF V600E mutaties door ddPCR aangetoond. Het gebruik van software voor data-analyse en grafische weergave van de resultaten zijn ook beschreven. De gehele procedure is relatief eenvoudig en volledig afhankelijk van het aantal monsters dat moet worden geprofileerd en aantal conventionele PCR en ddPCR machines beschikbaar.
Het volgende protocol beschrijft standaardprocedures voor BR AF V600E-positieve FFPE referentiestandaard cellijnen (HD598, HD593, HD617, HD273 en wildtype (WT)) wordt uitgevoerd in een volledig geautomatiseerd instrument met de Tissue Preparation System (TPS) protocol. Vervolgens worden geïsoleerde DNA-monsters geanalyseerd op de aanwezigheid van BRAF V600E mutaties via ddPCR systeem. Gerichte mutatie analyse uitgevoerd nadat alle monsters zijn geprofileerd en de gegevens zijn in de data-analyse software geladen. Afhankelijk van het aantal samples / groepen bestudeerd, gegevensanalyse kan van één tot enkele uren. De experimentele component van de methode vereist nauwkeurigheid bij de behandeling van DNA enrological pipetten en Pipetten en een Jove Science Education video over het uitleggen over de context van pipetteren "> pipetteren in 96 well platen, terwijl de data-analyse wordt uitgevoerd met behulp van software.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. DNA-extractie uit FFPE Reference Standard cellijnen
Opmerking: Bij deze procedure werd DNA-extractie uit FFPE referentiestandaard cellijnen (HD598, HD593, HD617, HD273 en wildtype (WT)) met de FFPE Tissue DNA isolatie kit zoals beschreven in het onderstaande protocol. Geautomatiseerde DNA-extractie werd uitgevoerd door de instructies van de fabrikant voor totaal DNA isolatie.
- Met behulp van een microtoom en de originele FFPE blok, handmatig te bereiden verse secties voor DNA-extractie en analyse, volgens vastgestelde procedures. Verzeker dat het monster input voor het gedeelte weefsel (s) geanalyseerde niet hoger dan een gecombineerde totale dikte van 10 urn en dat het oppervlak niet meer dan 600 mm 2 voor één sectie.
1.2 TPS protocol
Opmerking: De in Tabel 1 volumes overeenkomen met het vereiste minimum om 48 monsters te verwerken, en de proceduregetoond is in overeenstemming met de richtlijnen TPS. Voordat het experiment settelen de FFPE monsters in de e-buis door centrifugatie bij 600 xg, verlies van monsters tijdens de automatische voorkomen.
- Schakel de geautomatiseerde DNA isolatie instrument en de computer. Open de Run besturingssoftware en plaats een auto belasting lade in de TPS dek laadruimte.
- Verdeel reagentia in hun overeenkomstige goten zoals getoond in figuur 1.
- Plaats de 4 monsters (BRAF WT, BRAF V600E 50%, 5% en 1%) in de monsterdrager rekken.
- Plaats de tip dozen in de dalen in de kolommen 2 en 3 en controleer de tips op de aanwezigheid van meer dan één filter per tip, die de run zal afbreken.
- Adequate mengen van de lysisbuffer en de wasbuffer door het omkeren ze 3-5 keer en plaats ze in de respectieve troggen in kolom 4 (figuur 1).
- Na het omkeren voor enkele keren of milde vortexing, laadt de elutiebuffer, magnetische korrels en FFPE buffer in de kleine goten in kolom 5, waardoor 1 slot leeg is vermeld (Figuur 1, Tabel 1).
- Laad een 2 ml deep well plaat (DWP) op de plaat carrier (figuur 1).
- Voer de volgende laatste stappen voor het starten van een run:
- Haal het beschermkapje alle buizen en reagens dalen. Bevestigen dat er voldoende capaciteit beschikbaar is op de fles vloeibaar afval. Bevestigen dat het vaste afval fles leeg is en bekleed met een biologisch gevaarlijk zak. Bevestigen dat de tip eject plaat wordt gecentreerd in het afval assemblage.
- Sluit de voorklep.
- Start de software. Open het bestand NA_Prep_Main_MLSTARlet.med.
- Klik op "Start". De status van het instrument schakelt vanuit stationair draaien aan het runnen.
- Voer het aantal monsters voor deze run. Kies de gewenste methode voor deze run (DNA = 0). Voer de positie van de eerste hoge volume tip, het selecteren van "1" als alle bakken vol zijn. Voer de positie van de eerste standaard volume tip, het selecteren van "1" als alle bakken vol zijn.
Opmerking: Het instrument zal dan lopen door geautomatiseerde stappen, zonder tussenkomst van de gebruiker. Een gedetailleerde workflow wordt getoond in figuur 2. Nadat het experiment voltooid, afval en tips reagens worden geïnjecteerd in het afval assembly. - Kwantificeren gezuiverd genomisch DNA door middel van een fluorometrische methode.
Opmerking: DNA-monsters die een minimale concentratie van 3,3 ng / ul bevatten, worden onderworpen aan ddPCR analyse (hoofdstuk 2).
2. DNA Mutation Profiling: ddPCR Protocol
Opmerking: Het protocol voor DNA-mutatie profilering bestaat uit 3 belangrijke stappen: 1) Druppeltje generatie, 2) Conventionele PCR-amplificatie, 3) Druppeltje lezen en 4) DNA-mutatie profilering.
2,1. Droplet generatie
Opmerking: ddPCR Supermix isddPCR aanbevolen, aangezien dit mengsel bevat reagentia die nodig zijn voor druppel genereren.
- Om besmetting te voorkomen, volgt standaard voorzorgsmaatregelen, zoals het dragen van handschoenen, met een schone PCR-kap, schone pipetten en lage-eiwit binding buizen.
- Zorg ervoor dat de minimale concentratie van het menselijk genoom DNA-monster is 3,3 ng / ul. Opmerking: De hoeveelheid gezuiverde DNA-monster concentratie zal variëren op basis van de analyse van% mutatie frequentie detectie.
- Monteer reactiemengsels in 96-wells PCR-platen. Ontdooi evenwicht en de reactiecomponenten tot kamertemperatuur. Bereid PCR-reacties door het combineren van 2X ddPCR supermix (10 pl) en 20 primers (voorwaartse en achterwaartse, 900 nm) en sonde (250 nm) met elk gezuiverd DNA-monster (66ng / 2 pl) maken tot 20 ui met gedestilleerd water (zoals per de druppelgenerator protocol)
- Vortex de meng tot homogeniteit en kort centrifuge waarborgen om de inhoud op de bodem van de reageerbuis te verzamelen voordat afgeven. Load 20 & #181, l op de cartridge voor druppelvorming.
- Werking van de druppelgenerator, per aanbevolen protocol van de fabrikant
- Plaats de cartridge in de houder met de inkeping in de cartridge geplaatst op de linker kant van de houder. Voeg 20 ui reactiemengsel dat monsters in het midden en 70 pl generator olie in de bodem wells.
- Bevestig de pakking aan de bovenkant van de patroon. Zorg ervoor dat de pakking stevig verslaafd aan beide uiteinden van de houder; anders zullen voldoende druk te genereren druppeltje niet worden bereikt.
- Open de druppel generator door op de groene knop op de bovenkant van het instrument en plaats de cartridge. Wanneer de houder in de juiste positie, zowel de kracht (rechts naar links) en de houder (midden rechts) lampjes zijn groen.
- Druk op de bovenste knop op het instrument opnieuw om de deur te sluiten en te initiëren druppel generatie. Let op: Na het indrukken van de bUtton, een spruitstuk positioneert zich over de uitlaat putten, tekenen olie en monsters door de microfluïdische kanalen, waar de druppels worden gecreëerd. Druppels stromen in de druppel en, waar ze zich ophopen. De druppel indicator (rechts) knippert groen na 10 seconden aan te geven dat druppel generatie plaatsvindt.
- Wanneer druppel generatie is voltooid, alle 3 de lampjes veranderen in continu groen; de deur te openen door op de knop en verwijder de houder van het apparaat. Verwijder de wegwerp pakking van de houder en gooi hem weg. Opmerking: De bovenste putjes van de patroon bevatten druppeltjes, en de middelste en onderste putjes bijna leeg is met een kleine hoeveelheid restolie.
2.2. Voorbereiding voor PCR
- Voor elk monster, pipet uit 40 gl van de inhoud druppel van boven alsook de cartridges in één putje van een 96-wells aanbevolen PCR plaat zoals in instrument protocol van de fabrikant. Neete: een multi-channel pipet is ideaal voor het overbrengen van de druppels emulsies. Langzaam en zacht aspiratie van druppels wordt aanbevolen om druppel scheren tijdens transfers te minimaliseren.
- Verzegeling van de PCR-plaat met folie onmiddellijk na de overdracht van druppels om verdamping te voorkomen. Gebruik doorboorbaar folie plaat zeehonden die compatibel zijn met de PCR-plaat sealer en de naalden in de druppel lezer zijn. Volg de instructies in de PCR-plaat sealer handleiding.
- Stel de plaatafdichter temperatuur tot 180 ° C en de tijd 5 sec.
- Raak de pijl om de deur te openen. Plaats de steun blok op de lade met de 96-well zijde naar boven. Plaats de 96-putjesplaat op het steunblok en controleer of alle putjes zijn uitgelijnd met het steunblok.
- Bedek de 96-well plaat met 1 vel doorsteekbaar folie afdichting. Nadat de 96-well plaat is bevestigd aan het steunblok en bedekt met de doordringbaar folieafdichting, raakt de afdichting knop. De lade gaat dichten warmte afdichting zal starten.
- Wanneer warmte verzegeling voltooid is, de deur gaat automatisch open; Verwijder de plaat uit de hitte blok voor de thermische cycli en verwijder vervolgens het vuur te blokkeren.
- Zorg ervoor dat alle putten in de plaat wordt afgesloten door te controleren of depressies in de folie zijn duidelijk zichtbaar in elk putje. Eenmaal afgesloten, de plaat gereed voor de temperatuurcycli.
- Zodra druppels worden verwijderd, drukt u op de grendels op de patroonhouder om deze te openen. Verwijder de lege cartridge en gooi deze weg.
- Voer conventionele PCR-amplificatie door de parameters in tabel 2.
2,3 Droplet lezing (volgens aanbevolen protocol van de fabrikant)
Opmerking: Na PCR-amplificatie van het doelwit nucleïnezuur in de druppels, de druppel lezer instrument analyseert elke druppel afzonderlijk met een 2-kleuren detectiesysteem 13. We meestal ingesteld op FAM een detecterend VIC reporter fluoroforen.
- Klik op "Flush systeem" naar prime de druppel lezer en maken het klaar voor ddPCR analyse.
- Laad de plaat in de druppel lezer en klik op "starten." De druppel lezer zuigt elk monster, singulates de druppels en stromen ze in één bestand verleden een 2-kleuren detector. De detector leest de druppeltjes positieve en negatieve monsters te sommen.
- Wanneer druppel lezen is voltooid, opent de deur en verwijder de plaat houder van het apparaat. Verwijder de 96-well PCR-plaat uit de houder en gooi hem weg.
- Voor het juiste onderhoud, vervanging van de druppel lezer olie en leeg de afvalbak als dat nodig is. Voeg 50 ml 10% bleekwater de afvalfles om microbiële groei te voorkomen.
2.4 DNA-mutatie profiling (volgens aanbevolen protocol van de fabrikant)
Opmerking: PCR-positieve en negatieve PCR-druppels geteld absolute quantific biedenatie van target BRAF V600E DNA-mutaties in digitale vorm, met behulp van data-analyse software.
- Klik Setup om informatie over de monsters, testen en experimenten te voeren.
- In het venster Setup, laad een plaat (filename.qlp), klik vervolgens op Analyseren om de gegevens te openen en analyseren. De data-analyse-interface is verdeeld in drie vensters: Resultaten Tabel, Well Selector en verwerkte gegevens / grafische display.
- In het venster Verwerkte gegevens, concentratie data voor elk doel verschijnen in de putten in de plaat kaart en worden in tabelvorm in de resultaten tabel. Klik Concentratie om gegevens in concentratie plots te visualiseren.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Voor onze ddPCR analyse, bestudeerden we de BRAF mutatie V600E FFPE referentiestandaard cellijnen. De druppel lezer wordt aangesloten op een laptop computer met data-analyse software. Elke individuele druppel wordt bepaald op basis van fluorescerende amplitude als positief of negatief. De software die door de fabrikant maakt ook een door de gebruiker gedefinieerde cutoff te worden ingevoerd om de drempel tussen de positieve en negatieve druppels definiëren. Het aantal positieve en negatieve druppels in een mons...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Hier belichten we de toepasbaarheid van ddPCR en DNA-isolatie uit FFPE referentie standaard cellijn monsters voor een bepaalde genmutatie assessment. In deze studie wordt TPS geautomatiseerde DNA-isolatie methode die gemakkelijk kan worden aangepast, geautomatiseerde, en is geschikt voor maximaal 48 verschillende monsters tegelijk, waardoor voor grotere schaal experimenten en lagere variabiliteit. Een van de beperkingen van de DNA-isolatie in dit werk is dat elke FFPE sample is uniek en verschilt elkaar verontreiniginge...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Myung Ryuri Oh, Si Eun Kim, en Young Deug Kim zijn medewerkers van ABION CRO.
Dankbetuigingen
Dit onderzoek werd gesteund door de R & D-programma voor de Vereniging van de National Research Foundation (NRF), gefinancierd door het ministerie van Wetenschap, ICT & Future Planning (Grant No. 2013M3C8A1075908).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Hamilton MICROLAB STARlet IVD instrument | Siemens | 10701001 | Geautomatiseerd DNA-isolatie-instrument |
| QX200 Droplet Generator | Bio-Rad | 772BR1119 | |
| QX200 Droplet Reader | Bio-Rad | 771BR1497 | |
| Conventionele PCR-machine met instelbare ramp-tijd | 621BR17718 | ||
| PX1 PCR plate sealer | Bio-Rad | 770BR1575 | |
| QuantaSoft software | Bio-Rad | ||
| DNA-isolatiekit | |||
| VERSANT Tissue Preparation Reagents Box 1 | Siemens | 10632398 | |
| VERSANT Tissue Preparation Reagents Box 1 | Siemens | 10632399 | |
| CO-RE tips | Siemens | ||
| ddPCR mutatieanalyse | |||
| ddPCR Supermix | Bio-Rad | BR186-3010 | 2X concentratie |
| DG8 cartridge | Bio-Rad | BR186-4008 | |
| Droplet Generator olie | Bio-Rad | BR-186-3005 | |
| Gasket | Bio-Rad | BR186-3006 | |
| Droplet reader olie | Bio-Rad | BR-186-3004 |
Referenties
- Vogelstein, B., et al. Genetic alterations during colorectal-tumor development. The New England journal of medicine. 319, 525-532 (1988).
- Davies, H., et al. Mutations of the BRAF gene in human cancer. Nature. 417, 949-954 (2002).
- Solit, D. B., et al. BRAF mutation predicts sensitivity to MEK inhibition. Nature. 439, 358-362 (2006).
- Wong, K. K. Recent developments in anti-cancer agents targeting the Ras/Raf/ MEK/ERK pathway. Recent patents on anti-cancer drug discovery. 4, 28-35 (2009).
- Brose, M. S., et al. BRAF and RAS mutations in human lung cancer and melanoma. Cancer research. 62, 6997-7000 (2002).
- Wang, L., et al. BRAF mutations in colon cancer are not likely attributable to defective DNA mismatch repair. Cancer research. 63, 5209-5212 (2003).
- Hindson, B. J., et al. High-Throughput Droplet Digital PCR System for Absolute Quantitation of DNA Copy Number. Anal Chem. 83, 8604-8610 (1021).
- Pinheiro, L. B., et al. Evaluation of a Droplet Digital Polymerase Chain Reaction Format for DNA Copy Number Quantification. Anal Chem. 84, 1003-1011 (1021).
- Jones, M., et al. Low copy target detection by Droplet Digital PCR through application of a novel open access bioinformatic pipeline, 'definetherain'. Journal of virological methods. 202, 46-53 (2014).
- Strain, M. C., et al. Highly precise measurement of HIV DNA by droplet digital PCR. PloS one. 8, e55943(2013).
- Miotke, L., Lau, B. T., Rumma, R. T., Ji, H. P. High sensitivity detection and quantitation of DNA copy number and single nucleotide variants with single color droplet digital PCR. Anal Chem. 86, 2618-2624 (2014).
- Bizouarn, F. Clinical applications using digital PCR. Methods in molecular biology. 1160, 189-214 (2014).
- McDermott, G. P., et al. Multiplexed target detection using DNA-binding dye chemistry in droplet digital PCR. Anal Chem. 85, 11619-11627 (2013).
- Milbury, C. A., et al. Determining lower limits of detection of digital PCR assays for cancer-related gene mutations. Biomolecular detection and quantification. 1, 8-22 (2014).
- Zhu, G., et al. Highly Sensitive Droplet Digital PCR Method for Detection of EGFR Activating Mutations in Plasma Cell-Free DNA from Patients with Advanced Non-Small Cell Lung Cancer. The Journal of molecular diagnostics: JMD. , (2015).
- Fan, H., Gulley, M. L. DNA extraction from paraffin-embedded tissues. Methods in molecular medicine. 49, 1-4 (2001).
- Nadauld, L., et al. Quantitative and Sensitive Detection of Cancer Genome Amplifications from Formalin Fixed Paraffin Embedded Tumors with Droplet Digital PCR. Translational medicine. 2, (2012).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
