Driedimensionale Kwantificering van Dendritische stekels van Piramidale Neuronen afgeleid van menselijk geïnduceerde pluripotente stamcellen

Summary

Dendritische stekels van piramidale neuronen zijn de sites van de meest prikkelende synapsen in de hersenen van zoogdieren cortex. Deze methode beschrijft een 3D-kwantitatieve analyse van de wervelkolom morfologie in menselijke corticale piramidale glutamaat neuronen afgeleid van geïnduceerde pluripotente stamcellen.

Abstract

Dendritische kleine uitsteeksels die overeenkomen met de postsynaptische compartimenten van exciterende synapsen in het centrale zenuwstelsel. Ze zijn verdeeld langs de dendrieten. De morfologie is grotendeels afhankelijk van neuronale activiteit en de dynamiek. Dendritische stekels uiten glutamaat receptoren (AMPA en NMDA-receptoren) op hun oppervlak en op het niveau van postsynaptische dichtheden. Elke rug kan de neuron zijn staats-en lokale activiteiten zelfstandig te regelen. Spine morfologieën zijn uitgebreid bestudeerd in glutamaterge piramidale cellen van de hersenen cortex hand van in vivo technieken en neuronale cultures verkregen uit knaagdieren weefsels. Neuropathologische aandoeningen worden geassocieerd met veranderde wervelkolom inductie en rijping, zoals in knaagdieren gekweekte neuronen en eendimensionaal kwantitatieve analyse ^1. De huidige studie beschrijft een protocol voor de 3D-kwantitatieve analyse van de wervelkolom morfologie met menselijke cortical neuronen afgeleid van neurale stamcellen (late corticale voorouders). Deze cellen werden aanvankelijk verkregen van geïnduceerde pluripotente stamcellen. Dit protocol maakt de analyse van de wervelkolom morfologieën in verschillende perioden cultuur, en met mogelijke vergelijking van geïnduceerde pluripotente stamcellen verkregen uit controle individuen met die verkregen bij patiënten met psychiatrische aandoeningen.

Introduction

Dendritische stekels van corticale piramidale neuronen zijn klein en dun uitsteeksels die zijn verdeeld over de basale en apicale dendrieten van deze neuronale subtypes in knaagdieren, primaten en menselijke hersenen. Zij zijn de sites van de meest prikkelende synapsen en belangrijke functies in het leren en cognitieve processen weer te geven. De gedetailleerde structuur van de menselijke dendritische stekels zijn technisch bestudeerd door elektronenmicroscopie ^2. Dergelijke benadering tijdrovend en vertegenwoordigt hoge werkdruk. Meer recent heeft een driedimensionale (3D) reconstructie van de morfologie van de dendritische gemeld in menselijke hersenen cortex met behulp van specifieke software gecombineerd om grote handmatige analyse ruggengraat ^3.

Groene fluorescentie eiwit (GFP) technologie gekoppeld met immunofluorescentie een exacte hulpmiddel voor de identificatie en meting ruggengraat vorm door fluorescentiemicroscopie. Deze benadering kan eenvoudig worden toegepast op gekweekte neuronen. However zijn geen gegevens gemeld op de analyse van de wervelkolom rijping en morfologie menselijke neuronen afkomstig van geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC).

Het doel van deze studie was om een protocol dat dendritische spine beeldvorming uit gekweekte humane neuronen in vitro mogelijk maakt te beschrijven. GFP etikettering, confocale microscopie en 3D-analyse van de gloeidraad Tracer module van Imaris software werden gebruikt in het huidige protocol. Cultuur stappen die nodig zijn om corticale glutamaterge neuronen lagen te verkrijgen II tot IV van neurale stamcellen (NSC) zijn ook hier in het kort beschreven. De gehele protocol voor menselijke NSC productie is reeds elders ⁴ gepubliceerd.

Protocol

1. neuronale Cultuur

Opmerking: Fibroblast herprogrammering in pluripotente stamcellen, inzet voor de dorsale telencephalon afstamming, afleiding, versterking, en het bankwezen van de late corticale voorlopercellen (LCP) werden beschreven in Boissart et al ^4. Neuronale differentiatie van LCP-achtige cellen werd eveneens uitgevoerd volgens Boissart et al ⁴ met geringe modificaties. Andere procedures ontwikkeld voor de directe herprogrammering van fibroblasten in geïnduceerde pluripotente stamcellen, gevolgd door hun differentiatie tot neuronen. Dit protocol werd behouden aangezien het de selectieve productie van piramidale neuronen glutamaat.

1. Behandel 6-putjes platen met glazen dekglaasjes met poly-ornithine (verdund tot 06/01 in DPBS, voorraadconcentratie 0,01%) O / N, gevolgd door drie wassingen in DPBS. Voeg dan laminine (stock concentratie 1 mg / ml, verdund in DPBS 500 keer) gedurende ten minste 10 uur onder stroomkap .
2. Plaat en verzending NSC lage dichtheid (50.000 cellen / ^cm2) in 6-putjes platen met glazen dekglaasjes in 3 ml kweekmedium bestaande uit DMEM / F12 (500 ml), 2 flesjes (5 ml elk) van N2 supplement, 2 injectieflacons (elk 10 ml) van B27 supplement, 10 ml Pen-streptomycine (Penicillin = 10.000 eenheden / ml en streptomycine = 10.000 eenheden / ml), 1 ml 2-mercaptoethanol (voorraadoplossing: 50 mM) en laminine (1 / 500), zonder groeifactoren. Kritische stap: Voer deze stap zorgvuldig door de toevoeging van cellen met langzame roterende bewegingen om de cel clustering verminderen.
3. Verwijder het kweekmedium. Voeg N2B27 vers medium met 2 ug / ml laminine verse oplossing van het neuron bevestigd aan de dekglaasjes houden en klonteren te voorkomen. Verander het medium om de 3 dagen. Houd enkele resterende medium (200 ui) voor het toevoegen van vers medium om te voorkomen dat de cel uitdrogen. Als alternatief, gaat snel en het totale volume (3 ml) veranderen.

e_title "> 2. Lentivirale Transduction

Opmerking: GFP lentivirale vectoren werden vriendelijk verschaft door Dr. Uwe Maskos Laboratory Institut Pasteur (Parijs) en bereid volgens het gepubliceerde protocol ^5. GFP-expressie wordt gestuurd door de muis fosfoglyceraatkinase (PGK) promoter. Voor dit onderzoek virustiter was 400 ng / ul (voorraadoplossing in 1x PBS).

1. Transduceren menselijke iPSC-afgeleide neuronen naar elke stap van rijping van virusdeeltjes door toevoeging van 1 pi van de voorraadoplossing van 40 ng GFP lentivirale vector per kweekputje (6-well platen) en incubeer 48 uur in vers kweekmedium. Opmerking: Voor dit protocol, de duur van de incubatie kan een goede etikettering van de wervelkolom structuren.

3. Immunofluorescentie

Opmerking: Om de kenmerken van de gehele wervelkolom morfologie te verbeteren, werd immunofluorescentie labeling uitgevoerd met een anti-GFP antilichaam in permeabel omstandigheden.

1. Verwijder kweekmedium en bevestig getransduceerde cellen op dekglaasjes in 4% paraformaldehyde gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur, daarna wassen 3 keer in 1 x PBS (10 min elk).
2. Onderdompelen dekglaasjes in PBS gesupplementeerd met 0,05% Triton (100x) en 10% paardenserum gedurende 1 uur bij KT, daarna wassen 3 keer in 1 x PBS.
3. Voeg 100 ul van 1 x PBS, aangevuld met 4% paardenserum en primaire antilichaam (1 / 1.000) opgewekt tegen GFP en verdund met een factor 1000 op elke dekglaasje. Incubeer in een donkere doos O / N bij 4 ° C, was daarna 3 maal met 1 x PBS.
4. Verdun Alexa Fluor 488-geconjugeerd antilichaam (1/200) in PBS aangevuld met 0,5% Tween 20 en incubeer gedurende 1 uur bij KT. Was daarna 3 keer in 1x PBS en monteer dekglaasjes op glasplaatjes met montage medium voor fluorescentiemicroscopie.

4. Dendritische Spine Imaging

1. Voeren confocale Imaging door een confocale laser scanning microscoop.
2. Kies gezonde neuronen met een piramidale morfologiend een volledige dendritische arborization en kwantificeren van ten minste 10 neuronen per voorwaarde uit afzonderlijke experimenten. Kwantificeren 60-100 micrometer per dendrite.
3. Verwerven van beelden met behulp van een 40x olie NA = 1,3 objectief en een 488 nm laser lijn voor GFP excitatie, met een typisch piekvermogen op sample niveau rond de 20 uW. Set pixelgrootte ongeveer 80 nm goed proeven dendritische.
   Opmerking: De volgende analyse roep om een ​​beeld waarin het geluid niet de juiste segmentatie van dendrieten en stekels in gevaar brengen. Met de hierboven vermelde ruimtelijke verdeling en vermogensinstellingen, waargenomen dat een pixel verblijftijd van 3,15 microseconden voldoende om genoeg fotonen dergelijk beeld bouwen verzamelen. Voor dim monsters, kan de beeldkwaliteit verbeterd worden door het gemiddelde 2-4 scans. De overname van een aantal XY tegels kunnen nodig zijn om het gebied van belang, dat dan moet worden genaaid elkaar vóór verwerking daarvan.
4. Om het hele neuron volume proeven, het verwerven van een Z-stack, metZ een tussenruimte van 150 nm tot 300 nm, waarbij 20 tot 30 Z slices.
   Opmerking: De laterale ruimtelijke resolutie bereikt met deze instellingen is 234 nm en de axiale resolutie is 591 nm. De gekozen sampling is voldoende, maar de axiale resolutie groter is dan de kleinste afmeting van de stekels te beelden, de analyse begunstigt de stekels die lateraal uitstrekken van de dendrieten.
   

5. 3D kwantificering van Dendritische stekels

Opmerking: De volgende paragrafen specifiek gebruik van de Imaris software voor analyse te beschrijven. Alternatieve implementaties bestaan, zoals NeuronStudio ¹⁵ of Metamorph ^8, die dezelfde resultaten geven.

Gebruik de volgende belangrijke instellingen:

1. Als een pre-processing fase gebruiken Gauss-filtering door de beeldverwerking mogelijkheden van de software. Gauss-filtering uit te voeren via de Beeldverwerking> Smooding> Gaussian Filter. Stel het filter breedte gelijk aan de pixelgrootte in XY te zijn.
2. Voer een semi-automatische opsporing van dendrieten via de Filament Tracer module van de software.
   1. Ten eerste, een schatting van de dendriet diameter, met behulp van de functie afstand in het tabblad Slice van de software.
   2. In het tabblad overtreffen, klikt u op de filamenten tool. Voor een betere robuustheid, dit protocol is gebaseerd op semi-automatische volgen; klik op Skip automatisch aanmaken. De module-interface toont nu het tabblad Draw. Selecteer hier AutoPath als een methode, Dendrite als een type, en voer de geschatte dendrite diameter.
   3. Gebruik de Select modus van de aanwijzer, het draaien van de cursor in een doos. Shift-klik met de rechtermuisknop op het dendrite uitgangspunt. Let op: de software voert oorspronkelijke berekeningen.
   4. Beweeg de cursor over de dendriet. Vanaf het startpunt (vertegenwoordigted als een blauwe bol), een gele lijn die de meest waarschijnlijke dendrite pad wordt getoond. Shift-links-klik op de dendriet eindpunt.
3. Voer de stekels automatische segmentatie. Opmerking: De stekels op het overgetrokken dendriet automatisch moeten worden gevonden door de module-interface.
   1. In de module-interface, klik op het tabblad Creation. In de Rebuild drop-lijst, kies Rebuild Dendrite Diameter en vink het vakje Keep data. Klik vervolgens op Rebuild.
   2. Stel de drempel, zodat de gesegmenteerde volume overeenkomt met de werkelijke dendriet volume. Als een algoritme selecteert Kortste Afstand vanaf Straal Map. Klik op de knop Volgende.
   3. Bepaal de kleinste wervelkolom hoofd diameter en de maximale lengte, opnieuw met behulp van de functie afstand in het tabblad Slice van de software, kom dan terug naar het tabblad Surpass en voer de parameters. Fof dit protocol, waarden rond 200-300 nm voor een minimale diameter en 4 micrometer voor een maximale lengte zijn goede aanknopingspunten. Niet controleren toestaan ​​Branch Spines doos. Klik op de knop Volgende.
   4. Pas de Seed Points Threshold zodat de blauwe punten vertegenwoordigen stekels lokaliseren werkelijke ruggengraat hoofden. Klik op de knop Volgende. Opmerking: De kern berekening is nu klaar en kan lang duren.
4. Classificeren stekels door te gaan naar het tabblad Extra van de module interface. Klik op classificeren Spines. In de gebruikersinterface wordt gevraagd, zorg ervoor dat er vier klassen, gedefinieerd door hun morfologie als volgt: Stubby: lengte <1 micrometer; Paddestoel: Lengte (ruggengraat)> 3 en Max breedte (kop)> betekenen breedte (nek) x 2; Lange dunne: Gemiddelde breedte (kop) ≥ Mean breedte (nek); Filopodia-achtige: Lengte ≤ 4 micrometer (geen hoofd).
   Opmerking: De moDule-interface genereert vier nieuwe gloeidraad objecten met de resultaten van de indeling.
5. Export Statistische gegevens: op een van deze vier voorwerp interfaces, ga naar het tabblad Statistieken.
   Klik op de Export Alle statistieken om de knop Bestand.
   Opmerking: andere statistische waarden kunnen worden uitgevoerd om dendrieten (bijv., Lengte, oppervlakte, gemiddelde diameter, branch diepte vertakkingshoek, volume, enz.), En stekels (bv rechtheid, bevestigingsgebied, lengte en volume afzonderlijke wervelkolom onderdelen, wervelkolom diameter, dichtheid, enz.)

Results

De huidige studie beschrijft een gestandaardiseerd protocol voor de rug kwantificering van gekweekte dendrieten van piramidale neuronen afgeleid van iPSC. Dit protocol maakt de analyse van de wervelkolom rijping menselijke neuronen en de mogelijke vergelijking met de rijping van de stekels in standaard knaagdieren neuronale kweken als in in vivo diermodellen.

Figuur 1A geeft een schema van de verschillende stappen van de cultuur die de productie van corticale ...

Discussion

De kwantificering van de morfologische kenmerken van piramidale neuronen gebruikt de software. De Filament Tracer-interface werd gebruikt voor segmentatie van neuronen en stekels, en XT module werd gebruikt voor de analyse.

Om de nauwkeurigheid van onze techniek te analyseren, we eerst vergeleken de gemeten morfologische parameters (lengte, oppervlakte, en het totale volume ruggengraat indien van toepassing), met die gepubliceerd met de rat volwassen piramidale neuronen in cultuur ^{6, 7 ...}

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
D-PBS (1x), zonder Calcium, Magnesium en Fenol Red	Gibco/ Life Technologies	14190169
Poly-L-Ornithine Solution Bioreagent	Sigma Aldrich	P4957
Mouse laminine	Dutscher Dominique	354232
N2 Supplement	Gibco/ Life Technologies	17502048
B-27 Supplement zonder Vitamine A (50x)	Gibco/ Life Technologies	12587010
DMEM/NUT.MIX F-12 MET GLUT-I	Gibco/ Life Technologies	31331028
Neurobasal Med SFM	Gibco/ Life Technologies	21103049
2-mercaptoethanol	Gibco/ Life Technologies	31350-010
Penicillin-Streptomycin	Gibco/ Life Technologies	15140-122
GFP Konijnen Serum Polyklonaal Antilichaam	Gibco/ Life Technologies	A-6455
Paarden serum	Gibco/ Life Technologies	16050130
Alexa Fluor 488 Geit Anti-Konijn	Gibco/ Life Technologies	A11034
Polyklonaal Anti-betaIII tubuline Antilichaam	Millipore	AB9354
Dekglazen 13 mm	VWR	631-0150
Prolong Gold Antifade Reagens met DAPI	Gibco/ Life Technologies	P36931
Tween(R) 20 Bioextra, Viscose Vloeistof	Sigma Aldrich Chimie	P7949
Triton X-100	Sigma Aldrich Chimie	X100-100ML
Menselijk Fibroblasten	Coriell Cell Line Biorepository	GM 4603 en GM 1869	Coriell Institute for Medical Research, Camden, NJ, USA
Confocal laserscanning microscoop	Zeiss (Duitsland)	LSM 700
Imaris Software	Bitplane AG, Zürich	6.4.0 versie	Filament Tracer en Imaris XT modules zijn noodzakelijk
Huygens Software	Huygens software, SVI, Nederland	Pro versie	Optioneel (voor deconvolutie testen)