Methodenartikel

Monitoring endoplasmatisch reticulum calciumhomeostase Met behulp van een

11.8K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/53199

⸱

6 september 2015

 ,  ,  ,  , 
1National Institute on Drug Abuse, National Institutes of Health

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Calciumhomeostase van het endoplasmatisch reticulum is verstoord bij verschillende pathologieën. Een uitgescheiden ER calcium-monitoring-eiwit (SERCaMP) reporter kan worden gebruikt om verstoringen in de ER calciumopslag te detecteren. Dit protocol beschrijft het gebruik van een Gaussia luciferase SERCaMP om ER calciumhomeostase in vitro en in vivo te onderzoeken.

Samenvatting

Het endoplasmatisch reticulum (ER) bevat het hoogste niveau van intracellulair calcium, bij concentraties die ongeveer 5000-voudig hoger dan cytoplasmatische niveaus. Strakke controle over ER calcium is noodzakelijk voor het vouwen van eiwitten, modificatie en mensenhandel. Storingen ER calcium leidt tot activering van het ongevouwen eiwit respons, een driepolige ER stress respons mechanisme, en bijdragen aan de pathogenese van diverse ziekten. De mogelijkheid om ER calcium veranderingen volgen tijdens begin van de ziekte en progressie van belang in principe maar uitdagende praktijk. Momenteel beschikbare methoden voor de controle ER calcium, zoals calcium-afhankelijke fluorescerende kleurstoffen en eiwitten hebben inzicht gegeven in ER calcium dynamiek in cellen, maar deze instrumenten zijn niet geschikt voor in vivo studies. Ons laboratorium heeft aangetoond dat een wijziging van het carboxy-uiteinde van Gaussia luciferase verleent uitscheiding van de reporter als reactie opER calciumdepletie. De werkwijzen voor het gebruik van luciferase gebaseerde, afgescheiden ER calciumspiegel eiwit (SERCaMP) in vitro en in vivo toepassingen worden hierin beschreven. Deze video belicht de lever injecties, farmacologische manipulatie van Gluc-SERCaMP, bloedafname en verwerking, en test parameters voor longitudinale monitoring van ER calcium.

Inleiding

Het endoplasmatisch reticulum (ER) functies in vele cellulaire capaciteiten zoals het vouwen van eiwitten, eiwit secretie, lipide homeostase, en intracellulaire signalering 1. Centraal in normale ER functie handhaaft luminale calciumconcentraties bij ~ 5000 keer die gevonden in het cytoplasma 2-4. Deze energie-intensief proces wordt gereguleerd door de Sarco / endoplasmatisch reticulum calcium ATPase (SERCA), een pomp die calciumionen verhuist naar de ER. Efflux van calcium uit het ER wordt gemedieerd voornamelijk door de ryanodine (RyR) en inositoltrifosfaat (IP3R) receptoren. Omdat veel ER processen zijn afhankelijk van calcium, verstoren de winkel kan leiden tot ER stress en uiteindelijk celdood.

ER calcium disregulatie waargenomen bij ziekten zoals cardiomyopathie, diabetes, ziekte van Alzheimer en Parkinson 5. Als gevolg van het progressieve karakter van deze ziekten, is het een uitdaging om de oorzaak-effect opnieuw af te bakenenlationship tussen pathogenese en veranderingen in de ER calcium winkel. Een aantal technologieën hebben geleid tot significante vooruitgang in ons begrip van ER calcium dynamiek, waaronder kleurstoffen en genetisch gecodeerd calcium indicatoren (Geçiş). Lage affiniteit calcium kleurstoffen, die toenemen in fluorescentie indien gebonden aan Ca2 +, kan in cellen worden geladen subcellulaire compartimenten met een hoge concentratie calcium 6 onderzocht. Geçiş, zoals D1ER en catcher zorgen voor monitoring van calcium fluctuaties met meer nauwkeurige controle van de subcellulaire lokalisatie 7-9. Onlangs, een andere klasse van Geçiş genoemd calcium meten organel ingesloten eiwit indicators (CEPIA) beschreven 10. Een derde benadering combineert genetica en kleine molecule chemie is gericht loading dye-esterase (TED), waarin een genetisch gecodeerde carboxylesterase (gericht naar de ER) met een op ester gebaseerde calcium kleurstof 11 gebruikt.

Terwijl de AFORementioned benaderingen hebben inherente sterke en zwakke punten, kunnen ze waardevol inzicht in ER calcium dynamiek bieden door middel van acute metingen van de fluorescentie. Ze zijn echter niet optimaal voor longitudinale studies vaak vereist om ziekteprogressie te onderzoeken. Met als doel het ontwerpen van een werkwijze voor calciumdynamiek monitoren gedurende langere tijdsperioden, identificeerden we en ontwikkelde een eiwit wijziging van het uitgescheiden ER calcium controle eiwitten (SERCaMPs) 12 maken.

SERCaMP omzeilt verscheidene beperkingen geassocieerd met andere methoden, door een minimaal invasieve benadering herhaaldelijk ondervragen de ER calcium opslag. We hebben eerder aangetoond dat het carboxy-eindstandige peptide ASARTDL (alanine-serine-alanine-arginine-threonine-asparaginezuur-leucine) voldoende is om ER retentie te bevorderen; echter, onder omstandigheden die leiden tot afname in ER calcium, de peptidesequentie niet meer kan handhaven ER localization en het eiwit wordt uitgescheiden 13. De basis van de SERCaMP technologie is het aanhangsel van ASARTDL het carboxy-uiteinde van een uitgescheiden eiwit (bijv Gaussia luciferase of gluc) zodanig dat secretie veroorzaakt door ER calciumdepletie, waardoor een robuuste reporter van ER calcium disregulatie 12. De expressie van gluc-SERCaMP via transgene werkwijzen maakt biologische vloeistoffen zoals celkweekmedium en plasma worden geanalyseerd op veranderingen in gluc activiteit als indicator van ER calcium homeostase. De werkwijze heeft toepassingen voor longitudinaal onderzoek progressieve veranderingen in het ER calcium opslag zowel in vitro als in vivo. Het volgende protocol is geschreven als een algemene schets voor het gebruik van gluc-gebaseerde SERCaMP ER calciumhomeostase studeren, maar het protocol kan dienen als leidraad voor alternatieve reporter SERCaMPs.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. In vitro test: Het opsporen SERCaMP release van een stabiele SH-SY5Y Cell Line

  1. Plaat SH-SY5Y-gluc-ASARTDL (SERCaMP) in weefselkweek behandeld platen bij 150.000 cellen per cm2 van de oppervlakte. Voor 96 putjes, bijvoorbeeld zaad 50.000 cellen per putje (figuur 1A). Grow SH-SY5Y cellen in DMEM (hoog glucose, GlutaMAX, pyruvaat) + 10% bovine growth serum + 1x penicilline / streptomycine.
    1. Passage cellen tot 15 maal (Figuur 1B). Hogere passage nummer is niet getest.
    2. Terugkeer cellen bevochtigde incubator bij 37 ° C met 5,5% CO2 en incubeer overnacht.
  2. Voor experimentele behandeling (en), laat een referentiemonster voor elke wel door de overdracht van 5 ul kweeksupernatant een ondoorzichtige wanden 96 putjesplaat. Voor het verzamelen, tik de plaat aan alle kanten en wervelen om gradiënt effecten te voorkomen. Verzegelen de ondoorzichtige plaat met een lijm sealing blad en bewaar bij 4 ° C op het moment van enzymatische test.
    Opmerking: Uitgescheiden gluc-SERCaMP zeer stabiel in celkweekmedium. We eerder gemeld ongeveer 5-10% van GLUC activiteit verloor na 72 uur incubatie bij 37 ° C (geïncubeerd op SH-SY5Y cellen) 12.
  3. Behandel cellen zoals gewenst ER calciumdepletie onderzocht (bv milieu, farmacologische, genetische manipulatie). Vermijd lange blootstelling aan omgevingsomstandigheden (buiten de gecontroleerde incubator) als pH-veranderingen snel zullen plaatsvinden bij atmosferische CO 2. Voeg HEPES aan het kweekmedium bij 20 mM, pH 14 te stabiliseren, indien verlengd manipulaties vereist. Vermijd blootstelling aan het licht bij het ​​gebruik HEPES in kweekmedium 15.
    1. Positieve controle: Behandel de cellen met 100 nM thapsigargine (Tg) of 50 uM cyclopiazonzuur (CPA) voor 4-6 uur voor experimenten in de SH-SY5Y cellen. Maximale reactie in andere cellijnen kan langer incubaties of verschillende concen vereisentraties van verbindingen.
    2. Negatieve controle: Collect kweekmedium van ouderlijke SH-SY5Y cellen. In onze ervaring, de achtergrond luminescentie voor deze test is minder dan 0,05% van de basale secretie van stabiel SH-SY5Y-Gluc-SERCaMP cellen.
  4. Verzamelen en opslaan 5 pl monsters van geconditioneerde media op de gewenste tijdstippen, zoals in stap 1,2.
  5. Beoordelen enzymatische activiteit in het medium zoals beschreven in hoofdstuk 5.
  6. Onderzoek intracellulaire gluc door immunoblot of luminescentie test.
    1. Voor immunoblot: lyseren cellen in gemodificeerde RIPA buffer die 50 mM Tris (pH 7,4), 150 mM NaCl, 0,25% natrium deoxycholaat, 1 mM EDTA, 1% NP40, en proteaseremmers. Afzonderlijk op SDS-polyacrylamidegel en transfer naar 0,20 um PVDF membraan. Incubeer membraan met gluc antilichaam (1: 2000 verdunning) overnacht bij 4 ° C. Voer secundair antilichaam incubatie en wassen membraan volgens gebruiker gedefinieerde protocol voor detectie reagens gekozen.
    2. Voorluminescentie assay (figuur 2): Voer de volgende stappen op het ijs:
      1. Verwijder alle medium uit putten van de weefselkweek plaat en spoel af met 200 ul koud PBS.
      2. Voeg 75 ul lysisbuffer bevattende 50 mM Tris (pH 7,5), 150 mM NaCl, 1% NP40 en proteaseremmers aan elk putje.
      3. Draai de plaat op een orbitale schudinrichting (120 opm) bij 4 ° C gedurende 20 min.
      4. Voorzichtig pipet het lysaat op en neer met behulp van een multichannel pipet, het vermijden van luchtbellen. Transfer 5 pi lysaat om een ​​ondoorzichtige plaat en beoordelen luminescentie zoals beschreven in hoofdstuk 5.

2. In Vitro Assay: Transiënte transfectie van geïmmortaliseerde cellen met SERCaMP

Let op: We hebben vastgesteld dat voorbijgaande transfectie procedures cellulaire stress kan veroorzaken en stompe de daaropvolgende gluc-SERCaMP respons. De volgende aanpak is ontwikkeld om transfectie eff minimaliseren ects in SH-SY5Y cellen. Optimalisatie van deze procedure (inclusief keuze van transfectie reagens) voor afwisselende cellijnen nodig zijn. Als het mogelijk is, is het raadzaam om stabiele cellijnen of virale transductie methoden respectievelijk uiteengezet in de punten 1 en 3 te gebruiken.

  1. Plate SH-SY5Y-cellen in een 100 mm schaal van 4 x 10 6 cellen. Deze schotel voldoende opnieuw seed ongeveer 300 putten (96 well plaat formaat) na transfectie procedure.
  2. Transfecteren van cellen met Xfect reagens middels 20 ug plasmide DNA (coderende gluc-SERCaMP) en 6 pl Xfect reagens. Grootschalige DNA en Xfect reagens dienovereenkomstig voor grotere of kleinere kweekvaten.
  3. Terugkeer cellen incubator gedurende 48 uur.
  4. Trypsinize cellen en reseed 96 putjes bij 60.000 cellen per putje. Volg de volgende stappen in paragraaf 1.

3. In vitro test: Viral Vector-gemedieerde expressie van Gluc-SERCaMP

tent "> Opmerking: adeno-geassocieerde virale (AAV) vector verpakking 16 en de zuivering 12 en lentivirus productie 13 zijn eerder gerapporteerd.

  1. Titer gluc-SERCaMP AAV gebruikmaking van de volgende primers en probes: voorwaartse primer, 5'- CACGCCCAAGATGAAGAAGT-3 '; reverse primer, 5'-GAACCCAGGAATCTCAGGAATG-3 '; probe (5'-6-FAM / 3'-BHQ-1 gemerkte), 5'-TACGAAGGCGACAAAGAGTCCGC-3 'voor kwantitatieve PCR.
    1. Bereid de standaardcurve door lineariseren een plasmide dat gluc en zuiveren van het DNA met behulp van een spin-kolom (bijv Machery-Nagel NucleoSpin Gel en PCR cleanup). Kwantificeren het DNA door scheiding op een agarosegel naast een massa ladder. Bereid 1:10 verdunningen van DNA van 100 pg / ml op 10 fg / ml in PBS. Bereken de kopieën / ml gluc plasmide-DNA bij elke concentratie op basis van het molecuulgewicht van het plasmide.
    2. Verdun de AAV voorraden in PBS (geschikte verwatering zal afhankelijk zijnparameters van viruspreparaat en empirisch bepaald).
    3. Voer de PCR-reactie in een real-time PCR met behulp van de volgende omstandigheden: 95 ° C x 5 min, 94 ° C x 20 sec en 60 ° C x 1 min gedurende 41 cycli. Bereken kopieën / ml met behulp van de standaard curve.
  2. Titer lentivirus met een p24 Lenti-X snelle titer kit. Dooi lentiviraal monsters op ijs en verdun de controle p24 eiwit in SH-SY5Y medium.
    1. Verdun het lentivirus zodanig dat deze op de standaardcurve (bijvoorbeeld 1: 20.000 en 1: 100.000) zal vallen. De verdunningsfactor vereiste zal variëren op basis van de lentivirale voorbereiding parameters en moet empirisch worden bepaald. De instructies van de fabrikant voor alle daaropvolgende stappen.
  3. Plate cellen 96 putjesplaten. Voor de SH-SY5Y cellen, kan plating procedures beschreven in hoofdstuk 1 te worden gevolgd. Voor de rat primaire corticale neuronen, moeten de cellen worden geïsoleerd en gezaaid op de juiste wijze beklede platen eens eerder beschreven 16. Onderhouden rat primaire corticale neuronen in Neurobasal medium aangevuld met 1x B27 en 500 uM L-glutamine. Presteren half medium uitwisselingen om de andere dag.
  4. Transduceren de cellen met virus. Het doel van virale transductie is te laag niveau van expressie te bereiken, zoals Gaussia luciferase biedt krachtige signaal.
    1. AAV transductie SH-SY5Y cellen: transduceren de dag na plating. Verdun AAV tot 6,0 x 10 7 vg / ul in AAV verdunningsbuffer (PBS + 0,5 mM MgCl2). Voeg 5 ul van de verwaterde AAV (3,0 x 10 8 vg; MOI van ongeveer 6000) per putje van 96 well plaat (figuur 3A). Gebruik 10% bleekwater om virale vector afval inactiveren.
    2. AAV transductie van de rat primaire corticale neuronen: transduceren 6-8 dagen na plating. Verdun AAV tot 4,0 x 10 6 vg / ul in AAV verdunningsbuffer. Voeg 5 ul van de verwaterde AAV (2,0 x 10 7 vg; MOI van ongeveer 350) per well96 putjesplaat (Figuur 3B). De optimale MOI moet empirisch worden bepaald voor andere celtypen. Gebruik 10% bleekwater om virale vector afval inactiveren.
    3. Lentivirale transductie van SH-SY5Y cellen: transduceren de dag na plating. Verdun lentivirus tot 20 pg / pl p24 (concentratie bepaald met titering kit) in Hank's gebalanceerde zoutoplossing. Voeg 5 pl van de verdunde virus per putje (100 pg van p24, gelijk aan 1.250.000 lentivirale deeltjes, of ~ 1250 IFUs) van een 96 wells plaat met 100 ul volume. Bijgevolg Scale voor grotere formaten. Gebruik 10% bleekwater virale afval inactiveren.
  5. Verzamel een voorbehandeling steekproef van medium en beginnen experimentele behandelingen 48 uur (SH-SY5Y) of 5-7 dagen (rat primaire corticale neuronen) na transductie.

4. In vivo SERCaMP Assay

Opmerking: Voor het uitvoeren van elk dier procedures moet u de juiste goedkeuring te verkrijgen via uw instelling. Allesurvival ingrepen zijn onder steriele omstandigheden met geschikte anesthesie worden gedaan. Alle procedures hieronder beschreven zijn goedgekeurd en zijn in overeenstemming met NIH ACUC richtlijnen.

  1. Autoclaaf chirurgische instrumenten voorafgaand aan de start van de operatie (121 ° C, 30 min sterilisatie, 20 min droge tijd). Reinig alle instrumenten in een ultrasonicator direct na alle procedures en voorafgaand aan de autoclaaf. Onderhouden steriele omstandigheden tijdens de operatie te overleven. Voor operaties waarbij meerdere dieren, veeg chirurgische instrumenten met 70% alcohol, ultrasonicate en kralen steriliseren tussen ratten. Raadpleeg Materialen Lijst voor noodzakelijke instrumenten.
  2. Bereid rat voor een operatie. Hier gebruiken we mannelijke Sprague-Dawley (180-200 g).
    1. Verdoven ratten met gas isofluraan gedurende 3 min (4-5% isofluraan afgegeven met 1000 cc / min) gevolgd door intraperitoneale injectie van xylazine (8 mg / kg) en ketamine (80 mg / kg). Gelden oogzalf om hoornvliezen beschermen tegen uitdrogen. BEgin operatie zodra de rat is diep verdoofd zoals aangetoond door een gebrek aan terugtrekking reflex volgende staart of voet knijpen.
    2. Scheren de regio van de buik iets onder de ribben (lage thoracale regio) naar het midden van de buikstreek. Schrob de chirurgische gebied drie keer, afwisselend 70% alcohol en Betadine scrub. Plaats rat in rugligging op steriele chirurgische gebied met steriele chirurgische gordijnen.
  3. Verdunnen AAV-gluc-SERCaMP tot 7,6 x 10 9 VG / ml (uiteindelijke concentratie). Meng goed door omkeren van de buis.
    Opmerking: Bereik van virale concentratie (figuur 4) variëren.
    1. Pipet 105 ul verdund AAV in een steriele schaal. Gebruik een 30-gauge naald om het virus te verzamelen in een spuit.
  4. Voer operatie aan de lever AAV-Gluc-SERCaMP bloot te leggen en te injecteren.
    1. Voorafgaand aan het maken van een incisie in de buik, toepassing 0,25% bupivacaïne het incisiegebied. Met behulp van een scalpel, maken een horizontale snede onder ribbenkast (approximately 2-3 cm). Blunt ontleden om bindweefsel te scheiden van onderhuid.
    2. Snijd buikspier, waardoor de juiste mediale kwab van de lever.
      Let op: extra lobben kan geïnjecteerd worden op basis van het einde applicatie.
    3. Plaats dier onder chirurgische microscoop en aan te passen aan rechts mediale kwab van de lever te krijgen in het gezichtsveld. Injecteer virus in parenchym van de mediale kwab; 3 aparte sites, ongeveer 33 ul per site.
      Opmerking: Laat de naald in weefsel voor 5-10 seconden na de injectie om de levering van de gehele injectie volume zorgen.
    4. Hechten de buikspier en de huid los en voeg Neosporin met wattenstaafje. Plaats rat in een herstel kamer tot bewustzijn herwonnen en rat is in staat om rechtop te houden. Heeft rat (s) niet onbeheerd achter, totdat het voldoende bewustzijn heeft herwonnen om borstligging handhaven. Huis enkelvoudig totdat de incisie is genezen en hechtingen verwijderd (7-14 dagen).
      Opmerking: Vanaf NIH post-operatieve richtlijnen, behouden chirurgische record. Annoteren kooi kaart met de procedure, datum, experiment identifier, lichaamsgewicht, en de dag van de operatie. Pijn / distress, ontlasting productie, activiteit, en voedsel en waterverbruik worden gecontroleerd en geregistreerd 3 dagen na de operatie. Postoperatieve analgesie door toevoeging acetaminophen het drinkwater (450 mg / 100 cc), hoewel we niet typisch acht tekenen van pijn of ongemak na chirurgie.
  5. Begin staart bloedafname 4-7 dagen na de injectie. Bereid bloedafnamebuisjes etikettering en pre-wegen. Voeg 50 ul heparine (1000 U / ml) aan elke buis.
  6. Plaats rat in isofluraananesthesie kamer gedurende 3 min (4-5% isofluraan afgegeven met 1000 cc / min). Verwijder rat uit kamer en plaats in neuskegel (2-3% Isoflurane afgeleverd bij 500 cc / min). Bloedafname kan beginnen zodra de rat is diep verdoofd, zoals aangetoond door het ontbreken van de terugtrekking reflex volgende staart pinch.
    1. Met steriele schaar knippen staartpunt (1-2 mm) en druppelsgewijs verzamelen bloed in voorgevulde heparine buis. Bloed af tot volume van meer dan 2 bereikt: 1 bloed heparine verhouding (> 100 gl bloed / 50 ul heparine). Bloedafname volumes kunnen worden aangepast op basis van experimenteel ontwerp. Gebruik een natte katoenen applicator bloedstelpende poeder van toepassing op de staart om het bloeden te stoppen.
    2. WINKEL bloed buizen bij 4 ° C indien verzamelen daaropvolgende monsters. Veeg schaar met ethanol pad en kralen steriliseren tussen collecties.
    3. Weeg collectie buizen en aan te passen met heparine tot 2 te verkrijgen: 1 ratio (bloed: heparine). Deze stap zal de hoeveelheid heparine te normaliseren in elk monster (Tabel 1).
    4. Centrifugebuizen bij 2000 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Breng de bovenstaande (plasma) naar een nieuwe buis en bewaar bij -80 ° C op het moment van luciferasetest (hoofdstuk 5).
      Opmerking: Opslag van monsters bij 4 ° C tot 72 uur vóór enzymatische test heeft minimal effect op luminescentie (figuur 5A). Maximaal 3 vries-ontdooi cycli van plasmamonsters hebben geen effect op luminescentie (Figuur 5B).
  7. Thapsigargine administratie (positieve controle):
    1. Bereid thapsigargin door verdunning in ethanol tot een eindconcentratie van 2,5 mg / ml. Injecteren thapsigargine bij 1 mg / kg ip in de onderbuik.
      Opmerking: Thapsigargin verhoogt trombine-geïnduceerde bloedplaatjes stolling 17 en kan bloedafname te maken uit de staart moeilijker.
  8. Gaussia luciferasetest:
    1. Ontdooi de plasma monsters op het ijs.
      Opmerking: voor longitudinale studies, ontdooien en uitvoeren luminescentie assay voor tijdpunt monsters worden op dezelfde dag (met enkel preparaat substraat).
    2. Overdracht 10 ul van plasma om een ​​ondoorzichtige ommuurde plaat en meet enzymatische activiteit, zoals beschreven in hoofdstuk 5. Run 3-4 technische replica van elk plasmamonster.
  9. Euthanasieen
    Opmerking: Het voordeel van SERCaMP technologie is de mogelijkheid beeldscherm ER calcium langsrichting. Afhankelijk van de experimentele parameters en eindpunt analyseert, dieren moeten worden gedood door de maatregelen die geschikt zijn voor endpoint analyses en in overeenstemming met de institutionele richtlijnen ACUC.

5. Luminescentie Assay

  1. Bereid coelenterazine (CTZ) voorraadoplossingen door verdunning van de verbinding in aangezuurde methanol (30 pi 10 N HCl tot 3 ml methanol) tot 20 mM. Bereid eenmalig gebruik aliquots en bewaar bij -80 ° C.
  2. De werkoplossing substraat op de dag van de assay.
    1. Voor in vitro assays verdund coelenterazine tot 8 uM in PBS, bijv voeg 10 ul van 20 mM CTZ bouillon aan 25 ml PBS (Figuur 6A, B).
    2. Voor in vivo testen, verdund coelenterazine tot 100 uM in PBS, 500 mM ascorbinezuur, 5 mM NaCl.
  3. Incubeer bereid CTZ minstens 30 minbij kamertemperatuur voor aanvang van de test.
    Opmerking: Deze stap is vaak opgenomen in Gaussia luciferasetests want er zijn meldingen van een snelle ondergrond verval tijdens de eerste 30 minuten na de voorbereiding. We hebben dit effect niet in ons systeem (figuur 6C) waargenomen; Maar we vaak bevatten de incubatiestap aangezien we geen negatieve gevolgen voor de test gevonden.
  4. Gebruik een plaatlezer die in staat is toezicht bioluminescentie en voorzien van een substraat injector. Prime de lijnen met substraat.
    Opmerking: De eerste substraat door de leidingen kunnen gevoelig zijn voor degradatie. Kunstmatig lage waarden voor de vroege monsters te voorkomen, injecteren 20-30 lege putten (het laden van een lege plaat op de lezer) voor het meten van de experimentele monsters.
  5. Injecteer 100 ul substraat in goed, schudden gemiddelde snelheid voor 5 seconden, en meet lichtemissie. Voor de Biotek Synergy II plaatlezer, integreren lichtemissie meer dan 0,5 sec (in vitro monsters) en 5 sec (invivo monsters) voor de lees stap. Optimaliseren plaataflezer parameters voor de ideale test prestaties.
    Opmerking: Gaussia luciferase tentoonstellingen flash kinetiek met snelle signaal verval (in vergelijking met kinetiek waargenomen met andere luciferasen gloed). De flitser kinetiek van gluc wordt beïnvloed door serum in celkweek medium (Figuur 7A), met de nadruk op het belang van controle voor middelgrote samenstelling over monsters. Door het snelle verval van luminescentie na toevoeging van substraat (flash kinetiek), de tijd tussen injecteren en lees stappen moeten uniform voor alle monsters. De plaat lezer moet worden ingesteld op substraat injecteren om een goed, wacht een vaste tijd (bijvoorbeeld gebruiken we een 5 sec schudden stap), en lees dat ook. Het toevoegen van substraat om een ​​hele plaat vóór de lezing moeilijk na tenzij substraat aan alle putjes gelijktijdig kunnen worden toegevoegd. Als een injector niet beschikbaar is, kan het probleem gedeeltelijk worden omzeild door incubatie van de plaat gedurende 10 minuten tussen substraat additie en meting (Figuur 7B) (dus de steile deel van het verval curve vermijden).
  6. Herhaal de injectie, wachttijd, en lees stappen voor elke put op de plaat.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

De gluc-SERCaMP methode maakt het mogelijk voor de beoordeling van de ER calciumhomeostase door bemonstering extracellulaire vloeistoffen. Verschillende controles kunnen in proefopzet interpretatie van de resultaten te verbeteren. Ten eerste kan het gebruik van een constitutief uitgescheiden reporter (bijvoorbeeld gluc zonder het C-eindstandige ASARTDL of "Gluc-No tag") worden toegepast om het effect van experimentele behandelingen op de secretieroute (globale cellulaire secretie) en transgenexpressie...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Dit protocol wijst op de in vitro en in vivo bruikbaarheid van gluc-SERCaMP uitputting van ER calcium te controleren. Hoewel het eiwit wijziging SERCaMP genereren lijkt te generaliseren naar andere reporter eiwitten 12, kozen we Gaussia luciferase voor zijn robuuste (200-1000 keer groter) bioluminescentie in vergelijking met andere luciferasen 18. We tonen detecteerbare thapsigargin geïnduceerde Gluc-SERCaMP afgifte over een 100-voudige dosisbereik van gluc-virus SERCaMP ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door het Intramurale Onderzoeksprogramma van het National Institute on Drug Abuse. We danken Doug Howard, Chris Richie, Lowella Fortuno en Josh Hinkle voor hun bijdragen aan het ontwikkelen van deze methode.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1.5 ml tubesFisher 02-682-550
10% NP-40 solution Pierce28324voor intracellulaire GLuc-assays
1 ml luer-lok syringesFisher14-823-30
200 microliter filter tipsRaininRT-L200F
3-0 chirurgische hechtdradenFisherNC9598192
30 G naaldenFisher Scientific14-821-13A 
Zelfklevende microplate verzegelingsvellenThermoAB-0558
Alcohol prep padsFisher22-246-073
Anesthesie Auto Flow SystemE-Z AnesthesiaEZ-AF9000
Dier herstelkamerLyon VetICU-912-004
B27 supplementLife Technologies17504-044
Betadine oplossingFisherNC9386574
BleekmiddelCloroxn/a
Rund groeiserumThermoSH30541.03
Coelenterazine, NativeRegis Technologies1-361204-200
Wattenstaafjes met katoenPuritan806-WC
Snijnaalden 3/8 cirkel hechtdradenWPI501803
Digitale ultrasonische reinigerFisher ScientificFS60D
DMEM hoge glucose, GlutaMAX, pyruvateLife Technologies10569-010
DNA massaladderLife Technologies10496-016
Gaussia luciferase (recombinant eiwit)Nanolight321-100
Gaussia luciferase antilichaam (voor WB, ICC of IHC)New England BiolabsE8023S1:2.000 (WB)
Germinator 500CellPoint ScientificDS-401
Gluc assay platen (96 wel, ondoorzichtig)Fisher07-200-589
Hank's balanced salt solutionLife Technologies14175-095
HeparineAllmedtech63323-276-02
IsofluraneButler Schein29404
KetamineHenry Schein995-2949
Kwik Stop Styptic poederButler Schein5867
L-glutamineSigmaG8540
MethanolFishera452-4
Microfuge 22R CentrifugeBekman Colter368831
NeosporinFisher19-898-143
Neurobasal mediumLife Technologies21103049
Nikon StereoscoopNikonSMZ745T
Nucleospin Gel and PCR CleanupMachery-Nagel740609
P200 pipetRaininL-200XLS+
p24 Lenti-X rapid titer kitClontech632200
PCR film verzegelingFisherAB0558
Penicilline/streptomycineLife Technologies15140-122
Protease inhibitor cocktailSigmaP8340
ReFresh Koolstof Filter kanisterE-Z AnesthesiaEZ-258
Schelpjes, #10Fine Science tools Inc10010-00
SD ratten 150-200 gCharles RiverRattenratten besteld bij 150-200 g.  Operatie 5 dagen na aankomst
Kleine dieren oormerkenNational Band and Tag co1005-1
Steriele chirurgische schermenBraintree ScientificSP-MPS
Synergy 2 plate readerBioTekn/a
TaqMan Universal PCR Master MixApplied Biosystems4304437
ThapsigarginSigmaT9033schadelijk voor de gezondheid van de mens
Virapower lentivirale verpakkingsmixLife TechnologiesK4975-00
Xfect Transfectie reagensClontech631318
XylazineValley Vet468RX

Referenties

  1. Sitia, R., Braakman, I. Quality control in the endoplasmic reticulum protein factory. Nature. 426 (6968), 891-894 (2003).
  2. Burdakov, D., Petersen, O. H., Verkhratsky, A. Intraluminal calcium as a primary regulator of endoplasmic reticulum function. Cell Calcium. 38 (3-4), 303-310 (2005).
  3. Fu, S., et al. Aberrant lipid metabolism disrupts calcium homeostasis causing liver endoplasmic reticulum stress in obesity. Nature. 473 (7348), 528-531 (2011).
  4. Micaroni, M. The role of calcium in intracellular trafficking. Curr Mol Med. 10 (8), 763-773 (2010).
  5. Mekahli, D., Bultynck, G., Parys, J. B., De Smedt, H., Missiaen, L. Endoplasmic-reticulum calcium depletion and disease. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (6), (2011).
  6. Paredes, R. M., Etzler, J. C., Watts, L. T., Zheng, W., Lechleiter, J. D. Chemical calcium indicators. Methods. 46 (3), 143-151 (2008).
  7. Whitaker, M. Genetically encoded probes for measurement of intracellular calcium. Methods Cell Biol. 99, 153-182 (2010).
  8. Tang, S., et al. Design and application of a class of sensors to monitor Ca2+ dynamics in high Ca2+ concentration cellular compartments. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (39), 16265-16270 (2011).
  9. Palmer, A. E., Jin, C., Reed, J. C., Tsien, R. Y. Bcl-2-mediated alterations in endoplasmic reticulum Ca2+ analyzed with an improved genetically encoded fluorescent sensor. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (50), 17404-17409 (2004).
  10. Suzuki, J., et al. Imaging intraorganellar Ca2+ at subcellular resolution using CEPIA. Nat Commun. 5, 4153(2014).
  11. Rehberg, M., Lepier, A., Solchenberger, B., Osten, P., Blum, R. A new non-disruptive strategy to target calcium indicator dyes to the endoplasmic reticulum. Cell Calcium. 44 (4), 386-399 (2008).
  12. Henderson, M. J., Wires, E. S., Trychta, K. A., Richie, C. T., Harvey, B. K. SERCaMP: a carboxy-terminal protein modification that enables monitoring of ER calcium homeostasis. Mol Biol Cell. 25 (18), 2828-2839 (2014).
  13. Henderson, M. J., Richie, C. T., Airavaara, M., Wang, Y., Harvey, B. K. Mesencephalic astrocyte-derived neurotrophic factor (MANF) secretion and cell surface binding are modulated by KDEL receptors. J Biol Chem. 288 (6), 4209-4225 (2013).
  14. Shipman, C. Evaluation of 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineëthanesulfonic acid (HEPES) as a tissue culture buffer. Proc Soc Exp Biol Med. 130 (1), 305-310 (1969).
  15. Zigler, J. S., Lepe-Zuniga, J. L., Vistica, B., Gery, I. Analysis of the cytotoxic effects of light-exposed HEPES-containing culture medium. In Vitro Cell Dev Biol. 21 (5), 282-287 (1985).
  16. Howard, D. B., Powers, K., Wang, Y., Harvey, B. K. Tropism and toxicity of adeno-associated viral vector serotypes 1, 2, 5, 6, 7, 8, and 9 in rat neurons and glia in vitro. Virology. 372 (1), 24-34 (2008).
  17. Smeets, E. F., Heemskerk, J. W., Comfurius, P., Bevers, E. M., Zwaal, R. F. Thapsigargin amplifies the platelet procoagulant response caused by thrombin. Thromb Haemost. 70 (6), 1024-1029 (1993).
  18. Tannous, B. A. Gaussia luciferase reporter assay for monitoring biological processes in culture and in vivo. Nat Protoc. 4 (4), 582-591 (2009).
  19. Sobrevals, L., et al. AAV vectors transduce hepatocytes in vivo as efficiently in cirrhotic as in healthy rat livers. Gene Ther. 19 (4), 411-417 (2012).
  20. Wang, Z., et al. Rapid and highly efficient transduction by double-stranded adeno-associated virus vectors in vitro and in vivo. Gene Ther. 10 (26), 2105-2111 (2003).
  21. Seppen, J., et al. Adeno-associated virus vector serotypes mediate sustained correction of bilirubin UDP glucuronosyltransferase deficiency in rats. Mol Ther. 13 (6), 1085-1092 (2006).
  22. Hareendran, S., et al. Adeno-associated virus (AAV) vectors in gene therapy: immune challenges and strategies to circumvent them. Rev Med Virol. 23 (6), 399-413 (2013).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

SERCaMP reportervirale vector transgenesebioluminescentie assayhepatische injectiebloedafnamefarmacologische manipulatiecalciumhomeostase van het ERin vivo monitoring

Gerelateerde artikelen