Dit protocol biedt een eenvoudige en efficiënte manier om humane pluripotente stamcellen (hPSC's) te propageren met behulp van alleen geconditioneerd medium afgeleid van de menselijke placenta in een met gelatine beklede schaal zonder aanvullende exogene suppletie of hPSC-specifieke synthetische substraten.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
A Novel Cultuur Model for Human Pluripotent Stem Cell Voortplanting op gelatine in Placenta-geconditioneerde Media
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
De propagatie van humane pluripotente stamcellen (hPSC's) in geconditioneerd medium afgeleid van menselijke cellen in feeder-vrije kweekomstandigheden is interessant geweest. Niettemin is er geen ideale gehumaniseerde ex vivo feeder-vrije propagatiemethode voor hPSC's ontwikkeld; momenteel wordt aan alle kweekmedia extra exogeen substraat, waaronder basische fibroblastgroeifactor (bFGF), een master hPSC-ondersteunende factor, toegevoegd en worden synthetische substraten zoals Matrigel of laminine gebruikt in alle feeder-vrije culturen. Onlangs ontwikkelde onze groep een eenvoudig en efficiënt protocol voor de propagatie van hPSC's door alleen gebruik te maken van geconditioneerd medium afgeleid van de menselijke placenta op een gelatine-gecoate schaal zonder aanvullende exogene suppletie of synthetische substraten specifiek voor hPSC's. Dit protocol is eerder niet gerapporteerd en zou onderzoekers in staat kunnen stellen om hPSC's efficiënt te propageren in gehumaniseerde kweekomstandigheden. Bovendien elimineert dit model risico's van hPSC-besmetting door dierlijke producten zoals virussen of onbekende eiwitten. Verder vergemakkelijkt dit systeem eenvoudige massaproductie van hPSC's door gebruik van de gelatinecoating, wat eenvoudig te hanteren is, en verlaagt drastisch de totale kosten van ex vivo hPSC-onderhoud.
Inleiding
Het doel van dit protocol is de propagatie van menselijke pluripotente stamcellen (hPSCs), inclusief menselijke embryonale stamcellen (hESCs) en menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) in volledig gehumaniseerde ex vivo feeder-vrije omstandigheden zonder dat aanvullende exogene suppletie en synthetische substraten vereist zijn. Tot op heden is de ontwikkeling van ex vivo hPSC-kweekmodellen, die de introductie van kweekproducten naar de kliniek mogelijk maken, een belangrijke zorg geweest in stamcelonderzoek. Specifiek, moeten twee cruciale problemen worden aangepakt. Ten eerste is er behoefte aan een gehumaniseerd ex vivo kweeksysteem voor de propagatie van hPSCs dat het risico van besmetting door producten van dierlijke cellen voorkomt. Ten tweede is er behoefte aan een feeder-vrij kweekmodel om gemakkelijke en economische massaproductie van hPSCs te faciliteren. Voor therapeutische toepassingen van hPSCs is het noodzakelijk om de factoren die hun zelfvernieuwing en differentiatie reguleren te identificeren.
Sinds Xu et al. aanvankelijk de haalbaarheid rapporteerden van het gebruik van geconditioneerd medium (CM) afgeleid van muis embryonale fibroblasten (MEF) om hESCs te kweken op Matrigel1, hebben veel studies optimale ex vivo propagatiemethoden voor hPSCs onderzocht2-4. Echter, is er geen ideaal gehumaniseerd ex vivo feeder-vrij hPSC-propagatiesysteem ontwikkeld omdat huidige methoden aanvullende exogene substraten vereisen, inclusief bFGF en insuline, bekende hPSC-onderhoudende factoren, in kweekmedia5-7. Bovendien worden synthetische substraten zoals Matrigel of laminine gebruikt in alle feeder-vrije culturen.
De redenering achter de ontwikkeling en het gebruik van dit protocol is gebaseerd op onze eerdere studies die aantonen dat humane placenta chorion cellen uitstekend ondersteuning bieden voor de propagatie van hPSCs zonder bFGF-suppletie8-11. Dit protocol heeft een aantal voordelen, waaronder de eenvoud in omgang en de kosteneffectiviteit, en het is een bijna perfect gehumaniseerd kweekmedium dat hPSC-propagatie mogelijk maakt zonder exogene synthetische substraten. De toepassing van humaan placenta-afgeleid CM (hPCCM) voor hPSCs omvat 3 stappen. Ten eerste worden chorion cellen geïsoleerd uit de menselijke placenta en gekweekt. Ten tweede wordt hPCCM geproduceerd uit gekweekte cellen. Ten derde worden hPSCs gekweekt met behulp van hPCCM en worden hun kenmerken bevestigd.
Dit protocol zal klinische toepassingen van hPSCs en studies naar de mechanismen van hPSC-proliferatie en -aanhechting vergemakkelijken. In dit artikel wordt het protocol voor de succesvolle propagatie van hPSCs in hPCCM op een gelatine-gecoate schotel gepresenteerd.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Ethiek verklaring: De menselijke placenta studie werd prospectief uitgevoerd, met goedkeuring van de Institutional Review Board voor menselijke onderzoek van de Korea University (AN09085-001). Alle experimenten werden uitgevoerd in een Clean Germ-allergene kamers faciliteit in de Korea University Medical Center. De experimenteel ontwerp en procedures met behulp hPSCs werden goedgekeurd door de Institutional Review Board van de Korea University Medical Center (AN12277-003).
1. Voorbereiding van de instrumenten, Cultuur Media en gerechten
- Smeer alle cultuur gerechten met 0,1% gelatine het. Autoclaaf met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) en forceps. Steriliseer chirurgische schaar, microcentrifuge buizen en gaas bij 121 ° C onder £ 15 psi gedurende meer dan 15 minuten.
- Bereide voorverwarmde 0,25% trypsine-ethyleen tetra-amine azijnzuur (trypsine-EDTA) en voorverwarmde gefiltreerd kweekmedia (DMEM) dat 20% foetaal runderserum (FBS), 100 U / ml penicilline en 100 g / ml streptomycin voordat u begint met de procedures.
2. Cell Isolatie van menselijke placenta
- Verkrijgen placentaweefsel, na keizersnede levering, van gezonde zwangere vrouwen die een normale of therapeutische abortus bij 7-32 weken van de zwangerschap na verkregen schriftelijke toestemming.
- Hebben de verloskundige specialist operatief aparte menselijke placenta chorionic platen (HPC) van de placenta; incubeer deze in 0,25% trypsine-EDTA bij 37 ° C gedurende 20 min, en daarna wassen met 5 ml PBS.
- Isoleer chorionvlokken van HPC met een schaar; gehakt de villi en was ze drie keer met 1 ml PBS. Na hakken, plaats de vlokken in een microfugebuis met een pipet tip; Was de monsters met 500 pi PBS en neer te pipetteren, en centrifugeer de buizen van 120 g gedurende 3 min. Wassen weefsel tweemaal met 500 ul voorverwarmde kweekmedium.
- Kweekcellen in medium op met gelatine beklede platen bij 37 ° C in 5% CO 2 en onder 95% vocht. Pre-coat alle platen met 0,1% gelatine gedurende 1 uur bij 37 ° C. Koloniën van fibroblast-achtige cellen zullen vormen en hechtende groei ongeveer 5-7 dagen na het begin van de cultuur in hetzelfde medium.
- Uitwisselen van het medium om de 2-3 dagen tot de derde passage. Tijdens kweek verwijderen celresten drijvend in het kweekmedium; fibroblasten groeiende placenta zal hechten aan de plaat. Culture de fibroblast-achtige cellen afkomstig van de HPC tot de 10 ste passage en oogsten hen hESC kweken na behandeling met trypsine en mitomycine C (10 ug / ml) behandeld.
- Voor het invriezen HPC als voorraadmonsters Gebruik reverse transcriptie-polymerase ketenreactie (RT-PCR) om te bevestigen dat HPC niet besmet met pathogenen die gewoonlijk infecteren de placenta, zoals mycoplasma (M. fermentans, M. hyorhinis, M. Arginine, M . orale, M. salivarium, M. hominis, M. pulmonis, M. arthritidis, M. neurolyticum, M. hyopneumoniae,en M. capricolum) en de bacteriële soorten, Ureaplasma urealyticum, door een mycoplasma detectie kit.
- De instructies van de fabrikant om RT-PCR uit te voeren, van alle primers en mengsels in de kit. Gebruik de supernatanten van cellen die zijn gekweekt 36 dagen mycoplasma detectie. Voeg 3 ul van deze monsters aan het PCR mengsel en voer de 1 ste PCR procedure gedurende 35 cycli, elk bestaande uit 94 ° C gedurende 30 sec, 55 ° C gedurende 2 min en 72 ° C gedurende 1 min.
- Voeg voorzichtig 0,5 ul van de 1 ste PCR product aan het PCR mengsel en uitvoeren van de 2 e PCR procedure gedurende 30 cycli onder dezelfde omstandigheden als hiervoor. Analyseer de geamplificeerde producten van 1% agarosegelelektroforese; 10 pi van elk van de 1 ste en 2de PCR-producten van toepassing op de gels.
- Als HPC's blijken te zijn besmet met ziekteverwekkers, te elimineren dezeeen combinatie van antibiotica (BM-cycline), volgens de instructies van de fabrikant. Toevoegen medium dat 10 ug / ml BM-cycline 1 gedurende 3 dagen, en vervolgens behandelen van de cellen met 5 ug / ml BM-cycline 2 nog eens 4 dagen. Herhaal deze cyclus twee keer en controleer dan opnieuw voor mycoplasma besmetting.
3. Oogst menselijke placenta-afgeleide cellen geconditioneerd medium (hPCCM)
- Na uitsluiting verontreiniging behandelen gehechte cellen (85-90% confluentie, (1,5 x 10 7 cellen / fles) met mitomycine C (10 ug / ml) gedurende 2 uur en 30 minuten en waste de cellen driemaal met 10 ml PBS. Incubeer de cellen met voorverwarmd medium zonder mitomycine-C gedurende 24 uur.
- Één dag na behandeling Incubeer cellen in 10 ml medium (DMEM-F12 gesupplementeerd met 20% Knock-Out Serum Vervangende [KOSR], 0,1 mM β-mercaptoethanol, 1% NEAA, en 1% penicilline-streptomycine). Na 24 uur incubatie, oogst CM in een 15 ml conische buis enfilter het GH met een 0,22 urn spuitfilter.
- Voeg nog 10 ml nieuw medium en incubatie. Verzamel supernatanten van de kweken elke dag gedurende 1 week en vries geoogste medium bij -80 ° C. Vermijd herhaalde vries-dooi cycli.
4. Cultuur van menselijke embryonale stamcellen (hESC 's) en de inductie van pluripotente stamcellen (iPSCs)
- Verkrijgen Menselijke embryonale stamcellijnen, H1 en H9 cellen (respectievelijk in de NIH hESC-register onder de naam WA01 en WA09 vermeld,) en geïnduceerde pluripotente stamcellen-iPSC-1: iPS (voorhuid) -1 en iPSC-2 (IISH1i- BM) vanaf het WiCell Research Institute (Madison, WI, USA). De cellen worden ontdooid en gekweekt volgens de instructies van de fabrikant.
- Voor de controlegroep, kweekcellen op Basement Membrane Matrix-beklede schalen in gebruikte voedingsvrije en serum-vrij gedefinieerde cultuurmedium bij 37 ° C en 5% CO 2. Aanvankelijk zaad 80-100 bosjes van hPSCs in 35-mm gerechten. Groeien cellen in deze gerechten tot 70-80% samenvloeiing en routinematig passage cellen voor sub-kweken eens 5-6 dagen, met behulp van mechanische of enzymatische methoden (Dispase). Was de cellen tweemaal met medium en plaat ze in een verhouding van 1: 4. Vervang het medium door vers medium elke dag.
- Voor de experimentele groepen kweekcellen in hPCCM op de vaat vooraf bekleed met 0,1% gelatine en routinematige passage eens 5 dagen, mechanisch of enzymatisch. Plate cellen bij verhoudingen in het traject van 1: 6-1: 10. hPSCs hechten aan de gelatine binnen 2 dagen na de overdracht. Vervang het medium door vers medium per dag.
5. karakterisering van menselijke pluripotente stamcellen
OPMERKING: Karakteriseren hPSCs behulp van verschillende werkwijzen, zoals alkalische fosfatase kleuring, immunocytochemie, kwantitatieve real-time PCR (qRT-PCR), en western blotting.
- Immunofluorescentiekleuring
- Voor immunofluorescence kleuring cultuur hPSCs en vast de cellen in 8-well slide kamers met 4% (w / v) paraformaldehyde gedurende 10 min; Vervolgens, de cellen permeabel gemaakt met 0,1% (v / v) Triton-X100 gedurende 15 min, en blokkeren de cellen gedurende 1 uur met 3% (v / v) normaal paardenserum in PBS met 0,1% (v / v) Tween- 20. Was PBS twee keer gedurende 5 minuten tussen elke stap.
- Incubeer de cellen met het primaire antilichaam (oktober-4, SSEA4, TRA-1-81, TRA-1-60, verdunning 1: 1000) O / N bij 4 ° C en met het secundaire antilichaam.
- Vóór het opzetten incubeer cellen met 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) gedurende 5 min in het donker. Was cellen stringent driemaal gedurende 5 minuten elk droge cellen volledig in het donker. Behoud cellen in fluorescentie montage medium en observeren ze onder een fluorescentiemicroscoop.
- qRT-PCR
- Isoleer totaal RNA uit cellen met behulp van een RNeasy mini kit volgens specificaties van de fabrikant en kwantificeren van het geëxtraheerde RNA met een Nano Drop spectrofotometer.
- CDNA synthetiseren door toevoeging 2 ug van het totale RNA een 20-ul reactiemengsel dat oligo (dT) primers en Superscript II reverse transcriptase; volg de instructies van de fabrikant in deze procedure.
- Amplify het gesynthetiseerde cDNA met een Bio-Rad iCycler iQ-systeem, met behulp van iQ SYBR Green qPCR Master Mix en de primer sequenties in Aanvullende tabel S1 beschreven. Normaliseren van de cyclus drempelwaarden van de genen van belang die van glyceraldehyde-3-fosfaat dehydrogenase (GAPDH).
- Alkalische fosfatase (AP) vlekken
- Detecteren AP activiteit met de ES Cell Karakterisering Kit, volgens het protocol van de fabrikant.
- Op dag 5, zuigen de media en bevestig de hPSCs met 4% paraformaldehyde in PBS gedurende 12 min. Niet overfix; vaststelling cellen langer dan 2 minuten resulteert in de inactivering van alkalische fosfatase. Zuig het fixatief en spoel met 1x Rinse Buffer. Niet doenlaten putten drogen tussen de stappen.
- Voeg genoeg kleurstofoplossing aan elk putje (1 ml per putje van een 35 mm schaal) omvatten. Incubeer de platen in het donker bij kamertemperatuur gedurende 15 min.
- Na incubatie, wassen gerechten met 1x Rinse Buffer. Cover cellen met 1x PBS om uitdroging te voorkomen en te onderzoeken en het beeld van de gekleurde cellen met behulp van een Olympus microscoop.
- Western Blot
- Voer western blot analyse zoals eerder beschreven in 9. In het kort bepalen eiwitconcentraties in cellysaten. Los gelijke hoeveelheden eiwit op een natriumdodecylsulfaat-polyacrylamide gelelektroforese (SDS-PAGE) gel en breng de eiwitten op een polyvinylideenfluoride (PVDF) membraan.
- Blokkeer de blot en probe is O / N met verschillende primaire antilichamen bij 4 ° C; vervolgens de blot geïncubeerd met HRP-geconjugeerde secundaire antilichamen gedurende 1 uur. Was het membraan drie maal gedurende 10 min elke keer tussen incubaties. Detecteren signalen met behulp van een ECL-reagens.
- Short tandem repeat (STR) analyse
- hPSCs werden geoogst van de controle- en experimentele groepen hetzelfde punt. Genomisch DNA werd geëxtraheerd onder toepassing van een DNA Micro kit, volgens de instructies van de fabrikant.
- Amplify het genomische DNA van 16 verschillende genetische loci met de AmpF / STR PCR Amplification Kit, volgens de specificaties van de fabrikant en capillaire elektroforese werd uitgevoerd met een Genetic Analyzer.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Een voordeel van deze HPSC vermeerderingsmethode is dat daarbij bestanddelen uitgescheiden door humane cellen. Een zeer ciritical stap in het protocol is de isolatie en de cultuur van de menselijke placenta-afgeleide cellen. Dit vereist nauwkeurige en dissectie van een precieze gedeelte van HPC plaat villi. Figuur 1 toont de procedure voor placenta afgeleide celisolatie mens. Deze werkwijze is eenvoudig en geschikt voor de isolatie van cellen, en kan gemakkelijk op 1 uur worden uitgevoerd. Zoals beschre...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Dit model werd ontwikkeld om succesvol propageren hPSCs, met behoud van hun kenmerken, gehumaniseerde voedingsvrije kweekomstandigheden zonder de toevoeging van exogene recombinante groeifactoren zoals bFGF of insuline, waardoor het manipuleren van hPSCs in een gehumaniseerd micromilieu. Exogene bFGF suppletie is gebruikelijk en de toepassing van onderlagen zoals Matrigel of laminine essentieel voor voedingsvrije kweken van hPSCs 14.
Dit protocol is eenvoudig en gemakkelijk te imp...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs geven geen belangenconflicten.
Dankbetuigingen
De auteurs willen graag Soon-Cheol Hong (MD, Ph.D., Associate Professor, Afdeling Obstetrie en Gynaecologie, Medical College Korea University) bedanken voor het verstrekken van placenta weefsel. Dit werk werd mede ondersteund door subsidies (R1211902) van de National Research Foundation Korea (NRF), de Republiek Korea.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Mitomycin-C | Sigma-Aldrich Corporation | M4287 | 10 μg/ml |
| Mycoplasma detection kit | TaKaRa Bio Inc. | #6601 | |
| Matrigel | BD Biosciences | #354277 | |
| mTeSR1 | STEMCELL Technologies Inc. | #05850 | |
| Dispase | Worthington Biochemical Corporation | LS02100 | 1 mg/ml |
| Gelatin | Sigma-Aldrich Corporation | G2500 | 0.10% |
| BM-Cyclin | Roche | 799 050 | 10 μg/ml |
| RNeasy mini kit | Qiagen | 74104 | |
| Nano Drop Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific Inc | ||
| iQ SYBR Green qPCR Master Mix | Bio-Rad Laboratories | #170-8882AP | |
| ES Cell Characterization kit | Chemicon International, Inc., | SCR001 | |
| Power cDNA Synthesis Kit | iNtRON Biotechnology | 25011 | |
| QIAamp® DNA Micro kit | Qiagen | 56304 | |
| AmpF/STR® Identifiler® PCR Amplification kit | Applied Biosystems Inc. | 4322288 | |
| Applied Biosystems® 3130xl Genetic Analyzer | Applied Biosystems Inc. |
Referenties
- Xu, C., et al. Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 19 (10), 971-974 (2001).
- Amit, M. C., Shakiri, V., Margulets, J. Itskovitz-Eldor Feeder layer and serum-free culture of human embryonic stem cells. Biol Reprod. 70 (3), 837-845 (2004).
- Nagaoka, M., Si-Tayeb, K., Akaike, T., Duncan, S. A. Culture of human pluripotent stem cells using completely defined conditions on a recombinant E-cadherin substratum. BMC Dev Biol. 10, 60(2010).
- Jin, S., Yao, H., Weber, J. L., Melkoumian, Z. K., Ye, K. A synthetic, xeno-free peptide surface for expansion and directed differentiation of human induced pluripotent stem cells. PLoS One. 7 (11), e50880(2012).
- Xu, R. H., et al. Basic FGF and suppression of BMP signaling sustain undifferentiated proliferation of human ES cells. Nat Methods. 2 (3), 185-190 (2005).
- Xu, C., et al. Basic fibroblast growth factor supports undifferentiated human embryonic stem cell growth without conditioned medium. Stem Cells. 23 (3), 315-323 (2005).
- Levenstein, M. E., et al. Basic fibroblast growth factor support of human embryonic stem cell self-renewal. Stem Cells. 24 (3), 568-574 (2006).
- Park, Y., et al. Human feeder cells can support the undifferentiated growth of human and mouse embryonic stem cells using their own basic fibroblast growth factors. Stem Cells Dev. 20 (11), 1901-1910 (2011).
- Park, Y., et al. The efficacy of human placenta as a source of the universal feeder in human and mouse pluripotent stem cell culture. Cell Reprogram. 12 (3), 315-328 (2010).
- Park, Y., et al. Undifferentiated propagation of the human embryonic stem cell lines, H1 and HSF6, on human placenta-derived feeder cells without basic fibroblast growth factor supplementation. Stem Cells Dev. 19 (11), 1713-1722 (2010).
- Seok, K., et al. Human placenta-derived feeders support prolonged undifferentiated propagation of a human embryonic stem cell line, SNUhES3: comparison with human bone marrow-derived feeders. Stem Cells Dev. 16 (3), 421-428 (2007).
- Levenstein, M. E., et al. Basic fibroblast growth factor support of human embryonic stem cell self-renewal. Stem Cells. 24 (3), 568-574 (2006).
- Xu, R. H., Peck, R. M., Li, D. S., Feng, X., Ludwig, T., Thomson, J. A., et al. Basic FGF and suppression of BMP signaling sustain undifferentiated proliferation of human ES cells. Nat Methods. 2 (3), 185-190 (2005).
- Mahmood, A., Harkness, L., Schrøder, H. D., Abdallah, B. M., Kassem, M. Enhanced differentiation of stem cells mesenchymal progenitors by inhibition of TGF-beta/activin/nodal using SB-431542. J Bone Miner Res. 25 (6), 1216-1233 (2010).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
