Dit protocol biedt een eenvoudige en efficiënte manier om humane pluripotente stamcellen (hPSC's) te propageren met behulp van alleen geconditioneerd medium afgeleid van de menselijke placenta in een met gelatine beklede schaal zonder aanvullende exogene suppletie of hPSC-specifieke synthetische substraten.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
A Novel Cultuur Model for Human Pluripotent Stem Cell Voortplanting op gelatine in Placenta-geconditioneerde Media
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
De propagatie van humane pluripotente stamcellen (hPSC's) in geconditioneerd medium afgeleid van menselijke cellen in feeder-vrije kweekomstandigheden is interessant geweest. Niettemin is er geen ideale gehumaniseerde ex vivo feeder-vrije propagatiemethode voor hPSC's ontwikkeld; momenteel wordt aan alle kweekmedia extra exogeen substraat, waaronder basische fibroblastgroeifactor (bFGF), een master hPSC-ondersteunende factor, toegevoegd en worden synthetische substraten zoals Matrigel of laminine gebruikt in alle feeder-vrije culturen. Onlangs ontwikkelde onze groep een eenvoudig en efficiënt protocol voor de propagatie van hPSC's door alleen gebruik te maken van geconditioneerd medium afgeleid van de menselijke placenta op een gelatine-gecoate schaal zonder aanvullende exogene suppletie of synthetische substraten specifiek voor hPSC's. Dit protocol is eerder niet gerapporteerd en zou onderzoekers in staat kunnen stellen om hPSC's efficiënt te propageren in gehumaniseerde kweekomstandigheden. Bovendien elimineert dit model risico's van hPSC-besmetting door dierlijke producten zoals virussen of onbekende eiwitten. Verder vergemakkelijkt dit systeem eenvoudige massaproductie van hPSC's door gebruik van de gelatinecoating, wat eenvoudig te hanteren is, en verlaagt drastisch de totale kosten van ex vivo hPSC-onderhoud.
Inleiding
Het doel van dit protocol is de propagatie van menselijke pluripotente stamcellen (hPSCs), inclusief menselijke embryonale stamcellen (hESCs) en menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) in volledig gehumaniseerde ex vivo feeder-vrije omstandigheden zonder dat aanvullende exogene suppletie en synthetische substraten vereist zijn. Tot op heden is de ontwikkeling van ex vivo hPSC-kweekmodellen, die de introductie van kweekproducten naar de kliniek mogelijk maken, een belangrijke zorg geweest in stamcelonderzoek. Specifiek, moeten twee cruciale problemen worden aangepakt. Ten eerste is er behoefte aan een gehumaniseerd ex vivo kwe....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Ethiek verklaring: De menselijke placenta studie werd prospectief uitgevoerd, met goedkeuring van de Institutional Review Board voor menselijke onderzoek van de Korea University (AN09085-001). Alle experimenten werden uitgevoerd in een Clean Germ-allergene kamers faciliteit in de Korea University Medical Center. De experimenteel ontwerp en procedures met behulp hPSCs werden goedgekeurd door de Institutional Review Board van de Korea University Medical Center (AN12277-003).
1. Voorbereiding van de instrumenten, Cultuur Media en gerechten
- Smeer alle cultuur gerechten met 0,1% gelatine het. Autoclaaf met fosfaat gebufferde zoutopl....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Een voordeel van deze HPSC vermeerderingsmethode is dat daarbij bestanddelen uitgescheiden door humane cellen. Een zeer ciritical stap in het protocol is de isolatie en de cultuur van de menselijke placenta-afgeleide cellen. Dit vereist nauwkeurige en dissectie van een precieze gedeelte van HPC plaat villi. Figuur 1 toont de procedure voor placenta afgeleide celisolatie mens. Deze werkwijze is eenvoudig en geschikt voor de isolatie van cellen, en kan gemakkelijk op 1 uur worden uitgevoerd. Zoals beschre.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Dit model werd ontwikkeld om succesvol propageren hPSCs, met behoud van hun kenmerken, gehumaniseerde voedingsvrije kweekomstandigheden zonder de toevoeging van exogene recombinante groeifactoren zoals bFGF of insuline, waardoor het manipuleren van hPSCs in een gehumaniseerd micromilieu. Exogene bFGF suppletie is gebruikelijk en de toepassing van onderlagen zoals Matrigel of laminine essentieel voor voedingsvrije kweken van hPSCs 14.
Dit protocol is eenvoudig en gemakkelijk te imp.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs geven geen belangenconflicten.
Dankbetuigingen
De auteurs willen graag Soon-Cheol Hong (MD, Ph.D., Associate Professor, Afdeling Obstetrie en Gynaecologie, Medical College Korea University) bedanken voor het verstrekken van placenta weefsel. Dit werk werd mede ondersteund door subsidies (R1211902) van de National Research Foundation Korea (NRF), de Republiek Korea.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Mitomycin-C | Sigma-Aldrich Corporation | M4287 | 10 μg/ml |
| Mycoplasma detection kit | TaKaRa Bio Inc. | #6601 | |
| Matrigel | BD Biosciences | #354277 | |
| mTeSR1 | STEMCELL Technologies Inc. | #05850 | |
| Dispase | Worthington Biochemical Corporation | LS02100 | 1 mg/ml |
| Gelatin | Sigma-Aldrich Corporation | G2500 | 0.10% |
| BM-Cyclin | Roche | 799 050 | 10 μg/ml |
| RNeasy mini kit | Qiagen | 74104 | |
| Nano Drop Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific Inc | ||
| iQ SYBR Green qPCR Master Mix | Bio-Rad Laboratories | #170-8882AP | |
| ES Cell Characterization kit | Chemicon International, Inc., | SCR001 | |
| Power cDNA Synthesis Kit | iNtRON Biotechnology | 25011 | |
| QIAamp® DNA Micro kit | Qiagen | 56304 | |
| AmpF/STR® Identifiler® PCR Amplification kit | Applied Biosystems Inc. | 4322288 | |
| Applied Biosystems® 3130xl Genetic Analyzer | Applied Biosystems Inc. |
Referenties
- Xu, C., et al. Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 19 (10), 971-974 (2001).
- Amit, M. C., Shakiri, V., Margulets, J. Itskovitz-Eldor Feeder layer and serum-free culture of human embryonic stem cells. Biol Re....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
