Gevoelige detectie van Proteopathic Zaaien activiteit met FRET flowcytometrie

Samenvatting

De overdracht van eiwitaggregaten, of proteopathische zaden, van cel tot cel kan ten grondslag liggen aan de progressie van pathologie in neurodegeneratieve ziekten. Hier wordt een nieuwe FRET-flowcytometrische assay beschreven die een specifieke en gevoelige detectie van zaaiactiviteit uit recombinante of biologische monsters mogelijk maakt.

Samenvatting

Steeds meer bewijs ondersteunt transcellulair voortplanting van toxische eiwitaggregaten, of proteopathische zaden, als een mechanisme voor de initiatie en progressie van pathologie in verschillende neurodegeneratieve ziekten, inclusief de ziekte van Alzheimer en de gerelateerde tauopathieën. De mogelijk cruciale rol van tau-zaden in de progressie van de ziekte ondersteunt sterk de noodzaak van een gevoelige test die gemakkelijk seeding-activiteit detecteert in biologische monsters.

Door de specificiteit van fluorescentie resonantie energieoverdracht (FRET), de gevoeligheid van flowcytometrie en de stabiliteit van een monoklonale cellijn te combineren, is een ultragevoelige seeding-test ontwikkeld die compatibel is met zaaddetectie van recombinante of biologische monsters, inclusief menselijke en muis hersenhomogenaten. De test gebruikt monoklonale HEK 293T cellen die stabiel de aggregatiegevoelige herhalingsdomein (RD) van tau tot expressie brengen, dat de ziekte-geassocieerde P301S mutatie bevat, gefuseerd met ofwel CFP of YFP, die een FRET signaal produceren bij eiwitaggregatie. De opname van proteopathische tau-zaden (maar niet andere eiwitten) in de biosensorcellen stimuleert aggregatie van RD-CFP en RD-YFP, en flowcytometrie bewaakt gevoelig en kwantitatief deze aggregatie-geïnduceerde FRET. De test detecteert femtomolare concentraties (monomeer equivalent) van recombinante tau-zaden, heeft een dynamisch bereik van drie ordes van grootte en is compatibel met hersenhomogenaten van tauopathie transgene muizen en menselijke tauopathie subjecten. Met lichte aanpassingen kan de test ook seeding-activiteit van andere proteopathische zaden detecteren, zoals α-synucleïne, en is ook compatibel met primaire neuronale culturen. De gemakkelijkheid, gevoeligheid en brede toepasbaarheid van FRET flowcytometrie maakt het nuttig om een breed scala aan eiwitaggregatiestoaornissen te bestuderen.

Inleiding

De accumulatie van intracellulaire tau amyloids definieert tauopathieën zoals de ziekte van Alzheimer. In de vroege stadia ziekte pathologie is algemeen gelokaliseerd op discrete gebieden van de hersenen, maar met ziekteprogressie, pathologie onveranderlijk verspreidt zich over verschillende neurale netwerken ^1-5. Accumuleren bewijs suggereert transcellulaire verspreiding van giftige eiwit aggregaten ten grondslag ligt aan deze pathologie (herzien in ^10/06). In dit model worden proteopathic zaden (bv, tau) vrijgelaten uit de donorcellen en voer naburige cellen, transformeren inheemse tau-eiwit in de vorm misfolded via templated conformationele verandering ^11-15. De hier beschreven bepaling werd ontwikkeld om dergelijke zaaien activiteit gevoelig detecteren. Het is compatibel met recombinant eiwit en biologische monsters en maakt kwantificering van minuut niveaus van proteopathic zaaien activiteit ^16.

HEK 293T-cellen die stabiel tot expressie tau herhaal domain (RD) met de ziekte- geassocieerde P301S mutatie gefuseerd aan ofwel CFP en YFP (hierna tau-RD-CFP / YFP cellen) dienen als stabiele biosensor van zaaien activiteit. Aangezien proteopathic zaden, de cellen behouden tau als een oplosbaar monomeer, en niet betekenisvol achtergrond FRET. Spontane opname of liposomen gemedieerde transductie van tau zaden in cellen, resulteert echter in RD-CFP en YFP RD-aggregatie, welk een FRET signaal dat wordt gemeten tussen enkele cellen via flowcytometrie produceert.

Talrijke bestanddelen van deze test werden om de gevoeligheid verhogen en verlagen variabiliteit. Een monoklonaal cellijn met een 1: 1 RD-CFP / YFP expressie verhouding werd gekozen, omdat het optimale signaal: ruis. Om de gevoeligheid te verhogen, fosfolipiden worden gebruikt om zaden te voeren direct in cellen (hoewel biologische mechanismen te bestuderen van opname, kan deze worden weggelaten). Tenslotte flowcytometrie monitors FRET op populatieniveau en een enkele cel level, in tegenstelling tot andere eiwitten aggregatie-assays. Het eindresultaat maatregel geïntegreerde FRET dichtheid sterk kwantitatief en neemt zowel het aantal cellen met aggregatie, en de mate waarin aggregatie heeft plaatsgevonden binnen elke cel. Al deze geoptimaliseerde parameters verhogen de gevoeligheid en reproduceerbaarheid te verzekeren.

Dit systeem werd onlangs gebruikt in een uitgebreide studie in transgene muizen P301S tauopathie ¹⁷ dat de temporele ontstaan ​​en de progressie van tau zaaien activiteit ten opzichte van andere veelgebruikte tau pathologische markers (bijv, MC1, AT8, PG5 en ThioflavinS) geëvalueerd. Seeding activiteit veruit de oudste en meest robuuste marker van tau pathologie geëvalueerd voorafgaand histologische detectie tenminste 6 weken. Seeding activiteit verschijnt 1,5 maanden progressief toeneemt met de leeftijd, hetgeen een oorzakelijke rol proteopathic zaden in het ontstaan ​​en / of de progressie van neurodegeneratie ^16.

e_content "> Nauwkeurige kwantificering van minieme hoeveelheden entmateriaal uit biologische monsters studies progressie vroege ziekte te volgen te vergemakkelijken. Door verkorting proces duur en het mogelijk gebruik van jonge dieren, kan dit de efficiëntie en nauwkeurigheid van preklinische dierproeven verhogen. Bijvoorbeeld, in de P301S muis eerder beschreven, kan loodverbindingen zoals geleverd reeds 4-6 weken (onmiddellijk voor of bij het begin van zaaien activiteit) en gecontroleerd op werkzaamheid 2-4 weken later. De test dient nauwkeurig verminderingen van zaaien kwantificeren activiteit. FRET doorstroomcytometrie is in vitro screening toepassingen. Bijvoorbeeld, anti-tau reagentia (bijvoorbeeld antilichamen, kleine moleculen, etc.) kan snel worden getest op hun vermogen te blokkeren zaaien inductie direct in kweek met behulp van recombinant tau aggregaten of hersenen afgeleide lysaten als kiem bron (figuur 5). Bij deze opstelling, wanneer entmateriaal bereid afperiment duurt slechts drie dagen in beslag, met inbegrip van data-analyse. De snelle kwantificering van proteopathic zaaien activiteit kan aldus veel studies van neurodegeneratie vergemakkelijken.

Protocol

NB: Dit protocol benadrukt het gebruik van FRET flowcytometrie voor het opsporen van zaaien activiteit van de muis biologische monsters. Het is ook compatibel met recombinant fibrillen en menselijke biologische monsters. Muizen euthanasie en hersenen oogsten werd uitgevoerd volgens IACUC-erkende procedures.

1. Brain Extraction

1. Na diepe verdoving met isofluraan (2%), perfuseren een muis met ijskoude PBS met 0,03% heparine en extraheer de hersenen na de in Gage et al beschreven details. ¹⁸
2. Plaats gewonnen weefsel in een cryo-flesje, en snap bevriezen door het plaatsen in vloeibare stikstof. Als alternatief bevriezen weefsel op droog ijs. Eenmaal bevroren, overdragen weefsel -80 ° C en opslag voor langere tijd, indien nodig.
   NB: Dit protocol is compatibel met hele hersenhomogenaten of micro-ontleed hersengebieden. Zie Hagihara et al. Voor een gedetailleerde micro-dissectie protocol ^19.

2. Voorbereiding van de Biologische Seed Materiaal

1. Bereid homogenisatiebuffer door oplossen proteaseremmers (EDTA-vrije) in 1x TBS (1 tablet per 10 ml). Vortex krachtig, en op te slaan op het ijs. Proteaseremmers moet EDTA vrij om biosensor levensvatbaarheid van de cellen te behouden zijn.
2. Weeg bevroren hersenweefsel in een wegwerp wegen boot, en over te dragen aan een 5 ml conische buis. Add ijskoude homogenisatiebuffer, zodat de eindoplossing 10% gewicht / volume. Tijdelijk op te slaan op het ijs. Weefselmassa en daaropvolgende homogenisering buffer volume is afhankelijk van de grootte van de hersenen en / of gebieden gebruikt. Hier wordt een volwassen muis hemibrain gewicht 0,2 g gesuspendeerd in 2 ml van een 10% gew / vol oplossing.
3. Overdracht monsters in een koude kamer, en pas een sonde ultrasoonapparaat naar de juiste instellingen. Voor probe ultrasoonapparaat met Omni Ruptor (hier getoond), zet de AAN tot 20%, wat overeenkomt met ongeveer 75 W. Met een pulsmodus te verzekeren monsters niet over-verwarmd tijdens ultrasoonapparaat. Stel de pulser tot 30%, overeenkomend met ongeveer 500 msec.
4. Reinig het uiteinde van de sonde ultrasoonapparaat door spoelen met water, isopropanol en water weer afvegen van de sonde tussen elke oplossing. Wees er zeker van te spoelen en veeg zowel de zijkanten en onderkant van de sonde met een lab-doekjes.
5. Werken met één monster tegelijk onderdompelen sondetip in de homogenisatiebuffer en start de sonicator. Met behulp van de kracht en de pulser instellingen zoals hierboven beschreven, leveren 25 in totaal pulsen. Zorg ervoor dat het weefsel volledig in suspensie. Wees voorzichtig om schuimen van het monster tijdens deze stap te vermijden.
   Opmerking: De monsters zijn gevoelig voor schuimvorming indien a) het totale volume is laag of b) het homogenaat opwarmt. Met deze specifieke instrument, niet ultrasone trillingen met volumes van minder dan 250 pl. Om ervoor te zorgen monsters blijven gekoeld, kunnen buizen op ijs bewaard worden tijdens deze stap.
6. Reinig de sonde door weg te vegen resterende lysaat, dan levert 10 pulsen in een bekerglas of schoon water. Spoel de wanden en bodem van de sonde met water, isopropanol en water opnieuw (zoals bij stap 2,4), vegen drogen tussen elke stap. Om besmetting te voorkomen, spoel de sonde tussen de monsters.
   OPMERKING: tau aggregaten, we hebben niet gevonden dat strengere reiniging die nodig zijn voor het voorkomen van sample-to-sample besmetting zijn. Andere amyloids kunnen evenwel extra zorg die uitvoerig is beschreven in de literatuur ^20,21 vereisen.
7. WINKEL homogenaten op ijs totdat alle monsters zijn verwerkt.
8. Spin homogenaten bij 21.300 xg gedurende 15 min bij 4 ° C.
9. Breng de bovenstaande om een ​​schone buis, verzorgen de pellet te verstoren. Gooi de pellet. Aliquot de supernatant en opslag lysaten bij -80 ° C voor verder gebruik. Vermijd vries / ontdooi cycli van de homogenaten, echter, zoals dit vermindert zaaien efficiency.

3. replating Biosensor Cellen

LET OP:Gebruik vier cellijnen voor deze test: HEK 293T (cellijn # 1), RD-P301S-GVB (cellijn 2 #), RD-P301S-YFP (cellijn 3 #) en RD-P301S-CFP / YFP ( cellijn # 4). Gelieve referentie Tabel 1 voor de bijdrage van elke cellijn aan de test.

1. In een steriele omgeving, aspireren kweekmedium. Spoel cellen met warm PBS, en zuig. Trypsinize cellen (3 ml trypsine-EDTA (0,05%)) gedurende 3 min, blussen met warm kweekmedium (9 ml van DMEM, 10% FBS, 1% pen / strep, 1% GlutaMax) en direct cellen te dragen aan een conische buis.
2. Centrifugeer cellen bij 1000 g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Zuig medium en resuspendeer celpellet in warm kweekmedium.
3. Met behulp van een hemocytometer, bepalen de celdichtheid voor elke cellijn. Celdichtheid afhankelijk van samenvloeiing op het moment van oogsten en resuspensie volume. Resuspendeer cellen geoogst uit een 10 cm schaal bij 90% confluentie in 10 ml media, celdichtheid ongeveer 1 miljoen cellen / ml.
4. Makeneen master mix cellen + medium zodat elk putje van een 96 putjesplaat zullen 35.000 cellen in 130 gl medium bevatten (bijvoorbeeld om een master mix maken 100 putten, resuspendeer 3,5 miljoen cellen in 13 ml media). Wijzigen van het aantal cellen aan individuele experimentele ontwerpen en tijdlijnen passen. Voor celtherapie ~ 18 uur na plating, voeg 35.000 cellen per putje van een 96-wells plaat.
5. Met behulp van een multi-channel pipet langzaam pipet 130 pi master mix celsuspensie in elk putje van een vlakke bodem, weefselkweek behandelde 96 well plaat. Terwijl plating, plaatst de pipet tip in het midden van de put, niet de bodem van de plaat raken.
   OPMERKING: Hoewel plating formaat kan worden aangepast, zodat n = 4 putten voor elk van cellijnen 1-3 per plaat wordt aanbevolen. De rest van de plaat (n = 84) is gereserveerd voor cellijn # 4 (biosensor cellen).
6. Laat de cellen bezinken door de plaat ongestoord 10 min bij kamertemperatuur. Incubeer O / N bij 37 ° C, 5% CO ₂ en &# 8805; 80% relatieve vochtigheid.

4. Behandeling Cellen

LET OP: De volgende dag, toen tau biosensor cellen 60-65% confluent, bereiden zaad transductie complexen als volgt:

1. In één buis, combineer transfectie reagens, zoals Lipofectamine met verminderde serum media, zoals Opti-MEM, een master mix maken. Per putje, voeg 1,25 ul transfectiereagens en 8,75 pi verlaagde serum media. Flick buis voorzichtig mengen kort spin down en incubeer gedurende 5 min bij RT.
2. In een andere buis, combineer entmateriaal (aliquot lysaat uit stap 2.9) met verminderde serum media.
   OPMERKING: volume van entmateriaal zal variëren naar gelang van het experiment. Bij de keuze van het zaad volume, rekening houden met: overvloed van zaden in een monster en mogelijke toxiciteit. Ruwe homogenaten kan toxisch zijn voor cellen. Als zodanig, gebruikt u de laagst mogelijke volume op het gewenste effect te controleren. Eerder geteste volumes lysaat / goed bereik frOM 1-5 ul, overeenkomend met 5-20 ug totaal eiwit. Zorg ervoor dat het totale volume per putje (zaden + verlaagde serum media) is 10 pi.
3. Combineer de inhoud van de twee buizen van 4,1 en 4,2, flick beschreven voorzichtig mengen kort spin down (1000 xg, 5 sec) en incubeer bij kamertemperatuur gedurende ten minste 20 minuten en maximaal 2 uur.
4. Voorzichtig pipet 20 ul van transductie complex aan de kant van individuele biosensor putjes. Gebruik drie technische herhalingen, indien mogelijk. Terugkeer behandelde cellen naar de incubator gedurende 24-48 uur. Incubeer onder dezelfde omstandigheden als beschreven in stap 3,6.
   LET OP: De juiste negatieve controle voorwaarde voor deze opstelling is biosensor cellen behandeld met lege liposomen (dwz, liposoom reagens + verlaagde serum media) vanwege de toepassing van fosfolipiden introduceert een lichte verschuiving in de fluorescentie profiel ten opzichte van cellen onbelicht aan liposoom reagens biosensor.

5. Oogsten Cellen voor FRET flowcytometrie

NB Voordat oogsten-cellen doorgaans 24-48 uur na de behandeling is het mogelijk om een ​​eerste uitlezing van zaaien activiteit te krijgen met de GFP filter op een standaard geïnverteerde fluorescentiemicroscoop. Cellen behandeld zonder zaad materiaal (dwz, lege liposomen) zal diffuse fluorescentie vertonen, terwijl de cellen behandeld met zaad materiaal intense punctata en reticulaire intracellulaire insluitsels (Figuur 1A - B) zal laten zien.

1. Met behulp van een multi-channel pipet, zuig alle cel medium (150 pl). Trypsinize (50 gl) cellen gedurende 5 min, en blussen met 150 ul koud kweekmedium. Voeg geen PBS spoeling voorafgaand aan behandeling met trypsine bij deze stap, aangezien het mobiele heffen en daaropvolgende celverlies veroorzaken. Exclusief eventuele besmetting van dode cellen en puin tijdens flowcytometrie via gating strategieën.
2. Direct na afschrikken overdracht cellen aan een 96 putjes met ronde bodemplaat en centrifugeer bij 1000 g gedurende 5 min bij kamertemperatuur.
3. Zuig en gooi medium, zorg om te voorkomen dat verstoring van de cel pellet.
4. Zacht, maar grondig, resuspendeer de celpellet in 50 gl 2% paraformaldehyde, en incubeer 10 min. Als alternatief, lopen de cellen leven, hoewel fixatie levert schoner en consistente resultaten.
5. Centrifugeer cellen bij 1000 g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Aspireren en gooi paraformaldehyde, zorg om te voorkomen dat verstoring van de cel pellet.
6. Zacht, maar grondig, resuspendeer de celpellet in 200 ui gekoelde flowcytometrie buffer (HBSS, 1% FBS, 1 mM EDTA) en laat de plaat zo snel mogelijk naar cel klonteren te voorkomen.

6. FRET flowcytometrie

OPMERKING: Gebruik een flowcytometer zoals MACSQuant VYB, die is uitgerust met FRET-compatibele laserlijnen en filtersets (tabel 2). Voor elke stap in deze sectie, klikt u op de put van belang het gebruik van 96 en sjabloon van de software, en klik op"Spelen" met sample opname en doorstroming te beginnen. Maak percelen of statistieken tafels door te klikken op het pictogram van de 'nieuwe analyse venster'. Veranderen as parameters op individuele bivariate percelen door te klikken op de titel op zowel de X- of Y-as en het selecteren van de juiste filter. Naar cel populaties of fluorescentie signalen verplaatsen, vergroten of de spanningen in verband met de juiste filters te verlagen. Met dit instrument, lopen <1000 events / sec om nauwkeurige eencellige toezicht te garanderen.

1. Maak een Side Scatter-Area (SSC-A) versus Forward Scatter-Area (FSC-A) bivariate plot, en met cellijn # 1 draait, stel de SSC en FSC spanningen totdat de cel bevolking is in de linker kwadrant. Klik op de polygoon gereedschap en definiëren de cel populatie (Poort P1). Voor alle venstertijd parameters zie figuur 2.
2. Maak een FSC-H (hoogte) vs FSC-A bivariabelendiagram en toepassing Poort P1 op dit perceel door te klikken op "live" boven de plot, en het selecteren van P1. Met cellijn # 1hardlopen, klikt u op de polygoon gereedschap en definiëren enkele cellen (Poort P2).
3. Maak 3 histogram percelen, één voor elk van de filters van belang: GVB, YFP en FRET. Solliciteer Poort P2 om al deze percelen door te klikken op "live" boven de percelen, en het selecteren van P2. Met cellijn # 1 draait, passen spanningen zodanig dat de mediaan cel populatie in het GVB, YFP en FRET histogrammen zijn allemaal tussen 0 en 1. Om GVB en FRET meten, prikkelen cellen met de 405 nm laser, en capture fluorescentie met een 450/50 nm en 525/50 nm filter, respectievelijk. Om YFP meten, prikkelen cellen met een 488 nm laser en capture fluorescentie met een 525/50 nm filter. Laser en filterinstellingen worden verder beschreven in tabel 2.
4. Voeren compensatie voor GVB spillover in de FRET en YFP kanalen.
   OPMERKING: Compensatie is het proces van fluorescentie spillover correctie. Fluorescentie spillover treedt op wanneer de fluorescentie-emissie van een fluorochroom wordt gedetecteerd binnen een filter desibestaande situaties om het signaal te meten van een ander fluorochroom. Met de juiste vergoeding, kan het GVB spillover fluorescentie worden verwijderd uit de FRET en YFP kanalen.
   OPMERKING: Compensatie vereist de aanwezigheid van zowel de fluorescentie-positieve en -negatieve cellen. Dus, om te compenseren voor het GVB-positieve cellen (cellijn # 2), negatieve cellen (cellijn # 1) moet worden toegevoegd aan het monster voorafgaand aan de vlucht.
   1. Piek in 30 ul van cellijn # 1 ophanging van een enkele ver in 200 ul-cellijn # 2 schorsing onmiddellijk voorafgaand aan compensatie.
   2. Klik op het pictogram "Instrument Instellingen", vervolgens het tabblad 'compensatie' en vink 'matrix' om de vergoeding tafel te openen.
   3. Maak een FRET-A vs GVB-A bivariate plot, en poort P2 van toepassing, zoals beschreven in stap 6.3. Met cellijnen 1 + 2 draait, klik op het icoon 'kwadrant' en trekken kwadranten zodanig dat de fluorescentie-negatieve en -positieve bevolkingsgroepen worden gescheiden door de onderste twee kwadranten (Gates LL3 eennd LR3, respectievelijk).
   4. Maak een tabel met statistieken dat de gemiddelde fluorescentie-intensiteit (MFI) van FRET voor de LL3 en LR3 poorten weergeeft. Stel de parameter FRET in de vergoeding matrix tot de MFI van het FRET signaal is gelijk tussen LL3 en LR3. Na deze stap, de MFI van het FRET signaal is gelijk tussen ongekleurd cellen en CFP-positieve cellen, wat suggereert dat de afwezigheid van GVB spillover in de FRET kanaal.
   5. Maak een YFP-A vs GVB-A bivariate plot, en poort P2 van toepassing, zoals beschreven in stap 6.3. Tekenen kwadranten (LL4 en LR4) gelijk aan die gedaan in stap 6.4.3.
   6. Maak een tabel met statistieken dat de MFI van YFP geeft voor LL4 en LR4. Stel de parameter YFP in de vergoeding matrix tot de MFI van de YFP signaal is gelijk tussen LL4 en LR4. Na deze stap, de MFI van een YFP signaal is gelijk tussen ongekleurd cellen en CFP-positieve cellen, wat suggereert dat de afwezigheid van GVB spillover in de YFP kanaal.
5. Follvanwege poort setup en compensatie, markeert putten van belang en lopen de rest van de plaat.
6. Nadat alle monsters zijn uitgevoerd, export data bestanden door te klikken 'bestand', dan 'copy'. Selecteer het tabblad 'databestanden ", markeert u de map experiment, en klik op' copy '.

7. Data Analysis

OPMERKING: asparameters Change op individuele bivariate percelen door te klikken op de titel op zowel de X- of Y-as en het selecteren van de juiste filter.

1. Open FCS bestanden in de flowcytometrie analyseprogramma.
2. Op basis van de scatter eigenschappen, gebruik dan een veelhoekige poort naar de cel populatie (SSC vs FSC) en singlet bevolking (FSC-H vs FSC-A) te definiëren van cellen behandeld met lege liposomen, vergelijkbaar met die in hoofdstuk 6 beschreven.
3. Als GVB compensatie werd uitgevoerd tijdens de installatie, niet verder GVB aan te passen.
4. Maak een FRET vs YFP bivariate plot. Met behulp van cellijn # 3Definieer een valse FRET poort door het tekenen van een veelhoekige poort die langs de helling van de FRET-positieve celpopulatie loopt. Deze poort sluit YFP single-positieve cellen die een signaal binnen het FRET filter uitzenden, en is soortgelijk aan die eerder getoond door verbieden et al getekend. ²²
5. Definieer een FRET poort door het plotten lege liposoom behandelde CFP / YFP cellen op een FRET vs GVB bivariate plot. Invoering van een veelhoekige poort langs de helling van de bevolking boven uitstrekt en weg van de populatie naar links. Moet deze poort de meeste cellen (~ 99%), uit te sluiten, zodat de achtergrond FRET is ≥1% van de cellen. Elke gebeurtenissen die verschuiven naar deze poort worden beschouwd als FRET-positief.
   OPMERKING: Elke individuele poort hierboven beschreven wordt toegepast op alle monsters vóór de aanleg van de volgende poorten. Volgende analyse worden vier afzonderlijke poorten gedefinieerd (Cell bevolking, singlet; valse FRET, FRET).
6. Record analyse parameters van belang, waaronder: procent FRET positiviteit en MFIFRET-positieve cellen. Handmatig berekenen van de geïntegreerde FRET dichtheid door het meten van het product van het percentage positiviteit en MFI.
   Opmerking: Als geïntegreerd FRET dichtheid wordt gebruikt als uitkomstmaat, set achtergrond FRET (zoals gedefinieerd in stap 7,5) en MFI groter dan of gelijk aan 1 om te voorkomen berekenen van een product dat minder dan de twee individuele factoren.

Resultaten

FRET flowcytometrie maakt gevoelige kwantitatieve en snelle detectie van zaaien activiteit uit recombinante of biologische monsters. Assay opstelling is facile: monoklonaal afgeleide stabiele cellijnen die tau-RD-CFP / YFP zijn getransduceerd met entmateriaal gedurende 24-48 uur, en onderworpen aan flowcytometrie-analyse (Figuur 1A). Bij afwezigheid van zaden, biosensor cellen handhaven tau in een oplosbare, monomere vorm (Figuur 1B). In aanwezigheid van kiemen echter biosensor cellen o...

Discussie

De FRET flowcytometrie systeem hier beschreven is een krachtig hulpmiddel voor het snel en kwantitatief beoordelen van tau zaaien activiteit. Het vereist slechts een matige celkweek ervaring en een praktische kennis van FRET en flowcytometrie. Andere zaaien assays, zoals Thioflavine T - waarbij vertoont verbeterde fluorescentie indien gebonden aan beta sheet structuur - omslachtig en vereisen een zuivere, recombinant eiwit substraat. Bovendien zaaien in vitro assays voor tau slechts semi-kwantitatief en in het ...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
TBS	Sigma	T5912
cOmplete Protease Inhibitors (EDTA-vrij)	Roche	4693159001
Cryo-vials	Sarstedt	72.694.006
Analytische Weegschaal	Mettler Toledo	XSE 105DU
Weegboten	Fisher Scientific	13-735-743
15 ml conische buis	USA Scientific	1475-0501
Omni Sonic Ruptor Ultrasoon Homogenisator	Omni International	18-000-115
Micro-Tip voor Ultrasoon Homogenisator	Omni International	OR-T-156
2-Propanol	Fisher Scientific	A451
Gerooiselverminderende Oordoppen	Fisher Scientific	19-145-412
Kimwipes	Fisher Scientific	S47299
1,5 ml buisjes	USA Scientific	1615-5510
Microcentrifuge	Eppendorf	5424 000.215
DPBS	Life Technologies	14190-136
DMEM	Life Technologies	11965-084
Fetaal Runderserum	HyClone	SH30071.03
Penicilline-Streptomycine	Life Technologies	15140-122
GlutaMax	Life Technologies	35050-061
Trypsine-EDTA	Life Technologies	25300-054
50 ml conische buizen	Phenix Research	SS-PH15
25 ml reagent reservoirs	VWR	41428-954
Multikanaals pipetten	Fisher Scientific	TI13-690-049
96 welplattebodemplatten	Corning	3603
Opti-MEM	Life Technologies	31985-070
Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668019
96 welrondebodemplatten	Corning	3788
16% Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	RT 15710
PBS	Sigma-Aldrich	P5493
EDTA	Sigma-Aldrich	ED2SS
HBSS	Life Technologies	14185-052
Sorvall ST 40 Centrifuge	Thermo Scientific	75004509
BIOLiner Zwenkbare Emmerrotor	Thermo Scientific	75003796
Hemacytometer	VWR	15170-172
MACSQuant VYB Flow Cytomter	Miltenyi Biotec	130-096-116
Chill 96 Rack	Miltenyi Biotec	130-094-459
Flow Jo analysesoftware	Flow Jo
20 μl pipettenpunten	Rainin	GPS-L10
200 μl pipettenpunten	Rainin	GPS-250
1 ml pipettenpunten	Rainin	GPS-1000
200 μl pipettenpunten	USA Scientific	1111-1800
5 ml serologische pijp	Phenix Research	SPG-606180
10 ml serologische pijp	Phenix Research	SPG-607180
25 ml Serologische pijp	Phenix Research	SPG-760180