Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Zuivering van Mouse Brain Schepen

24.2K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/53208

⸱

10 november 2015

 ,  ,  , 
1Collège de France, Center for Interdisciplinary Research in Biology (CIRB), Centre National de la Recherche Scientifique CNRS, Unité Mixte de Recherche 7241, Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, 2Centre Interdisciplinaire de Recherche en Biologie, 3MEMOLIFE Laboratory of Excellence and Paris Science, Lettre Research University, 4Université Paris Descartes, Faculté de Pharmacie, Université Paris Diderot

In dit artikel

Samenvatting

We beschrijven een protocol dat de zuivering van het vasculaire compartiment van de muizenhersenen mogelijk maakt. Geïsoleerde hersenvaten omvatten endotheelcellen die zijn verbonden door strakke verbindingen en omringd door een continue basale lamina, pericyten, vasculaire gladde spiercellen, evenals perivasculaire astrogliale membranen.

Samenvatting

In de hersenen meeste vasculaire systeem bestaat uit een selectieve barrière, de bloed-hersenbarrière (BBB) ​​de uitwisseling van moleculen en immuuncellen tussen de hersenen en het bloed regelt. Bovendien is de enorme neuronale metabolische vraag vereist van moment tot moment regulering van de bloedstroom. Met name afwijkingen van deze verordeningen zijn etiologische kenmerken van de meeste hersenen pathologieën; zoals glioblastoom, beroerte, oedeem, epilepsie, degeneratieve ziekten (ex: ziekte van Parkinson, ziekte van Alzheimer), hersentumoren, alsook inflammatoire aandoeningen zoals multiple sclerose, meningitis en sepsis-geïnduceerde hersenendysfuncties. Dus, het begrijpen van de signalering gebeurtenissen moduleren van de cerebrovasculaire fysiologie is een grote uitdaging. Veel inzicht in de moleculaire en cellulaire eigenschappen van de verschillende celtypen die het cerebrovasculaire systeem samengesteld kan worden verkregen uit primaire cultuur of celsortering van vers gedissocieerde hersenweefsel. Echter,eigenschappen zoals mobiele polariteit, morfologie en intercellulaire verhoudingen niet gehandhaafd in dergelijke preparaten. Het protocol dat hier beschreven is ontworpen om hersenen vat fragmenten te zuiveren met behoud van structurele integriteit. We tonen aan dat geïsoleerde vaten bestaan ​​uit endotheliale cellen afgedicht door tight junctions die worden omringd door een continue basale lamina. Pericyten, blijven gladde spiercellen en de perivasculaire astrocyt eindvoetjes van astrocyten membranen de endotheellaag bevestigd. Tot slot beschrijven we hoe immunokleuring experimenten uit te voeren op gezuiverd hersenen schepen.

Inleiding

De correcte werking van het centrale zenuwstelsel (CNS) is een sterk gereguleerd extracellulaire omgeving en zijn metabole eisen zijn groot in vergelijking met andere organen 1. Het CNS is ook zeer gevoelig voor een groot aantal chemicaliën, algemeen onschadelijk perifere organen maar om het, neurotoxisch. Om een ​​correcte werking te garanderen, de meeste van de CNS 'vaatstelsel vormt een endotheliale barrière; de bloed-hersenbarrière (BBB), die de stroom van moleculen en ionen en de passage van immuuncellen tussen bloed en hersenen controleert, waardoor goede homeostase 2 handhaven, maar ook beperken van de intrede van therapeutische geneesmiddelen, waardoor belemmerd behandelingen neurologische aandoeningen 3. Op cellulair niveau wordt de BBB voornamelijk ondersteund door uitgebreide tight junctions tussen endotheelcellen, gepolariseerde expressie van efflux transporters en een zeer lage prijs transcytose 4. Eigenschappen en functies van de BBB worden meestal veroorzaakt door neighboring cellen 4. Vooral pericytes een belangrijke rol spelen bij het ​​induceren en handhaven van de BBB 5,6. Omdat contractiele cellen, pericyten reguleren ook de doorbloeding 7 net als de gladde spiercellen omliggende grote schepen. Tenslotte astrocyten, grote gliale cellen van de hersenen, om grote processen eindvoetjes van astrocyten ongeveer uitgeroepen meeste hersenen vasculatuur 8 en moduleren BBB integriteit en immune rust 9, de overdracht van metabolieten neuronen 10, en induceren de nauwe koppeling tussen neuronale activiteit en bloedstroom 11,12.

De mogelijkheid om de moleculaire en cellulaire eigenschappen van het cerebrovasculaire systeem bestuderen cruciaal is om beter te karakteriseren zijn bijdrage aan de hersenen en fysiopathologie. Om deze vraag te pakken, hebben strategieën om cerebrovasculaire systeem van de hersenen te isoleren ontwikkeld, die het mogelijk maken voor de voorbereiding van de intacte fragmenten hersenen vat. Cerebrale vaartuig purification werd aanvankelijk beschreven met boviene hersenen 13 en verbeterd en aangepast aan andere diersoorten, vooral knaagdieren 14. In dit laatste onderzoek, het gebruik van filters van variërende grootte werd geïntroduceerd hersenvaten in fracties verrijkt in vaten van verschillende diameters te scheiden. Interessant is dat in dergelijke preparaten, endotheelcellen hielden hun metabolische eigenschappen 15, transporter functionaliteit 16 en 17 polarisatie. Hier beschrijven we in detail dit protocol en verder aan te tonen dat geïsoleerde schepen de meeste van hun behoud in situ constructies. Endotheelcellen blijven verbonden door krappe kruispunten en omgeven door een continue basale lamina. Pericyten en gladde spiercellen blijven de endotheliale laag, evenals perivasculaire astrocyten membranen bevestigd. Echter, astrocyten, microgliacellen, neuronen en oligodendrocyten geëlimineerd. Tenslotte beschrijven we een procedure uit te voeren immunokleuring op geïsoleerde vaten hersenen.

Tot nu toe de meeste van de moleculaire en cellulaire studies over de cerebrovasculaire systeem zijn uitgevoerd op gezuiverd hersenen vat cellen gedissocieerd door-celsortering gebruik van mobiele specifieke reporter muis stammen of-immunokleuring gebaseerde procedures 18,19. Hoewel deze technieken maakt de isolatie van bijna zuiver cerebrovasculaire celpopulaties, geïsoleerde cellen volledig verliezen hun in situ morfologie en interacties, die op hun beurt sterk hun moleculaire en cellulaire eigenschappen beïnvloedt. Het protocol hier beschreven, waardoor de isolatie van hele cerebrovasculaire fragmenten zonder de noodzaak van specifieke antilichamen en transgene muizen vlekken, een goed alternatief de algemene structuur van geïsoleerde hersenvaten behouden dus vermindering weerslag op hun moleculaire eigenschappen. Geïsoleerde schepen kunnen dan worden gebruikt voor het bestuderen van de activiteit van genen, eiwitsynthese en regelgeving op de BBB zoals onlangs beschreven 20,21 . Tot slot, in vergelijking met lasermicrodissectie 22,23 het huidige protocol is goedkoop, gemakkelijk uit te voeren en snel aanpasbaar aan een laboratorium.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Oplossingen en Materialen

  1. Bereid oplossingen isolatie vaartuig: B1, voeg 1,5 ml HEPES 1M tot 150 ml van HBSS; B2, voeg 3,6 g dextran 20 ml B1; B3, voeg 1 g BSA tot 100 ml B1.
  2. Wijzig de filterhouder door het snijden van de onderkant van de bovenste deel schroeven.
  3. Bereid immunokleuring oplossingen: Fixatie oplossing 4% paraformaldehyde in PBS pH 7,4; Permeabilisatie / blokkeeroplossing verdund geit serum tot 5% Triton X100 en 0,25% in PBS pH 7,4.
    Opmerking: Fixatie afhankelijk van het soort primaire antilichamen gebruikt.

2. Dissection

Opmerking: steriele omstandigheden zijn niet nodig, tenzij schepen worden gebruikt voor celkweek doeleinden.

  1. Bereid een bekerglas van 150 ml met 20 ml van B1. Houd op ijs en bedek met parafilm om luchtvervuiling te voorkomen.
  2. Diep verdoven de muis onder een kap met een klein papieren handdoek gedrenkt in 1 ml zuiver Isoflurane die wordt toegevoegd into de kooi. Anesthesie wordt gecontroleerd door een gebrek aan reactie op een teen knijpen. Dood de muis door cervicale dislocatie.
    OPMERKING: Deze stappen worden uitgevoerd in overeenstemming met de nationale en institutionele regelgeving.
  3. Optioneel: Voer intracardiale perfusie met 20 ml PBS 1x naar bloedgehalte 24 elimineren.
  4. Sectie van de huid met een scalpel van de nek tot de neus en trek het weg. Verwijder alle vervuilende haren met PBS 1x.
  5. Aan de schedel te openen, plaatst u eerst een schaar naar voren om de olfactorische gloeilamp, en open de schaar om de schedel scheuren in twee delen.
  6. Verwijderen van de hersenen met behulp van een brein spatel voorzichtig. Ontleden de choroid plexus van de laterale ventrikels zoals ze het bloedvat voorbereiding 38 zou besmetten.
    OPMERKING: Optioneel: De laatste voorbereiding zal parenchymale en hersenvliezen schepen bevatten. Indien niet gewenst, kan meninges worden afgepeld na de beschreven 38 werkwijze.
  7. Transfer de hersenen in de beker met B1-oplossing op ijs. Tot 8 hersenen kunnen samen worden behandeld.

3. Brain Tissue Homogenisering

  1. Met behulp van twee scalpels, handmatig en krachtig sloeg de hersenen in de B1 oplossing vervolgens het verkrijgen van kleine stukjes van ongeveer 2 mm.
  2. Homogeniseren van de bereiding van een geautomatiseerd Dounce homogenisator, het uitvoeren van 20 slagen bij 400 rpm. Zorg dat de glasbuis wordt gehandhaafd in ijs en het bovendeel van de douncer in oplossing bij het op en neer bewegen, teneinde de vorming van luchtzakken te voorkomen. Indien meerdere monsters worden voorbereid, was de douncer met geïoniseerd water tussen elke homogenisering.

4. Vessel Zuivering

  1. Breng het homogenaat in een 50 ml plastic buis en naar de centrifugeren bij 2000 g gedurende 10 min bij 4 ° C. Een grote witte interface (meestal myeline) wordt gevormd op de bovenkant van het vat pellet (rood wanneer geen perfusie uitgevoerd).
  2. Verwijder het supernatant. Het schip pellet en de witte interface zal elkaar gehecht blijven. Voeg 20 ml van ijskoude B2-oplossing en schud de buis met de hand en krachtig gedurende 1 minuut.
  3. Ga verder naar de tweede centrifugatie bij 4.400 g gedurende 15 min bij 4 ° C. De myeline vormen nu een dichte witte laag op het oppervlak van het supernatant.
  4. Haal voorzichtig het myeline laag van de buiswanden door houden de buis en langzaam draaien om de supernatant langs de wanden passen. Gooi myeline het supernatant. De pellet die de vaten blijft op de bodem van de buis bevestigd.
  5. Dep de binnenwand van de buis met een absorberend papier gewikkeld rond een 5 ml kunststof pipet en verwijder alle resterende vloeistoffen, vermijd contact met het schip pellet. Bewaar het buisje ondersteboven op een absorberend papier om achtergebleven vloeistof af te voeren.
  6. Hang de pellet in 1 ml ijskoude B3 oplossing door en neer te pipetteren met een laag-bindende tips, keeping de buis op ijs, voeg dan nog eens 5 ml B3 oplossing. Zorg ervoor dat schepen gedispergeerd zo veel mogelijk en hoeft aggregaten vormen.

5. Filtratie

  1. Bereid een bekerglas op ijs met 30 ml ijskoude oplossing B3. Dek af met parafilm om luchtvervuiling te voorkomen.
  2. Plaats een 20 urn zeef op een gemodificeerde filterhouder bovenop een Becker kolf en evenwicht door toepassing van 10 ml ijskoude oplossing B3.
  3. Giet de bereiding vaartuig op het filter en de vaten spoelen met 40 ml ijskoude oplossing B3.
  4. Herstellen van de filter met schone pincet en onmiddellijk onder te dompelen in de beker die de B3-oplossing. De schepen van de filter los door voorzichtig schudden.
  5. Giet het bekerglas gehalte in een 50 ml plastic buis en centrifugeer bij 2000 g gedurende 5 minuten bij 4 ° C.
  6. Opmerking: Als alternatief kan schorsing van de hersenen schepen 'uit stap 4.6 worden gefilterd op een 100 pm-zeef.In dit geval worden grotere schepen voorkeur aan de achter, terwijl de doorstroom bevat microvaten (voornamelijk capillairen), die vervolgens worden gefiltreerd op een 20 urn zeef zoals hierboven.
  7. Resuspendeer de pellet van microvaatjes in 1 ml ijskoude B3 bevat en hevel door pipetteren deze in een 1,5 ml Eppendorf buis. Centrifugeer bij 2000 g gedurende 5 minuten bij 4 ° C.

6. Fixatie, Permeabilisatie en blokkeren

  1. Transfer schepen door pipetteren in 0,2 ml PCR-buisjes met PBS met behulp van een 1,0 ml lage binding tip. Wees niet aanraken van de schepen als ze kunnen zich aan de buitenkant van de tip. Voer alle volgende stappen onder een binoculair microscoop.
  2. Voor elk van de volgende mediumveranderingen, laat de buisjes op ijs tot de vaten beneden bereikt, pipet en het grootste deel van de vloeistoffen via lange ding gel-loading pipet tips.
  3. Verwijder het grootste deel van de PBS en voeg 200 ul fixeeroplossing.De schepen door zacht schudden schorten en incubeer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur.
  4. Pipet de fixeeroplossing en te vervangen door 200 ul 1x PBS (eerste wasbeurt), incubeer gedurende 5 minuten bij RT en herhaal deze stap 3 keer. Elke keer, controleren dat de schepen correct gezonken naar de bodem van de buizen en de pipet uit 1x PBS, het waarborgen van de vaartuigen niet aangeraakt.
  5. Na de laatste wasbeurt, 1x PBS vervangen door permeabilisatie / blokkerende oplossing en incubeer 1 uur bij KT, de vaten opnieuw suspenderen door zachtjes schudden van tijd tot tijd.

7. Immunokleuring

  1. Vervang de permeabilisatie / blokkerende oplossing met de mix van primaire antilichamen (zie referenties van de antilichamen hier en verdunningen gebruikt in de Materials template tabel) verdund in de permeabilisatie / blokkeren oplossing en incubeer bij 4 ° CO / N.
  2. Na 3 wassingen in PBS bij kamertemperatuur, incubeer de vaten met het mengsel van secundaire antilichamen verdund in PBS gedurende 2 uurbij kamertemperatuur.
  3. Opmerking: we raden het uitvoeren van nucleaire kleuring met Hoechst (1: 2000) of DAPI (1: 2000) om schepen tegen mogelijke besmetting van haren of stof onder de microscoop te onderscheiden.
  4. Na 3 wassingen in PBS, resuspendeer de vaartuigen in 50 pl PBS.

8. Montage en Observation

  1. Bereid een tip met een gesiliconiseerde glazen capillair: snijd een P200 pipet met behulp van een scalpel en pas de capillaire binnen. Het volume van het capillair is bij benadering 40 pl.
  2. De schepen over te dragen aan een glasplaatje met behulp van de gesiliconiseerde glazen capillaire en de vloeistof verwijder voorzichtig met een stuk absorberend papier.
  3. Breng een druppel van de montage medium op de schepen en het bezit van een dekglaasje op 45º waardoor de daling tot aan de rand van de slip te verspreiden. Laten gaan van de dekglaasje en laat medium langzaam verspreiden. Laat het drogen O / N bij RT met bescherming tegen licht. Schepen kunnen onder een tl worden nageleefdent confocale microscoop.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Hier, een protocol waardoor de mechanische isolatie van de hersenen schepen 14 beschrijven we. Figuur 1 geeft een overzicht van de belangrijkste stappen van deze techniek. De architectuur van de hersenvaten is ingewikkeld en omvat verschillende celtypes, dwz endotheelcellen verzegeld door tight junctions omgeven door pericyten, gladde spiercellen, en astrocyten voet 9 processen. Aldus, na isolering van de hersenvliezen, wilden wij de structuur van gezuiverde vaartuigen kar...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De bloed-hersenbarrière regelt de doorgang van fysiologische stoffen in en uit het CZS en beschermt tegen potentieel schadelijke stoffen in het bloed. Het is betrokken bij diverse CNS ziekten, waaronder neurodegeneratieve ziekten 2 en hersentumoren 28. De extreem lage permeabiliteit van de BBB belemmert ook de doorgang van therapeutische middelen gericht op neurale cellen en de ontwikkeling van methoden voornemens reversibel openen BBB zonder nadelige gevolgen voor de hersenen is een zeer actief on...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door de Labex MemoLife en door de ARSEP (Fondation pour l'aide à la recherche sur la sclerose en plaques)

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Tissue Grinder Size CThomas scientific3431E25
centrifuge 5415 REppendorf
centrifuge 5810 REppendorf5811000320
High-performance, Modular StereomicroscopeLeicaMZ6
Compact System Provides High Quality Leica LED1000LeicaLED1000
low binding tips (P1000)Sorenson BioScience14200T
Swinnex 47 mm filter holder PP 8/PkMilliporeSX0004700
Nylon net filter disc Hydrophilic 20 µm 47 mm 100/PkMilliporeNY2004700
Nylon net filter disc Hydrophilic 100 µm 47 mm 100/PkMilliporeNY1H04700
Standard Wall Borosilicate TubingSutter InstrumentB150-86-7.5
Microscope SlidesThermo Scientific1014356290F
Cover Slips, Thickness 1Thermo ScientificP10143263NR1
0.2 ml Thin-walled tubes and domed capThermo ScientificAB-0266
 PARAFILM M (roll size 4 in. × 125 ft)SigmaP7793-1EA
HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol redLife technology14175-129
HEPES (1M)Life technology15630056
Dextran from Leuconostoc spp. Mr ~70,000Sigma31390
Bovine serum albuminSigmaA2153
10x PBSEuromedexET330
16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free Thermo Scientific28908
Triton X-100SigmaX100
bisBenzimide H 33342 trihydrochloride (Hoechst)Sigma14533
Mounting medium Fluoromount-GSouthern Biotech0100-01
Isolectin GS-IB4 From Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor 488 Conjugate; Dilution 1/100Life technologyI21411
Agrin (rabbit) ; dilution 1/400kindly provided by Dr Markus A Ruegg
Anti ZO-1 (mouse, clone 1A12)Life technology33-9100dilution 1:500
Anti Smooth Muscle Actin (mouse, clone 1A4)SigmaA2547 dilution 1:500
Anti GFAP (mouse, clone GA5)SigmaG3893 dilution 1:500
Anti AQP4 (rabbit)SigmaA5971 dilution 1:500
Anti Cx43 (mouse, Clone  2)BD Biosciences610061 dilution 1:500
Anti Olig2 (rabbit)MilliporeAB9610 dilution 1:200
Anti NF-M (mouse)provided by Dr Beat M. Riederer, University of Lausanne, Switzerland. dilution 1:10
Anti Iba1 (rabbit)Wako019-19741 dilution 1:400
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) AntibodyLife technologyA11029 dilution 1:2,000
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugateLife technologyA11034 dilution 1:2,000
Alexa Fluor 555 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) AntibodyLife technologyA21424 dilution 1:2,000
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugateLife technologyA21429 dilution 1:2,000

Referenties

  1. Rolfe, D. F., Brown, G. C. Cellular energy utilization and molecular origin of standard metabolic rate in mammals. Physiological Reviews. 77 (3), 731-758 (1997).
  2. Zlokovic, B. V. The Blood-Brain Barrier in Health and Chronic Neurodegenerative Disorders. Neuron. 57 (2), 178-201 (2008).
  3. Pardridge, W. M. Blood-brain barrier delivery. Drug Discovery Today. 12 (1-2), 54-61 (2007).
  4. Abbott, N. J., Patabendige, A. A. K., Dolman, D. E. M., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiology of Disease. 37 (1), 13-25 (2010).
  5. Daneman, R., Zhou, L., Kebede, A. A., Barres, B. A. Pericytes are required for blood-brain barrier integrity during embryogenesis. Nature. 468 (7323), 562-566 (2010).
  6. Armulik, A., Genové, G., et al. Pericytes regulate the blood-brain barrier. Nature. 468 (7323), 557-561 (2010).
  7. Hall, C. N., Reynell, C., et al. Capillary pericytes regulate cerebral blood flow in health and disease. Nature. 508 (7494), 55-60 (2014).
  8. Mathiisen, T. M., Lehre, K. P., Danbolt, N. C., Ottersen, O. P. The perivascular astroglial sheath provides a complete covering of the brain microvessels: an electron microscopic 3D reconstruction. Glia. 58 (9), 1094-1103 (2010).
  9. Abbott, N. J., Rönnbäck, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nature Reviews Neuroscience. 7 (1), 41-53 (2006).
  10. Allaman, I., Brain Magistretti, P. J. Energy Metabolism: Focus on Astrocyte-Neuron Metabolic Cooperation. Cell Metabolism. 14 (6), 724-738 (2011).
  11. Attwell, D., Buchan, A. M., Charpak, S., Lauritzen, M., MacVicar, B. A., Newman, E. A. Glial and neuronal control of brain blood flow. Nature. 468 (7321), 232-243 (2010).
  12. Iadecola, C., Nedergaard, M. Glial regulation of the cerebral microvasculature. Nature Neuroscience. 10 (11), 1369-1376 (2007).
  13. Brendel, K., Meezan, E., Carlson, E. C. Isolated brain microvessels: a purified, metabolically active preparation from bovine cerebral cortex. Science (New York, N.Y.). 185 (4155), 953-955 (1974).
  14. Yousif, S., Marie-Claire, C., Roux, F., Scherrmann, J. -M., Declèves, X. Expression of drug transporters at the blood-brain barrier using an optimized isolated rat brain microvessel strategy. Brain Research. 1134, 1-11 (2007).
  15. Dallaire, L., Tremblay, L., Béliveau, R. Purification and characterization of metabolically active capillaries of the blood-brain barrier. Biochemical Journal. 276 ((Pt 3)), 745(1991).
  16. Boado, R. J., Pardridge, W. M. The brain-type glucose transporter mRNA is specifically expressed at the blood-brain barrier. Biochemical and Biophysical Research Communications. 166 (1), 174-179 (1990).
  17. Betz, A. L., Firth, J. A., Goldstein, G. W. Polarity of the blood-brain barrier: Distribution of enzymes between the luminal and antiluminal membranes of brain capillary endothelial cells. Brain Research. 192 (1), 17-28 (1980).
  18. Daneman, R., Zhou, L., Agalliu, D., Cahoy, J. D., Kaushal, A., Barres, B. A. The Mouse Blood-Brain Barrier Transcriptome: A New Resource for Understanding the Development and Function of Brain Endothelial Cells. PLoS ONE. 5 (10), e13741(2010).
  19. Zhang, Y., Chen, K., et al. An RNA-Sequencing Transcriptome and Splicing Database of Glia, Neurons, and Vascular Cells of the Cerebral Cortex. The Journal of Neuroscience. 34 (36), 11929-11947 (2014).
  20. Boulay, A. -C., Saubaméa, B., et al. The Sarcoglycan complex is expressed in the cerebrovascular system and is specifically regulated by astroglial Cx30 channels. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 9(2015).
  21. Boulay, A. -C., Mazeraud, A., et al. Immune quiescence of the brain is set by astroglial Connexin 43. The Journal of Neuroscience. 35 (10), 4427-4439 (2015).
  22. Ball, H. J., McParland, B., Driussi, C., Hunt, N. H. Isolating vessels from the mouse brain for gene expression analysis using laser capture microdissection. Brain Research Protocols. 9 (3), 206-213 (2002).
  23. Murugesan, N., Macdonald, J., Ge, S., Pachter, J. S. Probing the CNS microvascular endothelium by immune-guided laser-capture microdissection coupled to quantitative RT-PCR. Methods Mol Biol. 755, 385-394 (2011).
  24. Okada, S. L. M., Stivers, N. S., Stys, P. K., Stirling, D. P. An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time. Journal of Visualized Experiments. (93), (2014).
  25. Winkler, E. A., Bell, R. D., Zlokovic, B. V. Central nervous system pericytes in health and disease. Nature Neuroscience. 14 (11), 1398-1405 (2011).
  26. Ezan, P., André, P., et al. Deletion of astroglial connexins weakens the blood-brain barrier. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. , (2012).
  27. Simard, M., Arcuino, G., Takano, T., Liu, Q. S., Nedergaard, M. Signaling at the gliovascular interface. The Journal of neuroscience. 23 (27), 9254-9262 (2003).
  28. Dubois, L. G., Campanati, L., et al. Gliomas and the vascular fragility of the blood brain barrier. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 418(2014).
  29. Goldstein, G. W., Wolinsky, J. S., Csejtey, J., Diamond, I. Isolation of metabolically active capillaries from rat brain1,2. Journal of Neurochemistry. 25 (5), 715-717 (1975).
  30. Hjelle, J. T., Baird-Lambert, J., Cardinale, G., Specor, S., Udenfriend, S. Isolated microvessels: the blood-brain barrier in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 75 (9), 4544(1978).
  31. Head, R. J., Hjelle, J. T., Jarrott, B., Berkowitz, B., Cardinale, G., Spector, S. Isolated brain microvessels: preparation, morphology, histamine and catecholamine contents. Blood Vessels. 17 (4), 173-186 (1980).
  32. Pardridge, W. M., Sakiyama, R., Coty, W. A. Restricted transport of vitamin D and A derivatives through the rat blood-brain barrier. Journal of neurochemistry. 44 (4), 1138-1141 (1985).
  33. Gerhart, D. Z., Broderius, M. A., Drewes, L. R. Cultured human and canine endothelial cells from brain microvessels. Brain Res Bull. 21 (5), 785-793 (1988).
  34. Luo, J., Yin, X., Sanchez, A., Tripathy, D., Martinez, J., Grammas, P. Purification of endothelial cells from rat brain. Methods Mol Biol. 1135, 357-364 (2014).
  35. Munikoti, V. V., Hoang-Minh, L. B., Ormerod, B. K. Enzymatic digestion improves the purity of harvested cerebral microvessels. J Neurosci Methods. 207 (1), 80-85 (2012).
  36. Weidenfeller, C., Schrot, S., Zozulya, A., Galla, H. J. Murine brain capillary endothelial cells exhibit improved barrier properties under the influence of hydrocortisone. Brain Res. 1053 (1-2), 162-174 (2005).
  37. Bowman, P. D., Betz, A. L., et al. Primary culture of capillary endothelium from rat brain. In Vitro. 17 (4), 353-362 (1981).
  38. Bowyer, J. F., Thomas, M., Patterson, T. A., George, N. I., Runnells, J. A., Levi, M. S. A Visual Description of the Dissection of the Cerebral Surface Vasculature and Associated Meninges and the Choroid Plexus from Rat Brain. Journal of Visualized Experiments. (69), (2012).
  39. Ohtsuki, S., Yamaguchi, H., Asashima, T., Terasaki, T. Establishing a Method to Isolate Rat Brain Capillary Endothelial Cells by Magnetic Cell Sorting and Dominant mRNA Expression of Multidrug Resistance-associated Protein 1 and 4 in Highly Purified Rat Brain Capillary Endothelial Cells. Pharmaceutical Research. 24 (4), 688-694 (2007).
  40. Warren, M. S., Zerangue, N., et al. Comparative gene expression profiles of ABC transporters in brain microvessel endothelial cells and brain in five species including human. Pharmacological Research. 59 (6), 404-413 (2009).
  41. Geier, E. G., Chen, E. C., et al. Profiling Solute Carrier Transporters in the Human Blood-Brain Barrier. Clinical Pharmacology and Therapeutics. 94 (6), 636-639 (2013).
  42. Seetharaman, S., Barrand, M. A., Maskell, L., Scheper, R. J. Multidrug Resistance-Related Transport Proteins in Isolated Human Brain Microvessels and in Cells Cultured from These Isolates. Journal of Neurochemistry. 70 (3), 1151-1159 (1998).
  43. Urich, E., Patsch, C., Aigner, S., Graf, M., Iacone, R., Freskgard, P. O. Multicellular self-assembled spheroidal model of the blood brain barrier. Sci Rep. 3, 1500(2013).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Zuivering van hersenvatencentrifugatie op lage snelheidfiltratietechniekbloed hersenbarri reendotheelcellenpericytengladde spiercellenastrocytenvoetjesimmunokleuringsexperimentenbehoud van structurele integriteitisolatie van het vasculaire compartiment
Zuivering van Mouse Brain Schepen
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.