Isolatie van Mitochondriën uit Minimale hoeveelheden muis skeletspieren voor Metingen High Throughput Microplate Respiratory

Samenvatting

Hier presenteren we een aanpassing van een eerder gerapporteerde methode die de isolatie van hoogwaardige en gezuiverde mitochondriën mogelijk maakt uit kleinere hoeveelheden muisskeletspier. Deze procedure resulteert in sterk gekoppelde mitochondriën die ademen met hoge functionaliteit tijdens microplate-gebaseerde respirometrische analyses.

Samenvatting

Dysfunctionele skeletspieren mitochondria een rol spelen in gewijzigde stofwisseling waargenomen met veroudering, obesitas en type II diabetes. Mitochondriale respirometrische testen van geïsoleerde mitochondriële preparaten oog op het beoordelen van mitochondriale functie, evenals de bepaling van het mechanisme (s) van de werking van geneesmiddelen en eiwitten die het metabolisme moduleren. Huidige isolatie procedures vereisen vaak grote hoeveelheden weefsel van hoge kwaliteit mitochondriën nodig respirometrische assays opleveren. De hierin gepresenteerde werkwijzen beschrijven hoe kwaliteit gezuiverde mitochondria (~ 450 g) worden geïsoleerd uit geringe hoeveelheden (~ 75-100 mg) van muizen skeletspieren voor gebruik in high throughput metingen luchtwegen. We hebben vastgesteld dat onze isolatiemethode levert 92,5 ± 2,0% intact mitochondria door meting citraat synthase activiteit spectrofotometrisch. Bovendien Western blotanalyse in geïsoleerde mitochondria resulteerde in de zwakke expressie van het cytosolic eiwit, GAPDH, en de robuuste expressie van het mitochondriale eiwit, COXIV. Het ontbreken van een prominente band GAPDH in geïsoleerde mitochondriën indicatief is weinig verontreinigingen uit niet-mitochondriale bronnen tijdens de isolatieprocedure. Belangrijker nog, het meten van _O 2 verbruik met micro-plaat gebaseerde technologie en het bepalen van de respiratoire controle ratio (RCR) voor gekoppelde respirometrische assays toont sterk gekoppeld (RCR;> 6 voor alle assays) en functionele mitochondriën. Concluderend, de toevoeging van een afzonderlijk hakken stap en aanzienlijke vermindering motor aangedreven homogenisering snelheid van een eerder beschreven werkwijze heeft het de isolatie van hoge kwaliteit en gezuiverde mitochondria uit kleinere hoeveelheden muis skeletspier die resulteert in sterk gekoppelde mitochondria die ademen met een hoge functie tijdens microplaat respirometirc assays.

Inleiding

De primaire functie van mitochondriën is het produceren van ATP door middel van oxidatieve fosforylering. Mitochondriën hebben echter veel andere belangrijke cellulaire functies, waaronder maar niet beperkt tot: de productie en ontgifting van reactieve zuurstofsoorten, de regulering van cytoplasmatisch en mitochondriaal calcium, orgaantransport, ionische homeostase en betrokkenheid bij apoptose^1,2. Daarom is het niet verwonderlijk dat disfunctionele mitochondriën een rol spelen in veel ziektepathologieën, zoals veroudering, neurodegeneratieve ziekten, hart- en vaatziekten, kanker, obesitas en diabetes^3,4. Belangrijk is dat specifiek de mitochondriën in skeletspieren betrokken zijn bij veel van deze pathologieën^3-5.

Assays voor mitochondriale ademhaling met behulp van geïsoleerde mitochondriën maken de beoordeling van de elektronentransportketen en de functie van oxidatieve fosforylering mogelijk, en de bepaling van het(de) werkingsmechanisme(n) van geneesmiddelen en eiwitten die het metabolisme moduleren. Er bestaan procedures voor het isoleren van mitochondriën voor meerdere weefsel- en celtypen voor een verscheidenheid aan soorten^6,7. Deze procedures vereisen echter vaak grote hoeveelheden weefsel/cellen voor een hoge kwaliteit van de opbrengst van mitochondriën, wat noodzakelijk is voor klassieke respirometrische assays.

Respirometrische assays op basis van microplates maken hoge doorvoermetingen mogelijk met minimale hoeveelheden geïsoleerde mitochondriën, vaak slechts enkele µg per putje⁸. Daarom presenteren we een aanpassing van eerder gepubliceerde methoden⁷ om hoge kwaliteit mitochondriën te isoleren uit kleinere hoeveelheden muisskeletspier voor gebruik in respirometrische assays op basis van microplates. Daarnaast worden methoden geboden om de kwaliteit van de mitochondriale isolatievoorbereiding en de integriteit van de mitochondriale membranen vast te stellen. Aangezien mitochondriën in skeletspieren betrokken zijn bij veel pathologische aandoeningen, wordt het meten van O₂ consumptie in mechanistisch gedreven studies steeds gebruikelijker in biomedisch onderzoek^9,10.

Protocol

Dierstudies werden uitgevoerd onder een protocol goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite aan de Virginia Polytechnic Institute en de State University.

1. Setup (Tijd: ~ 45 min)

1. Ontdooi bevroren opslag van 0,25% trypsine, Isolation buffer voor Mitochondria (IBM) 1 en IBM2 in een 37 ° C waterbad.
2. Spoel glaswerk en ontleden instrumenten in 70% ethanol gevolgd door zuiver water.
3. Bereid 0,05% trypsine-oplossing van 0,25% trypsine voorraad door te verdunnen 1 deel trypsine in 4 delen IBM1.
4. Meng protease en fosfatase-inhibitor cocktail met cell lysis buffer (1: 100 verhouding) in een 1,5 ml microcentrifuge buis met schroefdop.
5. Aliquot 5 ml (5 ml / muis) van 0,05% trypsine in een 15 ml plastic buis.
6. Stel motor aangedreven weefselhomogenisator tot 80 RPM.

2. Isolatie van skeletspieren Mitochondriën (Tijd: ~ 90 min)

1. Euthanaseren een muis door CO ₂ inhalatie, gevolgd door cervicale dislocatie.
2. Verwijder rode spieren van de quadriceps en gastrocnemius, waarbij de soleus (~ 75-100 mg totaal) zoals beschreven in de volgende stappen omvat:
   1. Schil de huid in de richting van de muis.
   2. Verwijder het vet pad over de quadriceps beginpunt. Snijd de quadriceps pees die aan de patella met fijne getipt schaar is bevestigd.
      Opmerking: De quadriceps wordt geïdentificeerd door zijn anatomische positie op het voorste gedeelte van de proximale femur.
   3. Langzaam knip de aponeurose tussen het bot en de quadriceps, terwijl het vermijden van de dijbeenslagader, aan de quadriceps van het bot te bevrijden. Snijd de pees met fijne getipt schaar op de oorsprong punt op het dijbeen van de quadriceps te bevrijden en plaats de quadriceps spier in gekoeld PBS.
   4. Verwijder zichtbaar vetweefsel over de quadriceps met een schaar. Draai de quadriceps om zodat het gedeelte van de spier die werd bovenop de femur wordt geconfronteerd up. Open de quadriceps met een tang in een ventilatie-beweging. Verwijder de twee zichtbare rode spier gedeelten uit elke kwab met fijne getipt schaar en plaats in een bekerglas met 5 ml gekoelde IBM1.
      Opmerking: quadricepsspier weergegeven met twee lobben met een strook rode spieren gelegen nabij de zijrand van elke lob.
   5. Snijd de huid bovenop de achillespees met fijne getipt schaar en schil de huid in de richting van de muis. Snijd de blootgestelde achillespees en schil de spier naar het lichaam van de muis.
   6. Snijd de pees aan de laterale en mediale condylus van het femur met fijne getipt schaar om de gastrocnemius te bevrijden en plaats de gastrocnemius gehecht aan de pezen in gekoelde PBS.
   7. Flip de gastrocnemius over en trek het soleus spier en plaats in het bekerglas met 5 ml gekoelde IBM1. Ventilator open de gastrocnemius. Verwijder de drie visuele rode spier porties (twee laterale en een mediale oppervlakkige rode stroken) met fijne getipt schaars en overbrengen naar het bekerglas met 5 ml gekoelde IBM1.
3. Verwijder een ander ~ 75-100 mg rode spierweefsel het andere been van de muis (zoals beschreven in stap 2.2) en plaats in een 1,5 ml microcentrifuge buis met protease inhibitor cocktail en fosfatase en cellysis buffer (50 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 150 mM NaCl, 1% natrium dodecyl sulfaat, 0,5% natrium deoxycholaat, 1% polyoxyethyleen (9) nonylphenylether, vertakte. onmiddellijk flash-bevriezen tweede monster in vloeibare stikstof om later bij Western blotting (zie stap 6,1).
4. Plaats een pre-gekoelde, platte kunststof oppervlak op het ijs in een grote bak. Giet een druppel IBM1 op het kunststofoppervlak en gebruik pincet om alle rode doorgesneden spier (stap 2.2.4 en 2.2.7) in IBM1 druppel plaatsen. Hak het spierweefsel gedurende 2 min met 3 enkele rand scheermesjes door het veranderen van scheermessen iedere 40 sec.
5. Breng het gehakt weefsel in nieuw bekerglas met 5 ml vers IBM1 houden door het plastic oppervlak van the bekerglas en schrapen de spier in het bekerglas met een scheermesje. Neem deze oplossing en laat het door een 100 um cel zeef geplaatst op een 50 ml conische buis.
6. Dep het weefsel met een moeilijke taak wisser en breng deze in 5 ml van 0,05% trypsine-oplossing. Gebruik een pincet om het weefsel van de taak wisser te verwijderen.
7. Incubeer het spierweefsel op ijs gedurende 30 min in 0,05% trypsine-oplossing.
8. Draai de 15 ml conische buis met trypsine / spier mengsel bij 200 xg gedurende 3 min bij 4 ° C.
9. Giet de trypsine supernatant in een afvalcontainer en resuspendeer de pellet met 3 ml ijskoude IBM1. Breng het weefsel een 45 ml glazen homogenisator buis. Spoel de 15 ml conische buis met nog eens 1,5 ml IBM1 om alle resterende monster te verzamelen en voeg deze toe aan de glashomogenisator buis.
10. Plaats het glas homogenisator buis in een beker of een plastic container gevuld helft met ijs, zodat het glas homogenisator beweegt minimaal binnen de beker.
11. Homogeniseer de weefsels / IMB1 mengsel met PTFE stamper gehecht aan een motor aangedreven weefselhomogenisator met 10 doorgangen op 80 rpm. Houd de onderkant van elke pas voor ~ 2 sec.
12. Breng de weefselhomogenaat om een ​​nieuwe 15 ml conische buis en spoel het glas homogenisator buis met 6,5 ml IBM1. Giet het IBM1 in de 15 ml conische buis met weefselhomogenaat.
13. Draai de 15 ml conische buis bij 700 g gedurende 10 min bij 4 ° C. Giet de bovenstaande vloeistof in een glas met hoge sterkte centrifugebuis en de pellet gooi.
14. Draai de supernatant van de bovenstaande stap bij 8000 xg gedurende 10 min bij 4 ° C.
15. Verwijder de IBM1 supernatant en resuspendeer de pellet door langzaam toevoegen van 500 pi van IBM2. Knip het uiteinde van een pipet en voorzichtig homogeniseren de pellet in IBM2 mengen en roeren van bewegingen. Voeg nog 4,5 ml IBM2 aan het mengsel nadat de pellet volledig is gesuspendeerd.
    Opmerking: Vermijd overmatige wrijven terwijl het breken van grotere pellet stukken als thij kan de membranen beschadigen.
16. Draai de IBM2 / weefsel homogenaat bij 8000 xg gedurende 10 min bij 4 ° C.
    Opmerking: Deze stap kan worden herhaald in een schone hoge sterkte centrifugebuis voor meer nauwkeurige eiwit kwantificatie van geïsoleerde mitochondria in stap 4 sinds resterende BSA kunnen bijdragen aan de totale eiwitgehalte.
17. Verwijder de bovenstaande vloeistof en voorzichtig, maar volledig resuspendeer de pellet door het toevoegen van twee 25 ul stappen van IBM2 met een pipet tip met zijn punt afgesneden. Roer en meng de pellet na elke toevoeging van 25 pl IBM2. Plaats deze mitochondriale voorraad op ijs.

3. homogenisering van Whole Tissue Lysate (Tijd: ~ 45 min, kan worden uitgevoerd tijdens Stap 7)

1. Verwijder het spierweefsel dat de vloeibare stikstof werd gebracht bij stap 2,3 en incuberen bij kamertemperatuur geroerd tot het volledig ontdooid.
2. Hak het weefsel voor ~ 30 sec op ijs met fijne getipt schaar.
3. Voeg twee 100 ul bolletjes Zirconium Oxide Beads aan de 1,5 ml microcentrifugebuis met schroefdop uit stap 3.2 dat het gehakt weefsel bevat. Homogeniseer het weefsel in een parelmolen weefselhomogenisator met 2-3 5 min cycli bij een snelheid instelling van 4-6 (medium instelling).
4. Draai het mengsel van stap 3,3 bij 12.000 xg gedurende 10 min bij 4 ° C. Verwijder het supernatant met een pipet tip 1000 gl na de spin en overbrengen in een 1,5 ml microcentrifugebuis. Gooi de pellet en plaats de bovenstaande op het ijs.

4. Eiwit bepaling (Time: ~ 30 min)

1. Bepaal de eiwitconcentratie van het gehele weefsel lysaat (stap 3,4) en mitochondriale voorraad (stap 2,17) met de BCA Protein Assay Kit volgens specificaties van de fabrikant.

5. Mitochondriën Membraan Integriteit; Citraatsynthase (CS) activiteit (Tijd: ~ 15 min)

1. Maak twee afzonderlijke 1: 20 verdunningen van de mitochondriale voorraad in zuiver water. Toevoegen0,1% van de Triton 100-X een monster en ultrasone trillingen het op een lage stand (765 Watt, amplitude van 2). Laat de andere verdunning op het ijs. Terug het monster ijs na sonicatie.
2. Voer een citraat synthase test met zowel de niet-gesoniceerd en gesonificeerd mitochondriale verdunningen met behulp van een spectrofotometrische assay zoals eerder beschreven ^11,12.
3. Bepaal het percentage intact mitochondria membranen met behulp van de volgende vergelijkingen:
   (Non-gesoniceerde CS activiteit ÷ gesoniceerde CS activiteit) * 100

100- N (procent bereikt van boven)

6. Mitochondriën Isolatie Kwaliteit; Western Blotting (Tijd: Volgens protocol Lab)

1. Voer Western blotting op het gehele weefsel lysaat en geïsoleerde mitochondria zoals eerder ¹² beschreven.
   Opmerking: Gebruik primaire antilichamen voor GAPDH (1: 1000 verdunning in 5% BSA / TBS-T) en COXIV (1: 1000 verdunning in 5% vetvrijemelk / TBS-T), gevolgd door anti-geit, en konijn secundaire antilichamen, respectievelijk (1: 10.000).

7. Respirometrische Assay Run (Tijd: ~ 90 min)

1. Voeren gewenste respirometrische assays met microplaat _O 2 verbruik meettechniek zoals eerder beschreven (zie begeleidend artikel en Rogers et al ^8).
2. Bepaal de respiratoire controle ratio (RCR) door het delen van State 3 van State 4o (RCR) of State 3u te delen door de Staat 4o. Gebruik ofwel het midden (gemiddelde) punt, of de hoogste (staat 3) en de laagste tarieven (Staat 4o) van de point-to-point sporen bij het bepalen van RCR.

Resultaten

Citraat synthase activiteit dient als maat voor de membraanintegriteit aangezien citrate synthase is gelegen in het binnenste mitochondriale membraan, en dus moeten niet in suspensies van mitochondria met intacte membranen. Figuur 1 geeft citraat synthase activiteit in niet-gesonificeerde mitochondriale monsters tegenover gesoniceerd monsters van dezelfde isolatie. Sonicatie de mitochondria resulteert in een statistisch significante toename van citraat synthase activiteit (P <0,01). Belangrijk is 92,...

Discussie

De hierin gepresenteerde werkwijzen een gedetailleerde beschrijving van een mitochondriaal isolatieprocedure van geringe hoeveelheden (~ 75-100 mg) van muizen skeletspieren. Deze isolatie procedure is in staat om hoge functioneren, puur mitochondria (~ 450 ug) opleveren, zoals blijkt uit O ₂ consumptie prijzen, RCR waarden, maximale citraat synthase activiteit en eiwit expressie van immunoblotting. Belangrijk is, kan de mitochondriën geïsoleerd uit deze procedure gebruikt voor meerdere assays respirometirc me...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Essentially Fatty	Sigma Aldrich	A6003	N/A
Acid Free- BSA
Tris/HCl	Promega	H5123	N/A
KCL	Sigma Aldrich	P9541	N/A
Tris Base	Promega	H5135	N/A
EDTA	Sigma Aldrich	E6511	N/A
EGTA	Sigma Aldrich	E4378	N/A
Sucrose	Sigma Aldrich	S7903	N/A
D-Mannitol	Sigma Aldrich	63559	N/A
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red	Thermo Scientific	25200-056	N/A
Sodium Chloride White Crystals or Crystalline Powder ≥99.0 %	Fisher Scientific	BP3581	N/A
Sodium dodecyl sulfate	Sigma Aldrich	L3771	N/A
Sodium deoxycholate	Sigma Aldrich	D6750	N/A
Polyoxyethylene (12) nonylphenyl ether, branched	Sigma Aldrich	238651	N/A
Single Edge Razor Blades	Fisher Scientific	12-640	N/A
Falcon- 100 uM Nylon Cell Strainers	Fisher Scientific	352360	N/A
Halt Protease & Phosphatse Inhibitor Cocktail	Thermo Scientific	1861284	N/A
1.5 ml microcentrifuge tubes with screw cap	Thermo Scientific	3474	N/A
Zirconium Oxide beads	Fisher Scientific	C9012112	N/A
GAPDH antibody (1D4)	Santa Cruz Biotechnology	sc-59540	N/A
Anti- COXIV antibody	Cell Signaling	4844s	Any mitochondrial inner membrane protein will suffice
Peroxidase conjugated affinipure Donkey, Anti Rabbit IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearh	711-035-152	N/A
Peroxidase conjugated affinipure Goat, Anti Mouse IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearh	115-001-003	N/A
Triton-X100	Sigma Aldrich	X100	N/A
Pierce BCA Protein Assay Kit	Thermo Scientific	23225	N/A
Pyruvic Acid, 98%	Sigma Aldrich	107360	Store at 4 °C,pH to 7.4 with KOH prior to use in respirometric assay
Succinic Acid	Sigma Aldrich	S9512	Store at room temperature, pH to 7.4 with KOH prior to use in respirometric assay
L(-) Malic Acid, BioXtra, ≥95%	Sigma Aldrich	M6413	Store at room temperature, to 7.4 with KOH prior to use in respirometric assay
L-Glutamic acid	Sigma Aldrich	G1251	Store at room temperature, to 7.4 with KOH prior to use in respirometric assay, to 7.4 with KOH prior to use in respirometric assay
Palmitoyl L-carnitine chloride	Sigma Aldrich	P1645	Store at -20 °C
Oligomycin A, ≥ 95% (HPLC)	Sigma Aldrich	75351	Store at -20 °C
Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)	Sigma Aldrich	C2920	Store at 2-8 °C
phenylhydrazone
≥98% (TLC), powder [FCCP]
Antimycin A from streptomyces sp.	Sigma Aldrich	A8674	Store at -20 °C
Adenosine 5′-diphosphate monopotassium salt dehydrate [ADP]	Sigma Aldrich	A5285	Store at -20 °C, to 7.4 with KOH prior to use in respirometric assay
Rotenone	Sigma Aldrich	R8875	Store at room temperature