Dit manuscript beschrijft hoe herbicidemetabolismesnelheden effectief kunnen worden gekwantificeerd met uitgesneden bladeren van een tweezaadlobbig onkruid, waardoor variabiliteit wordt verminderd en alle mogelijke verstorende effecten van herbicideopname of -translocatie, die typisch worden waargenomen in hele-plantassays, worden geëlimineerd.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Meten tarieven herbicide Metabolisme in Dicot Onkruid met een weggesneden Leaf Assay
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Om de snelheid van herbicidemetabolisme in een obligate-uitkruisende tweezaadlobbige onkruid, waterhemp (Amaranthus tuberculatus), te isoleren en nauwkeurig te bepalen, ontwikkelden we een afgesneden bladtest in combinatie met een vegetatieve kloneringsstrategie om herbicide-opname te normaliseren en translocatie als bijdragende factoren te verwijderen in herbicideresistente (R) en -gevoelige (S) waterhemp-populaties. Biokinetische analyses van organische pesticiden in planten omvatten typisch de bepaling van opname, translocatie (levering aan de doelplaats), metabolisch lot en interacties met de doelplaats. Herbicidemetabolisme is een belangrijke parameter om te meten in herbicideresistente onkruiden en herbicidetolerante gewassen, en wordt meestal uitgevoerd met geheel-planttesten met radioactief gelabelde herbiciden. Echter, een moeilijkheid bij het interpreteren van biokinetische parameters afgeleid van geheel-plantmethoden is dat translocatie vaak wordt beïnvloed door snelheden van herbicidemetabolisme, omdat polaire metabolieten meestal niet mobiel zijn in de plant na herbicidedetoxificatiereacties. Voordelen van het protocol beschreven in dit manuscript omvatten reproduceerbare, nauwkeurige en snelle bepaling van herbicide-afbraaksnelheden in R en S populaties, een aanzienlijke vermindering van de hoeveelheid radioactief gelabelde herbiciden die wordt geconsumeerd, een grote vermindering van radioactief gelabelde plantmaterialen die verdere behandeling en verwijdering vereisen, en de mogelijkheid om radioactief gelabelde herbicide-experimenten in het lab of groeikamerraam uit te voeren in plaats van een kas. Aangezien herbicideresistentie zich blijft ontwikkelen en verspreiden in tweezaadlobbige onkruidpopulaties wereldwijd, zal de afgesneden bladtestmethode die hierin wordt ontwikkeld en beschreven, een onschatbare techniek bieden voor het onderzoeken van niet-doelplaatsgebaseerde resistentie als gevolg van verhoogde snelheden van herbicidemetabolisme en detoxificatie.
Inleiding
Herbicideresistentie in onkruid vormt een ernstige bedreiging voor de wereldwijde productie van voedsel en vezels 1,2. Momenteel duizenden van resistente bevolking en biotypen van meer dan honderd wiet soorten wereldwijd zijn gedocumenteerd en onderzocht 3. Een belangrijk mechanisme dat herbicide resistentie in planten is de verandering van herbicide doel- ter genen en eiwitten, met inbegrip van genetische mutaties die herbicide-eiwit binding kinetiek of amplificatie van het target-gen ter 2 beïnvloeden. Metabole ontgifting via de verhoogde activiteiten van cytochroom P450 monooxygenase (P450) of glutathion S-transferase (GST....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Plant Materiaal, Groei Voorwaarden en vegetatieve Klonen
Opmerking: Drie waterhemp populaties werden onderzocht in dit onderzoek: MCR (van McLean Provincie, IL), ACR (van Adams County, IL) en WCS (van Wayne County, IL) (tabel 1).
- Verzamelen en schorten waterhemp zaden in 0,1 g L -1 agar: water oplossing bij 4 ° C gedurende ten minste 30 dagen kieming te verbeteren. Opmerking: Sommige waterhemp populaties slapende, maar deze stap helpt om kiemrust overwinnen en zaad ontkiemt gelijkmatiger.
- Ontkiemen zaden van elke waterhemp populatie (zoals in tabel 1) bi....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Grote verschillen in snelheden van mesotrione metabolisme gedetecteerd tussen een WCS en ACR en MCR (figuur 1). Op elk tijdstip was MCR mesotrione sneller dan de twee mesotrione gevoelige populaties, WCS en ACR, correleert met eerdere hele plant fenotypische respons 11 gemetaboliseerd. Door klonen genoeg planten uit een enkele ouderplant van elke populatie, herbicide metabolisme tijdsverloop analyses uniform en reproduceerbaar door het ontbreken van de genetische variatie binnen elke tijdsver.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De uitgesneden blad hierin beschreven werkwijze is eerder gebruikt in onderzoeken primisulfuron metabolisme in maïs bladeren 15, maar onze resultaten tonen aan dat dit protocol ook doeltreffend, nauwkeurig en reproduceerbaar te meten herbicide metabolisme in een tweezaadlobbige onkruidsoorten 12. Een belangrijk voordeel van het uitgesneden blad techniek vergeleken met hele plant studies is dat een uitgesneden blad onafhankelijk is van de hele plant translocatie patronen postemergence, systemische h.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Wij danken Wendy Zhang, Austin Tom, Jacquie Janney, Erin Lemley en Brittany Janney voor hun hulp bij de plantengroei en extracties, Dr. Anatoli Lygin voor zijn hulp bij chromatografische analyses, en Syngenta Crop Protection voor de financiering.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Agar | Sigma-Aldrich | A1296 | voor het voorkiemen van zaden |
| Potgrond | Sun Gro Horticulture | 49040233 | voor plantengroei |
| Nutricote | Agrivert | TOTAL BLEND 13-13-13 T100 | langzaam vrijkomende meststof |
| Kweekkamer E15 | Controlled Environments Limited | 20207 | plantenkweek |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152-500 | buffer voor uitgesneden bladeren |
| HCl (geconcentreerd) | Fisher Scientific | A144500 | pH van buffer aanpassen |
| Murashige en Skoog (MS) zouten | Sigma-Aldrich | M0404 | incubatie van uitgesneden bladeren |
| Methanol | Fisher Scientific | A452-4 | bladwas na incubatie |
| Aceton | Sigma-Aldrich | 179124 | plantextracties |
| Acetonitril (HPLC-kwaliteit) | Macron Fine Chemicals | MKH07610 | HPLC mobiele fase |
| Forminezuur | Mallinckrodt Analytical | MK259205 | mobiele fase pH verzuren |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5417R | 1,5 of 2,0 ml buisjes |
| Centrifuge (temperatuurgestuurd) | Eppendorf | 5810R | 15 of 50 ml buisjes |
| Polypropyleen centrifugebuis | Corning Inc. | 430790 | 15 ml, steriel |
| Rotorverdamper | BÜCHI | R200 | concentreer plantenmonsters |
| Vloeistof scintillatie spectrometrie (LSS) | Packard Instruments | 104470 | kwantificeren 14C |
| Hogedruk vloeistof chromatografie | Perkin Elmer | N2910401 | oplossen herbicide metabolieten |
| Flow scintillatie analyzer | LabLogic System | 1103303 | voor HPLC analyse van 14C |
| Hypersil Gold C18 kolom | Thermo-Scientific | 03-050-522 | omgekeerde fase |
| Ultima-Flo M cocktail | Perkin Elmer | 6013579 | voor flow-scintillatie analyzer |
| Scintillatie Cocktail (ScintiVerse BD) | Fisher Scientific | SX18 | voor LSS; biologisch afbreekbaar |
| Laboratorium homogenisator | Kinematica | CH-6010 | homogeneer bladmonsters |
Referenties
- Yu, Q., Powles, S. Metabolism-based herbicide resistance and cross-resistance in crop weeds: A threat to herbicide sustainability and global crop production. Plant Physiology. 166, 1106-1118 (2014).
- Powles, S. B., Yu, Q.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
