Het vergelijken van de affiniteit van GTPase-bindende eiwitten met behulp competitiebepalingen

Summary

Dit protocol vergelijkt de relatieve affiniteiten van bindingspartners voor Rho-familie GTPases, inclusief Rac1. In vivo, concurreren Rac1-bindende eiwitten voor een enkele bindingsinterface, waarvan de conformatie wordt bepaald door een gebonden nucleotide. Het nucleotide is zowel belangrijk als moeilijk experimenteel te beheersen, vanwege de hoge hydrolysesnelheid.

Abstract

In dit protocol demonstreren we een methode voor het vergelijken van de concurrentie tussen GTPase-bindende eiwitten. Een dergelijke aanpak is belangrijk voor het bepalen van de bindingscapaciteiten van GTPases om twee redenen: het feit dat alle interacties dezelfde kant van de GTPases betreft, betekent dat bindingsgebeurtenissen moeten worden beschouwd in de context van concurrenten, en het feit dat het gebonden nucleotide ook moet worden gecontroleerd, betekent dat conventionele benaderingen zoals immunoprecipitatie ongeschikt zijn voor GTPase-biochemie. De test is gebaseerd op het gebruik van gezuiverde eiwitten. Gezuiverd Rac1 geïmmobiliseerd op kralen wordt gebruikt als de lokkeiwit en kan worden geladen met GDP, een niet-hydrolyseerbare versie van GTP of nucleotidevrij worden gelaten, zodat de te onderzoeken signaalfase kan worden gecontroleerd. De te onderzoeken bindingseiwitten worden gezuiverd uit zoogdiercellen, om correcte vouwing mogelijk te maken, door middel van een GFP-tag. Het gebruik van dezelfde tag op beide eiwitten is belangrijk omdat het niet alleen een snelle zuivering en elutie mogelijk maakt, maar ook detectie van beide concurrenten met hetzelfde antilichaam tijdens de elutie mogelijk maakt. Dit betekent dat de relatieve hoeveelheden van de twee gebonden eiwitten nauwkeurig kunnen worden bepaald.

Introduction

Het actinocytoskelet dat de vorm, polariteit en migratie-eigenschappen van zoogdiercellen bepaalt, wordt gereguleerd door de Rho-familie van kleine GTPases. De Rho-familie GTPases omvat RhoA dat cytoskeletcontractie stimuleert, Rac1 dat actinetakvorming en membraanuitsteeksel stimuleert, en Cdc42 dat vergelijkbare effecten heeft op actinpolymerisatie als Rac1 en de vorming van filopodia veroorzaakt ^1,2. GTPase-signaleringsactiviteit wordt bepaald door binding van een nucleotide, dat de contractie en ontspanning van de switch I- en switch II-lussen regelt die de eiwit-eiwitinteracties met zowel regulatoren als effectoren mediëren. Guanosine 5’-trifosfaat (GTP)-gebonden GTPases activeren downstream effectoren, terwijl de Guanosine 5’-difosfaat (GDP)-gebonden vorm inactief is. In de cel maken cycli van GTP-hydrolyse en nucleotide-uitwisseling een snelle omzet van GTPase-signalen mogelijk die noodzakelijk zijn voor cytoskeletaaldynamiek. Nucleotide-omzet wordt gereguleerd door drie mechanismen. Guanine nucleotide-uitwisselingsfactoren (GEFs) stabiliseren de nucleotide-vrije GTPase, katalyseren de uitwisseling van GDP voor GTP en stimuleren daarmee de GTPase-signaleringsactiviteit ^3,4. GTPase-activerende eiwitten (GAPs) katalyseren de hydrolyse van GTP tot GDP, waardoor de GTPase-signaleringsactiviteit wordt geïnhibeerd ⁵. Sequestrerende moleculen zoals regulator van chromatincondensatie 2 (RCC2) en guanine nucleotide-dissociatie-remmers (GDIs) verduisteren de switch-lussen en in het geval van GDIs verwijderen ze de GTPase van het membraan door interactie met de prenyelstaart ^6,7. Elke van de drie klassen van regulatorische moleculen interageert met de switch-lussen, net als de downstream effectoren en sommige verkeersregelaars zoals coronin-1C ⁷. Het doel van dit protocol is om de concurrentie voor de switch I/II-bindplaats tussen veronderstelde regulatoren en downstream-signaalmoleculen te meten. Er moet worden opgemerkt dat concurrentie-assays testen op binding aan een gedeelde bindingsplaats, zodat dit protocol niet geschikt is voor het testen van interacties met andere plaatsen, zoals binding van GDIs aan de prenyelstaart.

De subtiliteit van de conformatieverschillen tussen actieve en inactieve vormen, in combinatie met de onstabiele aard van het gebonden nucleotide, heeft het bestuderen van GTPase-bindgebeurtenissen moeilijk gemaakt. De rol van het gebonden nucleotide betekent dat conventionele bindingsassays zoals immunoprecipitatie of surface plasmon resonantie niet goed geschikt zijn voor onderzoek, omdat het nucleotide niet kan worden gecontroleerd. Dit obstakel wordt versterkt door de overlapping in de bindingsplaatsen van GEFs, GAPs, effectoren, sequestrerende moleculen en verkeersregelaars, waardoor bindingsgegevens voor een enkele interactie moeilijk te interpreteren zijn in de context van de concurrentie die in de cel zal plaatsvinden. Immunoprecipitatie, in het bijzonder, wordt benadeeld door concurrentie tussen bindingspartners, aangezien onder bepaalde cellulaire omstandigheden één bindingspartner kan worden geïdentificeerd ten koste van alle anderen, terwijl onder andere omstandigheden een andere partner kan domineren. De dynamische aard van GTPase-signalering is essentieel voor GTPase-functie en moet worden overwogen bij het analyseren van de relaties tussen de bindingsinteracties van verschillende regulatoren. Inderdaad hebben we onlangs een pad beschreven dat zwaar afhankelijk was van competitieve binding. We identificeerden coronin-1C als een verkeersmolecuul dat zich aan de switch-lussen van GDP-Rac1 ⁷bond. In gebieden met lage GEF-activiteit zou het verkeer domineren en Rac1 uit die regio's verwijderen. Echter, wanneer Rac1 wordt geleverd aan regio's van de cel waar de GEF-activiteit hoog is, zou de GEF coronin-1C kunnen overstemmen, waardoor Rac1 zowel wordt geactiveerd en coronin-1C-gemedieerde verwijdering van Rac1 uit dat gebied wordt voorkomen. Het model gaat verder, omdat de actie van de GEF het gebonden GDP voor GTP verwisselt, waardoor het evenwicht nog verder van coronin-1C wordt verschoven. Bijgevolg kan de Rac1-activiteit volledig worden verklaard in termen van concurrentie en relatieve affiniteit.

In dit protocol beschrijven we een methode voor het vergelijken van de relatieve affiniteiten van verschillende bindingspartners voor kleine GTPases, met behulp van Rac1 als voorbeeld. Door een gezuiverde eiwitbenadering te gebruiken, is het mogelijk om een keten van signaalgebeurtenissen samen te stellen door middel van paarsgewijze vergelijking, in een experiment waarbij het gebonden nucleotide nauw kan worden gecontroleerd.

Protocol

1. Zuivering van GST-gelabeld GTPase

1. Cultuur een E. coli-stam zoals BL21 getransformeerd met pGEX-Rac1 O / N bij 37 ° C, onder schudden bij 220 rpm in 500 ml autoinductie medium (25 mM Na ₂ HPO _4, 25 mM KH _{2PO 4,} 50 mM _NH4Cl, 5 mM Na ₂ SO _4, 2 mM MgSO _4, 2 mM _CaCl2, 0,5% glycerol, 0,05% glucose, 0,2% lactose, 5 g trypton, 2,5 g gistextract, 100 ug / ml ampicilline).
2. Harvest bacteriën door centrifugeren gedurende 10 min bij 10.000 xg, 4 ° C.
3. Resuspendeer bacteriële pellet in 20 ml eiwit extractie reagens, 1x proteaseremmer en incubeer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur met omkering.
4. Verduidelijken het lysaat door centrifugatie bij 40.000 xg gedurende 30 min.
5. Voeg 2 ml glutathion magnetische korrels, gewassen met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS: 10 mM Na ₂ HPO _4, 1,8 mM KH _{2PO 4,} 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl).
6. Incubeer 2 uur mengen door omkeren bij 4 ° C.
7. Was-eiwit beladen korrels vier keer met 10 ml PBS, met behulp van een magnetisch deeltje sorter aan de korrels bij elke stap precipiteren.
8. Resuspendeer proteïne-beladen kralen in 2 ml PBS en bewaar bij -80 ° C in 100 gl aliquots tot gebruik.

2. Expressie van GTPase-bindende eiwitten

1. De dag voor het experiment, transfectie van plasmiden coderend voor groen fluorescent eiwit (GFP) gemerkte versies van elk GTPase-bindend eiwit in een afzonderlijke ^75-cm2 kolf van HEK293T als volgt. Voor de validatie van nucleotide laden, transfecteren GFP-gelabeld TrioD1 in een derde 75-cm ² kolf van HEK293T.
   1. Verdun polyethylamine tot 1 mg / ml in 100 pl steriel 150 mM NaCl.
   2. Voeg 27 ul verdund polyethylamine tot 223 ui verminderd serum media.
   3. Voeg 12 ug plasmide-DNA met 250 ul gereduceerd serum medium.
   4. Incubeer elke buis gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur.
   5. Combineer de polyethylamine en DNA mengt in een enkele buis en vortex gedurende 2 min.
   6. Incubeer 15-20 minuten bij kamertemperatuur.
   7. Vervang het groeimedium (Dulbecco's Modified Eagle Media, 10% foetaal runderserum, 2 mM L-glutamine, zonder antibiotica) met 90% confluent HEK293T met 5 ml vers kweekmedium.
   8. Voeg de gecombineerde polyethylamine / DNA mengsel aan de kolf en geïncubeerd O / N bij 37 ° C, 5% _CO2.

3. Zuivering van GTPase-bindingseiwitten

1. Spoel kolven van getransfecteerde cellen in PBS en afvoer kolf gedurende 5 min, aspireren van vrije vloeistof.
2. Schraap cellen in 500 pi lysisbuffer (50 mM Tris-HCl (pH 7,8), 1% Nonidet P-40, 1x proteaseremmer) in microcentrifugebuis.
3. Lyse cellen door mengen door omkeren bij 4 ° C gedurende 30 min.
4. Tijdens lysis wassen twee partijen 40 pl GFP-Trap parels driemaal met verse lysisbuffer, sedimenteren kralen aan 2700 xg gedurende 2 min tussen wasbeurten.
5. Verduidelijken lysaten door centrifugatie bij 21.000 xg gedurende 10 min.
6. Overdracht geklaarde lysaat van elke deelnemer eiwitten gewassen GFP-trap parels gescheiden en laten GFP-fusie-eiwitten te binden voor 2 uur mengen door omkeren bij 4 ° C. Houd lysaat van GFP-TrioD1 cellen op ijs.
7. Wassen geladen GFP-Trap kralen tweemaal in 50 mM Tris-HCl (pH 7,8), 50 mM NaCl, 0,7% (w / v) Nonidet P-40 en tweemaal in 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 20 mM _MgCl2 , sedimenteren kralen aan 2700 xg gedurende 2 min tussen de wassingen.
8. Elueer GFP-fusie-eiwitten door toevoeging van 40 pi 0,2 M glycine (pH 2,5) en op en neer pipetteren van 30 sec. Onmiddellijk sediment korrels bij 21.000 xg gedurende 60 s en overdrachtvloeistof een nieuwe microcentrifugebuis bevattende 4 pi 1 M Tris-HCl (pH 10,4). Doe dit snel tot beschadiging van het gezuiverde eiwit te beperken.
9. Analyseer 1 pi van elke gezuiverde eiwit door Western blot en probe met een anti-GFP antilichaam relatieve rendement stellen via een kwantitatief blotting volgens het protocol van de fabrikant. Alternatief bepalen eiwitconcentraties van bicinchoninezuur (BCA) assay maar dit introduceert fouten als de eiwitten reageren niet met de assay op een identieke wijze of er verontreinigende eiwitten.
10. Equalize molaire eiwitconcentratie door de toevoeging van 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 20 mM _MgCl2.

4. Nucleotide laden van GTPase

1. Dooi een hoeveelheid van GST-Rac1 magnetische korrels, bereid in stap 1.
2. Neem 90 pi GST-Rac1 kralen en was driemaal met 20 mM Tris-HCl (pH 7,6), 25 mM NaCl, 0,1 mM DTT, 4 mM EDTA, met een magnetische deeltjes sorter aan de korrels bij elke stap precipiteren.
3. Aspireren buffer kralen en voeg 100 ul 20 mM Tris-HCl (pH 7,6), 25 mM NaCl, 0,1 mM DTT, 4 mM EDTA.
4. Naargelang BBP, GTP of geen nucleotide lading is vereist voor het vergelijkend experiment, voeg 12 ul 100 mM BBP, 12 gl 10 mM guanosine 5 '- [γ-thio] trifosfaat (GTPyS) of geen nucleotide 60 gl GST-Rac1 kralen.
5. Voor de nucleotide-loading controles splitsing van de resterende kralen in drie 10-ul monsters en voeg 2 pl 100 mM BBP, 2 pl 10 mM GTPyS of geen nucleotide aan elke buis.
6. Incubeer bead mixen voor 30 min bij 30 ° C onder roeren.
7. Stabiliseer-nucleotide gebonden Rac1 door toevoeging van 1 M MgCl _2: 3 pi de experimentele mix (stap 4,4), 0,5 pi aan elk controlepunt mengsels (stap 4,5).

5. Mededinging bindend.

1. Opgezet 6 microfugebuizen buizen, elk met:
   200 pl 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 20 mM _MgCl2
   10 ul experimenteel-nucleotide beladen Rac1 kralen (van stap 4.7)
   5 gl Rac1-bindend eiwit A (constant bindingseiwit)
2. Aan elke buis, voeg 0, 1, 2,5, 5, 10 of 20 gl-Rac1 bindende eiwit B (variabele bindend eiwit). Deze volumes veronderstellen eenpproximately gelijke stock concentraties van de constante en variabele bindingseiwitten en moet mogelijk worden aangepast.
   1. Pas volumes bindende eiwitten A en B als er grote verschillen in de bindingsaffiniteiten van de twee eiwitten en dit moet empirisch worden bepaald door experimentele herhalingen. Vul het totale volume van het mengsel binding aan 235 pl door toevoeging van 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 20 mM _MgCl2.
3. Het opzetten van een microfugebuis bevat:
   200 pl 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 20 mM _MgCl2
   10 ul experimenteel-nucleotide beladen Rac1 kralen (van stap 4.7)
   10 gl Rac1-bindend eiwit A (constant bindingseiwit)
4. Het opzetten van het BBP, GTPyS en geen nucleotide controle buizen:
   200 pl 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 20 mM _MgCl2
   10 ul controle Rac1 kralen in stap 4.5 met het BBP, GTPyS of geen nucleotide geladen en gestabiliseerd in stap 4.7.
   180 pi HEK293T GFP-TrioD1 lysaat, bereid als in stap 3,6
   4 gl 1 M _MgCl2
5. Incubeer het mengsel gedurende 2 uur mengen door omkeren bij 4 ° C.
6. Was de parels driemaal met 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 20 mM _MgCl2.
7. Elueer eiwitten in 20 gl verminderen monsterbuffer (50 mM Tris-HCl (pH 7), 5% SDS, 20% glycerol, 0,02 mg / ml broomfenolblauw, 5% β-mercaptoethanol).

6. Analyse van de concurrentie

1. Los 10 ul van het gebonden eiwit (stap 5,6) van natriumdodecylsulfaat-polyacrylamidegelelektroforese (SDS-PAGE) en Western blot.
2. Incubeer het membraan bij 4 ° CO / N anti-GFP antilichaam verdund 1/1000 in de blokkeerbuffer verdund tot 1x in PBS, 0,1% Tween-20 voor beide gelabelde GTPase-bindende eiwitten te detecteren.
3. Was het membraan drie keer gedurende 10 min met PBS, 0,1% Tween-20.
4. Incubeer het membraan gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur in DyLight 800-geconjugeerd anti-konijn secmiddelbaar antilichaam, verdund 1 / 10.000 in blockingbuffer verdund tot 1x in PBS, 0,1% Tween-20.
5. Was het membraan drie keer gedurende 10 min met PBS, 0,1% Tween-20.
6. Scan het membraan met behulp van een infrarood beeldvormingssysteem via de software bandintensiteit meten volgens het protocol van de fabrikant.
7. Plot van de band intensiteit van elk eiwit tegen volume van de variabele concurrent (Protein B).
8. Verdeel het volume van variabele deelnemer op het punt waar de lijnen elkaar snijden door het volume constant concurrent (Proteïne A, 5 ui) aan de deelnemer welke verhouding evenwicht wordt bereikt bepalen.
9. Voor validatie van nucleotide-beladingsstatus, probe membranen voor p21-geactiveerd kinase 1 (PAK1) (een effector) en GFP-TrioD1 (a GEF), zoals beschreven in stappen 6,1-6,6.

Results

Dit protocol is bedoeld om de relatieve affiniteiten van bindingspartners voor Rac1 berekenen zonder de exacte concentratie van de concurrenten kennen (Figuur 1). Bepaling van de eiwitconcentratie en introduceert fouten bij het overwegen concurrentie tussen moleculen in een signaleringsroute is niet noodzakelijk. Het is echter belangrijk te weten dat de twee concurrenten dezelfde molaire concentratie van de voorraadoplossingen om eenvoudige verhoudingen worden berekend bij het toevoegen van verschillende hoeveelheden tot de assay. 40 pl GFP-Trap kralen hebben een bindingscapaciteit van ~ 300 pmol dus confluente 75 ^cm2 kolven sterk tot expressie brengende cellen zullen verzadigen de korrels, waardoor de voorbereiding van de twee verschillende bindingseiwitten vergelijkbaar voor correctie wordt (figuur 2A). Als één van de eiwitten tot expressie slecht, kan dit probleem worden ondervangen door het zuiveren van eiwitten die uit meer dan één kolf cellen.

De binding van de meeste GTPase effectoren en regulatoren afhankelijk van de nucleotide laden van het aas GTPase, dus is het belangrijk om te testen of het laden succesvol is geweest. Laden kan worden geverifieerd door neerslaan bekend bindende eiwitten uit cellysaten. Effector eiwitten zoals PAK1 binden aan GTP-Rac1 en kan gemakkelijk worden geprecipiteerd uit lysaten en gedetecteerd door Western blotting ⁸ (figuur 2B). GEFs voorkeur binden aan nucleotide-vrij GTPase de overgangstoestand te stabiliseren. Als GEFs zijn van lage overvloed, meestal inactief en vaak vlek slecht, het is beter om een ​​GEF of GEF fragment te testen-nucleotide vrij GTPase overexpressie. We gebruiken vaak het eerste Dbl homologie van Trio, uitgedrukt GFP-fusie (GFP-TrioD1 ⁹⁾ (figuur 2B), maar elke GEF zou werken. Eiwitten die zich binden aan de BBP geladen GTPase zijn zeldzamer. We hebben onlangs gemeld RCC2 als een dergelijk eiwit ⁷ of bbp-laden kan eenvoudig worden gevalideerd als Binding noch GEF noch effector.

De uitvoer van het experiment een Western blot die de twee GFP-gelabeld bindingspartners gebonden aan de GTPase zijn. Door een antilichaam tegen beide eiwitten te detecteren, kunnen de concentraties waarbij gelijke hoeveelheden van beide deelnemers binden worden bepaald en daarmee de relatieve affiniteiten afgeleid. In dit voorbeeld competitie tussen de propeller domein van de Rac1-eiwit trafficking, coronin-1C (Rac1-bindend proteïne A) en de Rac1-sequesterende eiwit RCC2 (Rac1-bindend eiwit B), is aangetoond (figuur 3A). Door het gebruik van een constant volume van coronin-1C propeller (5 pi) en toenemende hoeveelheden RCC2 toe te voegen, kunnen we zien aan de GFP uitwissen dat evenwicht wordt bereikt bij 1,25-2,5 ul RCC2 (asterisk), waaruit blijkt dat RCC2 heeft een sterkere affiniteit voor Rac1 dan coronin-1C. Door het meten van de intensiteit van de banden met behulp van kwantitatieve Western blotting en plotten gemiddelde waarden voor elke competitor, kan het evenwichtspunt nauwkeurig worden berekend door de volumes waarbij de curves snijden (figuur 3B) identificeren.

Een van de mogelijke obstakels voor succesvolle competitie assay is als de bindingspartners aan elkaar binden en binding aan Rac1. In figuur 3A + B tonen we concurrentie tussen RCC2 en de propeller domein van coronin-1C, in plaats full-length coronin-1C. De reden om het afgeknotte coronin dat coronin-1C bindt ook RCC2 via staartdomein. Wanneer full-length coronin-1C is getitreerd tegen RCC2, binding van beide eiwitten wordt gedetecteerd, als gevolg van ternair complex vorming, in plaats van de concurrentie (Figuur 3C). Als de concurrentie plaatsvindt, het binden van een eiwit zal toenemen, terwijl de andere afneemt, en de totale gebonden GFP-fusie zal constant blijven. In gevallen waarin een ternair complex vormt moet een van de GTPase-eiwit afkappen zodat de competsatoren niet meer communiceren.

Figuur 1. Workflow. Schematische weergave van de workflow voor het bepalen van de affiniteit van GTPase-bindende eiwitten met behulp van concurrentie assays. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2. Validatie van gezuiverde eiwitten. (A) Gezuiverd-GFP-gelabeld Rac1 bindende eiwitten op Western blot geanalyseerd, probing met anti-GFP om de relatieve opbrengst van beide eiwitten te bepalen. Dit type egalisatie tijdens het experiment maakt de concentratie van de twee eiwitten worden aangepast zodat ze overeenkomen met het bindingsexperiment. (B) GDP, GTPyS en no-nucleotide geladen GST-Rac1 werd geïncubeerd met lysaat van HEK293T die GFP-TrioD1 en gebonden gedetecteerd door het plotten van endogene PAK1 of overexpressie GFP-TrioD1 eiwitten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3 Western blot-analyse van relatieve eiwitbinding. Voorbeeld output van competitie-bindingstesten. (A) BBP geladen Rac1 werd gemengd met 5 pl GFP-coronin 1C-propeller domein en toenemende GFP-RCC2 werden getitreerd. Door Western blotting eiwitten voor GFP, problemen met differentiële detectie van de twee eiwitten worden vermeden en het GFP-signaal rapporteert de molaire verhouding tussen de twee fusie-eiwitten. Sterretjes geven de verhoudingen concurrentie op either zijde van het evenwichtspunt. (B) bandintensiteiten gebonden GFP fusie-eiwitten van drie onafhankelijke experimenten werden gemeten door kwantitatieve Western blotting met behulp fluorofoor geconjugeerde secundaire antilichamen en gemiddelden uitgezet om de hoeveelheid RCC2 te berekenen die nodig zijn om evenwicht te bereiken. (C ) Voorbeeld output van een experiment waarbij Rac1-bindende eiwitten binden aan elkaar en vormen een ternair complex dan concurrerende. BBP geladen Rac1 werd gemengd met 5 ui GFP-RCC2 en toenemende volumes van GFP-coronin-1C volledige lengte werden getitreerd in. De toename in gebonden GFP-coronin-1C zonder verlies van gebonden GFP-RCC2 geeft ternair complex formatie. Gelieve klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussion

Dit protocol beschrijft een methode voor het vergelijken van de relatieve affiniteiten van paren van kleine GTPase-bindende eiwitten. De belangrijkste stappen zijn de bereiding van gezuiverde GTPase-bindende eiwitten en het nucleotide laden van de GTPase. Het gebruik van GTPase-bindende eiwitten met dezelfde GFP-tag, maakt het mogelijk om de concentraties waarbij vergelijkbare hoeveelheden van elke concurrent binden nauwkeurig te bepalen. Het gebruik van recombinante nucleotide-geladen GTPase maakt het mogelijk om de bindingseigenschappen van de GTPase onder specifieke activiteitscondities te onderzoeken. Deze stap is ook het meest gevoelig omdat nucleotiden zowel hydrolyseren als loslaten van de GTPase als de magnesiumcondities niet precies worden gehandhaafd.

In de cel maakt het grote aantal GTPase-bindende eiwitten in combinatie met de snelle nucleotide omzet dat dergelijke routes moeilijk te interpreteren zijn. De eenvoud van deze methode om alleen paren bindingseiwitten te vergelijken en zorgvuldig gecontroleerde nucleotide-ladingscondities te gebruiken, maakt het mogelijk om signaalroutes te verduidelijken. De grootste sterkte van het protocol is echter ook de grootste zwakte, omdat het een vereenvoudiging van de in vivo situatie is. Competitiesassays kunnen worden gebruikt om een robuuste hypothese op te bouwen, maar deze moet vervolgens in cellen worden getest door knockdown-experimenten.

Er zijn drie kenmerken waarmee rekening moet worden gehouden bij het selecteren van de GFP-getaggede GTPase-bindende eiwitten die in het experiment worden gebruikt. Ten eerste moeten de fusie-eiwitten goed in zoogdiercellen worden geëxpresseerd, zoals HEK293T, aangezien competitie-assays een redelijke hoeveelheid eiwit vereisen. Ten tweede moet het mogelijk zijn om het recombinante eiwit te zuiveren zonder significante afbraak, en waar dit niet mogelijk is, moet kloning van een GTPase-bindend fragment worden overwogen. Ten derde moeten de twee GTPase-bindende eiwitten van elkaar kunnen worden onderscheiden op SDS-PAGE om analyse in sectie 6 mogelijk te maken.

Er zijn een aantal potentiële valkuilen van het experiment waarmee rekening moet worden gehouden, en mogelijk moeten worden aangepakt:

Mogelijke denaturatie van gezuiverde GTPase-bindende eiwitten tijdens de zure elutiestap of sterische hindering door de GFP-tag. In onze handen zijn deze geen probleem geweest, maar moeten ze worden getest. De gezuiverde eiwitten kunnen worden getest in functionele assays ¹⁰. Er bestaan nu commerciële kits voor het testen van de activiteit van GEFs of GAPs zonder de noodzaak van isotoopgelabelde nucleotiden. Sequestreringseiwitten, door hun aard beschermen GTPases tegen GEF- of GAP-activiteit, dus kunnen worden gebruikt als competitieve remmers in de commerciële GEF- of GAP-assays, zoals we deden in onze recente publicatie ⁷. Het relevante kenmerk van eiwitten die GTPase verkeer verwerken, is het vermogen om de GTPase te binden, en dit kan gemakkelijk worden getest in een pull down-assay. Een alternatieve benadering voor het testen van de integriteit van eiwitten die op alle bindingseiwitten van toepassing is, is om eiwit geeludeerd van GFP-trapkralen met glycine te titraten met hetzelfde eiwit verwijderd uit GFP-trapkralen door enzymatische splitsing. Het experiment zou worden geanalyseerd door zowel het GFP-gelabelde als het gekloven eiwit te sonderen met een antilichaam tegen het eiwit zelf. Als het eiwit niet is beschadigd door elutie, zou er een evenwicht moeten worden bereikt bij een 1:1-verhouding. Deze aanpak zou ook aangeven of de aanwezigheid van de GFP-tag zelf de bindingseigenschappen van het kandidaat-eiwit aantast, hoewel dit wel vereist dat er een construct wordt geproduceerd met een enzymatische splitsingsplaats tussen de tag en het bindende eiwit. Of het eiwit wordt aangetast door de tag of de elutiestap, het probleem zou kunnen worden aangepakt door het protocol aan te passen om een alternatieve zuiveringsmethode te gebruiken. In plaats van GFP kunnen bindingseiwitten His-getagd worden, gezuiverd met behulp van Ni-NTA en geanalyseerd met behulp van een antilichaam tegen de His-tag. Het belangrijke kenmerk is dat beide bindingseiwitten een gemeenschappelijke tag moeten delen, hoewel, indien nodig, twee tags aan een eiwit kunnen worden toegevoegd, één voor zuivering en de andere voor detectie.

Het protocol is ontworpen om concurrentie te onderzoeken tussen interacties met de switch I/II-domeinen. Hoewel de meeste GTPase-interacties worden gemedieerde door dit motief, zijn er enkele uitzonderingen, met name de interacties van GDI's die zich aan de prenylstaart binden, evenals het verduisteren van de switch-domeinen. In principe zou het protocol kunnen worden aangepast om GTPase te gebruiken die is gezuiverd uit zoogdiercellen, zodat de GTPase prenyleerd is, maar de aanwezigheid van meerdere bindingsplaatsen of allosterische effecten bemoeilijkt de interpretatie van concurrentie-bindingsgegevens. Verdere problemen geassocieerd met een dergelijke wijziging zijn dat GDI's co-zuiveren met GTPase uit zoogdiercellen, waardoor de zuiverheid van de geïsoleerde eiwitten wordt aangetast en de hydrofobe aard van de prenylgroepen betekent dat prenyleerd GTPases geassocieerd zijn met GDI of lipidemembraan en dergelijke factoren zouden in het experiment moeten worden overwogen.

De hoeveelheid GST-Rac1 die in de assay wordt gebruikt. Het constante GTPase-bindende eiwit moet in een hogere concentratie zijn dan de Rac1, of wanneer de concurrent wordt toegevoegd, zal het zich eenvoudigweg aan het vrije Rac1 binden. Het zal onmiddellijk duidelijk zijn als dit is gebeurd, omdat binding van de concurrent, zonder verlies van het constante eiwit, op vrijwel dezelfde manier zal worden gedetecteerd als wanneer de twee concurrerende eiwitten aan elkaar binden zoals getoond in Figuur 3B. Als aanvullende controle (Stap 5.3) moet een bindingsreactie met tweemaal de hoeveelheid constante bindingseiwit en geen variabel bindingseiwit worden opgenomen (Stap 5.3). Als de Rac1 in het titratie-experiment verzadigd is, zal verdubbeling van de

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bugbuster	Novagen	70584-3
COMPLETE protease inhibitor	Roche	05 056 489 001
Glutathione magnetische kralen	Pierce	88821
Polyethyleenimine, vertakt, gemiddelde Mw ~25.000	Sigma Aldrich	408727-100ML
OPIMEM	Life Technologies	31985-047
Dulbecco's Modified Eagle Media	Sigma Aldrich	D5796
Fetaal bovien serum	Life Technologies	10270-1-6
L-Glutamine	Life Technologies	25030-024
GFP-Trap_A	Chromotec	gta-20
GDP	Sigma Aldrich	G7127	Zeer onstabiel. Direct na reconstitutie in aliquots verdelen en bij -80 opbergen
GTPγS	Sigma Aldrich	G8634	Zeer onstabiel. Direct na reconstitutie in aliquots verdelen en bij -80 opbergen
Blocking Buffer	Sigma Aldrich	B6429
Tween-20	Sigma Aldrich	P9416
Anti-GFP antilichaam	Living Colors	632592	Gebruik in een 1/1000 verdunning
DyLight 800 geconjugeerd geiten-anti-konijn secundair antilichaam	Fisher Scientific	10733944
Anti-PAK1 antilichaam	Cell Signaling	2602S	Gebruik in een 1/1000 verdunning
Odyssey SA Infrared Imaging System	Li-cor	9260-11PC