Dit videoprotocol beschrijft een gevoelige, betrouwbare en snelle methode voor het evalueren van de neuromusculaire tekorten in een transgene muismodel van amyotrofische laterale sclerose.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Een Quick Fenotypische Neurologische Scoring System voor het evalueren van ziekteprogressie bij de SOD1-G93A muismodel van ALS
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
De SOD1-G93A transgene muis is het meest gebruikte diermodel van amyotrofische laterale sclerose (ALS). Bij ALS TDI hebben we een fenotypisch screeningsprotocol ontwikkeld, hierin getoond in video, dat op betrouwbare wijze de neuromusculaire functie van SOD1-G93A muizen op een snelle manier beoordeelt. Dit protocol omvat een eenvoudig neurologisch scoresysteem (NeuroScore) ontworpen om de hindlimbfunctie te beoordelen. NeuroScore is gericht op de hindlimbfunctie omdat hindlimbdeficiënties het vroegst gerapporteerde neurologische teken van ziekte zijn bij SOD1-G93A muizen. Het protocol ontwikkeld door ALS TDI biedt een onbevooroordeelde beoordeling van het begin van parese (lichte of gedeeltelijke verlamming), progressie en ernst van verlamming en het is gevoelig genoeg om geneesmiddelgeïnduceerde veranderingen in ziekteprogressie te identificeren. In dit rapport minimaliseert de combinatie van een gedetailleerd manuscript met video scoreduideligheden en variatie tussen experimenten, waardoor het protocol kan worden overgenomen door andere laboratoria en vergelijkingen mogelijk worden tussen studies die op verschillende locaties plaatsvinden. We geloven dat dit videoprotocol kan dienen als een uitstekend trainingsinstrument voor huidige en toekomstige ALS-onderzoekers.
Inleiding
Sinds de ontwikkeling in het midden 1990 van het SOD1 G93A-transgeen muismodel is de meest gebruikte diermodel van amyotrofe laterale sclerose (ALS) 1. Dit transgeen muismodel werd genetisch gemanipuleerd om een gemuteerde vorm van de humane Cu / Zn superoxide dismutase 1 (SOD1) gen herbergt de ALS geassocieerde glycine alanine mutatie op aminozuur 93 (G93A) tot overexpressie. De G93A mutatie is één van vele mutaties in het SOD1 gen die samen samenstelling ongeveer 1 5 van familiale ALS gevallen 2.
De SOD1-G93A model is een werkpaard van ALS geneesmiddelontwikkeling onderzoek, omdat naast de duidelijke genetische link ALS het recapituleert vele pathologische kenmerken van ALS bij de mens als motor neuron verlies, progressieve spierzwakte en atrofie, met eventuele verlamming en dood 3. Hoewel, zoals vaak het geval is bij transgene diermodellen, is er een inherente biological variabiliteit geassocieerd met SOD1-G93A muizen. Scott et al. hebben vastgesteld dat cohorten van tenminste 24-nest aangepaste genderevenwichtige muizen nodig in drug efficacy studieontwerpen om het geluid gemaakt door de biologische variabiliteit 4 overwinnen. Het grote aantal benodigde dieren in deze studies in combinatie met agressieve progressie van de ziekte en de behoefte aan dagelijkse controle verbiedt het gebruik van ingewikkelde, tijdrovende en mogelijk belastend technieken voor het meten neuromusculaire sterkte en functie (bijvoorbeeld, elektromyografie grijpkracht, rotorod , etc.). In plaats daarvan wijst hij op de noodzaak van een in-vivo-screening tool die betrouwbaar beoordeelt de neuromusculaire functie van SOD1-G93A muizen op een snelle manier.
Bij ALS TDI werd een protocol ontwikkeld dat zorgt voor een betrouwbare beoordeling van de neuromusculaire functie van SOD1-G93A muizen in minder dan 30 seconden per muis op het gemiddelde. Dit protocol encompasses dagelijkse evaluatie van achterbeen functie met behulp van een eenvoudig neurologisch scoresysteem (NeuroScore), die wordt beschreven in dit rapport in de pers en in de video. NeuroScore is gericht op het achterbeen functie omdat achterbeen tekorten zijn de vroegste gerapporteerde neurologische tekenen van de ziekte in SOD1-G93A muizen 5,6. Verder, het protocol ontwikkeld door ALS TDI levert een onpartijdige beoordeling van de aanvang van de parese (lichte of gedeeltelijke verlamming), progressie en de ernst van de verlamming en het is gevoelig genoeg om drugs veroorzaakte veranderingen in de progressie van de ziekte te identificeren.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle experimenten worden uitgevoerd in overeenstemming met de door de National Institutes of Health Guide voor de zorg en het gebruik van dieren protocollen en werden goedgekeurd door de ALS TDI's institutionele dierlijke zorg en gebruik Comite (IACUC).
1. Dieren, Huisvesting en Studieopzet
Opmerking: De SOD1-G93A muis kolonie werd afgeleid van de hoge kopie B6SJLTgN (SOD1G93A) 1Gur stam oorspronkelijk geproduceerd door Gurney et al. 7. De kolonie wordt momenteel onderhouden door het kruisen van transgene C57BL / 6-SJL mannen met wild-type C57BL / 6-SJL F1 vrouwtjes. De F1-dieren worden gegenereerd door het kruisen van SJL mannetjes met B6 vrouwtjes. Muizen worden verscheept naar ALS TDI wekelijks op 35-45 dagen oud.
- Laat muizen minstens een week acclimatiseren aan het dier faciliteit (12-uur licht / donker cyclus bij een temperatuur van 18-23 ° C en 40-60% vochtigheid) voordat het toewijzen van een onderzoek.
- Huis mannelijke SOD1-G93A mice één muis per kooi, omdat de groep gehuisvest mannetjes hebben de neiging om te vechten. Huis vrouwelijke SOD1-G93A muizen tot twee per kooi. Zorg voor het milieu verrijking, in de vorm van plastic hutten. Zorgen voor voedsel en water ad libitum, tenzij de muizen zijn onderdeel van een studie waarbij toediening van het geneesmiddel in het drinkwater / eten. In deze gevallen rantsoen en opnemen voedsel en water.
- Beginnen aan een drug-efficacy studie rond de leeftijd van dag 50 en onder 64-nest geëvenaard genderevenwichtige muizen (32 per cohort). Ten slotte zorgen dat de onderzoekers het uitvoeren van de studies zijn blind voor de experimentele omstandigheden.
Opmerking: Het wordt aanbevolen dat een typische geneesmiddel-effectiviteit studie begint op de leeftijd van dag 50 echter op basis van de aard van de therapeutische interventie is het misschien beter om de studie eerder of later beginnen.
Opmerking: Een studie met 32 muizen per cohort wordt aangedreven genderspecifieke drug-effecten te detecteren. Als er geen seksespecifieke vergelijkingen nodig zijn, moet 24 muizen per cohort volstaan om de totale drug-effecten te detecteren.
2. Lichaamsgewicht
- Neem lichaamsgewicht voor alle muizen in studies dagelijks met een nauwkeurigheid van 1 van 10 gram. Opmerking: Lichaamsgewicht is een gevoelige indicator van de progressie van de ziekte en van alle malaise die zou kunnen voortvloeien uit een chronische behandeling met geneesmiddelen.
- Muis lichaamsgewicht variëren aanzienlijk in de loop van de dag, hoger in de ochtend, dus nemen ze rond dezelfde tijd elke dag.
3. Neurologische Scoring System (NeuroScore)
- Evalueer neurologische score (NS) voor elke muis dagelijks door het observeren van de muis onder de volgende drie voorwaarden uitgevoerd achtereenvolgens: a) de muis wordt opgehangen bij zijn staart, b) de muis mag lopen en na het begin van parese c) het muis wordt op zijn kant.
- Voor de staart schorsing test, houdt u de muis ongeveer 1,5 "van de basis van de staart over de draad top van hun kooi voor 1-2 seconden, weg van het voedsel bekken, terwijl observing de achterpoten. Herhaal de schorsing testen 3 keer en noteer de meest consistente uitkomst.
- Voor de looptest, plaatst u de muis op een schoon oppervlak dat sommige tractie en een loopafstand van 25 cm biedt (bv., Een papieren handdoek vastgeplakt om uitglijden te voorkomen). Laat de muis om een totaal van 75 cm (3x lengte van het papier handdoek) lopen met inachtneming van de gang.
- Voor de "oprichtende reflex" test, plaats de muis op de linker of rechter kant en met behulp van een stop-horloge meet de tijd die nodig is om zichzelf recht zonder hulp van beide kanten. Opmerking: Slechts één proef van deze test is vereist.
- Bepaal de NS van elke achterpoot (links of rechts) zelfstandig op een schaal van 0 tot 4. Opmerking: bijvoorbeeld een score van 0, 1 betekent dat het linker achterbeen NS 0, terwijl de rechter achterpoot NS 1.
- Toewijzen neurologische score (0-4), die overeenkomt met de volgende reeks van waarnemingen (samenvatting in tabel 1):
- Toewijzen NS 0 (Pre-symptomatische) indien het volgende opgemerkt: Wanneer de muis wordt geschorst door de staart, het achterbeen presenteert een normale splay wil zeggen, het is volledig uit de buurt van de laterale middellijn uitgebreid en blijft in deze positie gedurende 2 seconden of meer. Wanneer de muis is toegestaan om te lopen, is de normale gang waargenomen.
- Toewijzen NS 1 (eerste symptomen) als het volgende opgemerkt: Wanneer de muis wordt geschorst door de staart, het achterbeen presenteert een abnormale verwijding, dat wil zeggen, het is ingestort of gedeeltelijk ingestort in de richting van de laterale middellijn Of het beeft tijdens staart schorsing of het wordt ingetrokken / geklemd. Wanneer de muis is toegestaan om te lopen, is normaal of licht trage gang waargenomen.
- Toewijzen NS 2 (Onset van parese) indien het volgende opgemerkt: Wanneer de muis wordt geschorst door de staart, het achterbeen is gedeeltelijk of volledig ingestort, niet veel te breiden. (Er kunnen nog steeds gezamenlijke beweging). Wanneer de muis is toegestaan om te lopen, wordt het achterbeen gebruikt voor forward motion maar de tenen krullen naar beneden ten minste twee keer tijdens een wandeling van 90 cm of een deel van de voet is te slepen langs de kooi onderaan / tafel. Wanneer de muis op de linker- en rechterzijde is geplaatst, is in staat om zichzelf recht in 10 sec van beide kanten.
- Toewijzen NS 3 (Verlamming) indien het volgende opgemerkt: Wanneer de muis wordt geschorst door de staart, is er stijf verlamming van de achterpoot of minimale gezamenlijke beweging. Wanneer de muis is toegestaan om te lopen is er een voorwaartse beweging maar het achterbeen wordt niet gebruikt voor de voorwaartse beweging. Wanneer de muis op de linker- en rechterzijde is geplaatst, is in staat om zichzelf recht in 10 sec van beide kanten. Opmerking: In zeldzame gevallen na het begin van verlamming, kan urine vocht op de achterpoten. Onbehandeld urine vocht kunnen leiden tot urine "Burn" en huidletsels. Behandel urine vocht door het knippen van het haar van toepassing warm water zuigt om de urine te verwijderen, en voorzichtig dep droog. Als huidletsels aanwezig zijn van toepassing antibiotic zalf.
- Toewijzen NS 4 (Humane eindpunt) indien het volgende opgemerkt: Wanneer de muis wordt geschorst door de staart, is er stijf verlamming van de achterpoten. Wanneer de muis is toegestaan om te lopen, is er geen voorwaartse beweging. Wanneer de muis op de linker- en rechterzijde wordt geplaatst is het niet in staat om zichzelf recht in 10 sec van beide kanten. Dwz afwezigheid van oprichtreflex.
4. Data Entry en Analyse
- Tijdens een geneesmiddel werkzaamheidsonderzoek, voert verzameld voor elke muis in een Laboratory Information Management System (LIMS) of in de handel verkrijgbare spreadsheet software.
Opmerking: De ALS TDI ontwikkelde LIMS software is een centrale opslagplaats voor alle verzamelde gegevens van interne onderzoeken, waardoor deze gegevens gemakkelijk te bereiken over de tijd voor ALS TDI onderzoekers. LIMS tracks elke individuele muis, met zijn unieke ID, terug naar zijn afstamming, lichaamsgewicht of neurologische score op alle studiedagen,en omvat alle andere waarnemingen opgemerkt tijdens zijn levensduur. LIMS uiteindelijk genereert een spreadsheet die wordt gebruikt voor daaropvolgende analyse. - Na de voltooiing van een geneesmiddel werkzaamheidsonderzoek, dwz wanneer alle muizen het humane eindpunt bereikt, gebruik spreadsheet software (zie tabel of Materials) aan de gecombineerde NS berekenen per muis per dag door het gemiddelde van de linker en rechter achterbeen NS . Vervolgens berekenen de gemiddelde leeftijd bij elke NS voor elke muis en het aantal dagen elke muis doorbrengt in een bepaalde NS.
- Analyseer algehele veranderingen in de NS na verloop van tijd door het importeren van de gegevens van de spreadsheet software om de statistische software (zie tabel van Materialen). Past deze gegevens met behulp van een model van ordinale logistische regressie die schat de verwachte NS, met een mediane leeftijd bij de NS en drugs-behandeling effecten in de regressie. Met behulp van de log-rank chi-kwadraat test schatten het effect kans op kans en te bepalen of de drug-behandeling effect op de NS progressie is statistischely significant (zie Aanvullende Code File voor stap-voor-stap instructies).
Opmerking: Een p-waarde <0,05 wordt als statistisch significant beschouwd.
Opmerking: Deze methode van statistische analyse respecteert de ordinale aard van de NS gegevens en de variabele aard van de NS trajecten voor individuele muizen. Het verdient de voorkeur omdat individuele NS trajecten duidelijk verschillend resulteert NS-time verbonden groep gemiddelden die niet voldoende afspiegeling is van NS reacties in kan zijn. Daarnaast is in sommige gevallen NS kan fluctueren, vooral wanneer de nul-op-een range. - Tot slot, gebruik grafische software (zie tabel van Materialen) voor het genereren van "Ordinal Verwachte NS vs mediane leeftijd bij NS" grafieken voor-geneesmiddel behandelde en controle dieren (figuur 2; zie Aanvullende Code File voor stap-voor-stap instructies). Met deze grafieken om gemakkelijk schatten verschuivingen tussen met geneesmiddel behandelde en controlegroepen door interpolatie van de y-as de gemiddelde leeftijd van begin van de ziekte (i.e., NS 2) op de x-as.
Opmerking: Het verschil in mediane leeftijd tussen de twee groepen vertegenwoordigt een geneesmiddelgeïnduceerde shift en wordt beschouwd als een praktische maat voor de omvang van het effect.
Opmerking: Rechtsom verschuivingen in de verwachte NS vs. mediane leeftijd curve duiden vertraagd symptomatische progressie van de ziekte. Omgekeerd, naar links verschuivingen in de verwachte NS vs. mediane leeftijd curve duiden versnelde symptomatische progressie van de ziekte.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
De neurologische score gegevens voor de 90 mannelijke en 94 vrouwelijke niet-behandelde SOD1-G93A muizen studeerde aan ALS TDI in 2014 werden geëvalueerd. De resultaten tonen aan dat mannelijke muizen kenmerkend een agressievere ziekteprogressie dan vrouwelijke muizen, zoals blijkt uit een groter deel van hun levensduur NS 1 dan bij vrouwen. NS 2 en 3 NS optreden met vrijwel gelijke frequentie over geslachten. NS 0 werd uitgesloten van de analyse omdat het wordt beschouwd als een "normaal" fenotype. NS 4 werd ...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
In dit verslag beschrijven we een snelle en eenvoudige video protocol dat, indien juist toegepast, kan op betrouwbare beoordeling van de progressie van de ziekte in SOD1 G93A-muizen en identificeren drugs geïnduceerde veranderingen. Terwijl verschillende groepen fenotypische scoring systemen voor SOD1-G93A muizen 8-10 hebben ontwikkeld, ze vaak niet voldoende informatie over de procedure te bieden en zijn ontoereikend voor replicatie. Hierdoor worden scoresystemen zelden gebruikt buiten de specifieke groep di...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
We willen Beth Levine bedanken voor het kritisch beoordelen van het manuscript, Valerie Tassinari voor het ontwikkelen van het genotyperingsprotocol, en Matt Ferola en Carlos Maya voor hun uitzonderlijke dierenverzorging.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| B6SJLTgN(SOD1G93A)1Gur strain | The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME | 002726 | Stam van muizen gebruikt in dit onderzoek |
| Breeders | Biomedical Research Models, Inc., Worcester, MA | Kolonieonderhoud | |
| Scale | Navigator OHAUS, Parsippany, NJ | Model N14120 | Gebruikt om muizen te wegen |
| Nutra-GelH | Bio-Serv, Flemington, NJ | #S4798 | Nat voer voor zieke muizen |
| Irradiated Lab Animal Diet | Harlan, Indianapolis, IN | 2918-111914M | Kauwggoed |
| Lab-grade Sani-chips | Harlan Teklad, Indianapolis, IN | 7090 | Bedding |
| JMPH | SAS Institute, Inc., SAS Campus Drive, Cary, NC | v10.0.2 | Statistische software |
| Microsoft Excel | Microsoft, One Microsoft Way, Redmond, WA | Excel 2013 (v 15.0) | Spreadsheet-software |
| GraphPad Prism 5 | GraphPad software Inc., La Jolla, CA | v5.4 | Grafische software |
| Mouse Huts | Bio-Serv, Flemington, NJ | K3272 | Voor omgevingsverrijking |
Referenties
- Gurney, M. E., et al. Motor neuron degeneration in mice that express a human Cu,Zn superoxide dismutase mutation. Science. 264 (5166), 1772-1775 (1994).
- Rosen, D. R., et al. Mutations in Cu/Zn superoxide dismutase gene are associated with familial amyotrophic lateral sclerosis. Nature. 362 (6415), 59-62 (1993).
- Gurney, M. E. The use of transgenic mouse models of amyotrophic lateral sclerosis in preclinical drug studies. J Neurol Sci. 152, Suppl. 1 (6415), (1997).
- Scott, S., et al. Design, power, and interpretation of studies in the standard murine model of ALS. Amyotroph Lateral Scler. 9 (1), 4-15 (2008).
- Hegedus, J., Putman, C. T., Gordon, T. Time course of preferential motor unit loss in the SOD1 G93A mouse model of amyotrophic lateral sclerosis. Neurobiol. Dis. 28 (2), 154-164 (2007).
- Gordon, T., Ly, V., Hegedus, J., Tyreman, N. Early detection of denervated muscle fibers in hindlimb muscles after sciatic nerve transection in wild type mice and in the G93A mouse model of amyotrophic lateral sclerosis. Neurol. Res. 31 (1), 28-42 (2009).
- Gurney, M. E., et al. Motor neuron degeneration in mice that express a human Cu,Zn superoxide dismutase mutation. Science. 264 (5166), 1772-1775 (1994).
- Kim, K., Moore, D. H., Makriyannis, A., Abood, M. E. AM1241, a cannabinoid CB2 receptor selective compound, delays disease progression in a mouse model of amyotrophic lateral sclerosis. Eur. J. Pharmacol. 542 (1-3), 1-3 (2006).
- Weydt, P., Hong, S. Y., Kliot, M., Moller, T. Assessing disease onset and progression in the SOD1 mouse model of ALS. Neuroreport. 14 (7), 1051-1054 (2003).
- Azari, M. F., et al. Behavioural and anatomical effects of systemically administered leukemia inhibitory factor in the SOD1(G93A G1H) mouse model of familial amyotrophic lateral sclerosis. Brain Res. 982 (1), 92-97 (2003).
- Guan, Y., et al. Thiazolidinediones expand body fluid volume through PPARgamma stimulation of ENaC-mediated renal salt absorption. Nat. Med. 11 (8), 861-866 (2005).
- Savcheniuk, O. A., et al. The effect of probiotic therapy on development of experimental obesity in rats caused by monosodium glutamate. Fiziol. Zh. 60 (2), 63-69 (2014).
- Smittkamp, S. E., Brown, J. W., Stanford, J. A. Time-course and characterization of orolingual motor deficits in B6SJL-Tg(SOD1-G93A)1Gur/J mice. Neuroscience. 151 (2), 613-621 (2008).
- C, M., Gurney, M. E. A low expressor line of transgenic mice carrying a mutant human Cu,Zn superoxide dismutase (SOD1) gene develops pathological changes that most closely resemble those in human amyotrophic lateral sclerosis. Acta Neuropathol. 93 (6), 537-550 (1997).
- Wegorzewska, I., Baloh, R. H. TDP-43-based animal models of neurodegeneration: new insights into ALS pathology and pathophysiology. Neurodegener. Dis. 8 (4), 262-274 (2011).
- Hatzipetros, T., et al. C57BL/6J congenic Prp-TDP43A315T mice develop progressive neurodegeneration in the myenteric plexus of the colon without exhibiting key features of ALS. Brain Res. 1584, 59-72 (2014).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
