De ex vivo rechtopstaande druppelcultuur is een alternatief voor huidige in vitro en in vivo experimentele technieken. Dit protocol is eenvoudig uit te voeren en vereist kleinere hoeveelheden reagens, terwijl het de mogelijkheid biedt om foetale vasculaire vorming, morfogenese en organogene te manipuleren en te bestuderen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Onderzoeken van de organogenese in de baarmoeder is een technisch uitdagend proces in zoogdieren als gevolg van ontoegankelijkheid van reagentia om embryo's die zich ontwikkelen in de baarmoeder. Een nieuw ontwikkelde ex vivo opstaande druppeltje kweekmethode biedt een aantrekkelijk alternatief voor studies uitgevoerd in utero. De ex vivo druppel cultuur biedt de mogelijkheid te onderzoeken en te manipuleren cellulaire interacties en diverse signaalwegen door het gebruik van verschillende blokkerende en activerende verbindingen; Bovendien kunnen de effecten van verschillende farmacologische reagentia voor de ontwikkeling van specifieke organen worden onderzocht zonder de bijwerkingen van systemische geneesmiddelafgifte in utero. In vergelijking met andere in vitro systemen, de druppel cultuur laat niet alleen het vermogen om driedimensionale morfogenese en cel-cel interacties te bestuderen, die niet kan worden gereproduceerd in zoogdiercellijnen, maar vereist aanzienlijk minder reagents dan andere ex vivo en in vitro protocollen. Dit document toont goede muis foetaal orgaan dissectie en opstaande druppeltje kweektechnieken, gevolgd door immunofluorescentie gehele orgaan om de effectiviteit van de werkwijze te demonstreren. De ex vivo druppel kweekmethode maakt de vorming van orgaanarchrtectuur vergelijkbaar met wat wordt waargenomen in vivo en kan worden gebruikt om op andere wijze moeilijk te bestuderen processen als gevolg van embryonale letaliteit bij in vivo modellen te bestuderen. Als modelapplicatie systeem, zal een kleine-molecule inhibitor worden gebruikt om de rol van vascularisatie in testiculaire morfogenese sonde. Dit ex vivo druppel kweekwerkwijze worden uitgebreid tot andere foetale orgaansystemen, zoals long- en mogelijk andere, hoewel elke orgaan uitgebreid moet worden bestudeerd om een orgaan-specifieke modificaties aan het protocol te bepalen. Dit orgelcultuur systeem biedt flexibiliteit in de experimenten met foetale organen, en resultaten obtained met behulp van deze techniek zal helpen onderzoekers krijgen inzicht in de ontwikkeling van de foetus.
Inleiding
Orgaanregeneratie in vivo bij mensen is zeer beperkt; Daarom tissue engineering, de ontwikkeling van weefsels en organen van afzonderlijke cellen gedoneerd door een gastheercel, wordt een aantrekkelijke potentiële therapie voor orgaantransplantatie. Voor deze therapeutische strategie staat, factoren en cellulaire interacties betrokken bij morfogenese van het orgaan worden grondig bestudeerd en goed begrepen. Vanwege het onvermogen om ontwikkeling van specifieke organen traditionele benaderingen bestuderen, hebben onderzoekers zich tot alternatieve gehele embryo of geheel orgaankweken. Kalaskar et al. 1 blijkt dat ex vivo gehele e....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle muizen die in deze studies waren CD-1-muizen verkregen van Charles River Laboratories. Previous cultuur experimenten werden ook uitgevoerd op andere stammen zoals C57BL / 6J (data niet getoond), maar iedere stam worden gebruikt. Zwangere volwassen vrouwtjes waren ongeveer 2-3 maanden oud en werden gedood via CO 2 inhalatie, gevolgd door cervicale dislocatie en bilaterale thoracotomie voorafgaand aan de embryo verwijderen. Muizen werden gehuisvest in overeenstemming met de NIH richtlijnen en experimentele protocollen werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite van Cincinnati Children's Hospital Medical Center.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
De ex vivo cultuur druppel kan men hele organen, zoals de gonade manipuleren, om cellulaire interacties en dynamica te bestuderen. Figuur 1 toont in een stapsgewijs hoe een E11.5 gonaden druppel cultuur bereiden. De eerste stappen in de kweek protocollen zijn aanvankelijke verwijdering van de embryo-bevattende baarmoeder van de moeder muizen (figuur 1A en 1B). Na verwijdering van de baarmoeder van de moeder, wordt de baarmoederwand gesneden en de embryo's worden bevrijd van.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Deze studie toont een ex vivo hele orgel druppel methode die veel potentiële toepassingen voor het bestuderen van de foetale ontwikkeling heeft. Deze techniek kan worden gebruikt voor meerdere organen, en kan de onderzoeker biologische vragen die moeilijk te onderzoeken het gebruik in vivo nadert gevolg ontoegankelijkheid van embryo's en embryonale letaliteit potentiële pakken. Deze cultuur methode heeft extra voordelen boven andere in vitro benaderingen zoals zoogdiercellijnen: g.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.
Dankbetuigingen
De auteurs werden ondersteund door: een CancerFree KIDS Onderzoekssubsidie, een March of Dimes Basil O’Connor Starter Scholar Award (#5-FY14-32), een Cincinnati Children’s Hospital Medical Center (CCHMC) Trustee Grant Award; een CCHMC Onderzoeksinnovatie en Pilot Financiering Award; en CCHMC ontwikkelingsfondsen. Auteurs erkennen ook het Capel laboratorium voor de initiële optimalisatie van deze techniek.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| Cover Glasses: Squares (22 mm x 22 mm, No. 1.5) | Fisherbrand | 12-541B | |
| Sally Hansen Xtreme Wear Nail Polish, Invisible | Sally Hansen | ||
| 8-Strip 0.2 ml PCR Tubes & Detached Flat Caps | GeneMate | T3218-1 | |
| Pipetman L P1,000L, P200L, P20L, P10L, P2L | Gilson | FA10006M, FA10005M, FA10003M, FA10002M, FA10001M | |
| Dumont #5 Forceps | FST | 91150-20 | |
| Fine Scissors | FST | 91460-11 | |
| Posi-Click 1.7 ml microcentrifuge tubes | Denville | C2170 | |
| Posi-Click 0.6 ml microcentrifuge tubes | Denville | C2176 | |
| 10 µl SHARP Precision Barrier Tips | Denville | P1096FR | |
| 20 µl SHARP Precision Barrier Tips | Denville | P1121 | |
| 200 µl SHARP Precision Barrier Tips | Denville | P1122 | |
| 1,000 µl SHARP Precision Barrier Tips | Denville | P1126 | |
| 1 ml syringe with 27 gauge needles | BD PrecisionGlide | 309623 | |
| 10 ml syringe | BD | 305559 | |
| 0.2 µM PES syringe filter | VWR | 28145-501 | |
| Grade 3 Qualitative Filter Paper Standard Grade, circle, 185 mm | Whatman | 1003-185 | |
| Primaria 35 mm Easy Grip Style Cell Culture Dish | Falcon/Corning | 353801 | |
| Petri Dishes, Sterile (100 mm x 15 mm) | VWR | 25384-088 | |
| New Brunswick Galaxy 14 S CO2 Incubator | Eppendorf | CO14S-120-0000 | |
| Biosafety Cabinet | Nuare | NU-425-400 | |
| Mini-centrifuge | Fisher Scientific | 05-090-100 | |
| BioExpress GyroMixer Variable XL | GeneMate | R-3200-1XL | |
| Mastercycler Pro Thermal Cycler with control panel | Eppendorf | 950040015 | |
| SMZ445 stereomicroscope | Nikon | SMZ445 | |
| MultiImage Light Cabinet with AlphaEase Software | Alpha Innotech Corporation | Discontinued | |
| Absolute 200 proof Ethanol | Fisher | BP2818-500 | |
| Triton X-100 | Fisher | BP151-100 | |
| Sodium Phosphate (Dibasic MW 142) Na2HPO4 | Fisher | S374-1 | |
| Potassium Phosphate (Monobasic MW 136) KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5379-1KG | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher | S671-3 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P3911-1KG | |
| Magnesium Chloride (MgCl2) | Sigma | M2393-100g | |
| Calcium Chloride (CaCl2) | Sigma | C5670-100g | |
| Ambion Nuclease-Free Water | Life Technologies | AM9938 | |
| XY PCR Primer | IDT | N/A | |
| Glacial Acetic Acid | Fisher | A38-500 | |
| Ethylenediamine Tetraacetic Acid (EDTA) | Fisher | BP2482-1 | |
| 1% Ethidium bromide solution | Fisher | BP1302-10 | Toxisch |
| Agarose | GeneMate | E-3120-500 | |
| Sodium Hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | 367176-2.5KG | |
| Trizma Base | Sigma | T1503-1KG | |
| dNTP Set, 100 mM Solutions | Thermo Scientific | R0182 | |
| DNA Choice Taq polymerase with 10x Buffer | Denville | CB-4050-3 | |
| Paraformaldehyde | Fisher | O4042-500 | Toxisch |
| FluorMount-G | Southern Biotech | 0100-01 | |
| Hydrogen Chloride (HCl) | Fisher | A144212 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA), powder, Fraction V, Heat shock isolation | Bioexpress | 0332-100g | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 11965-092 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), triple 100 nm filtered | Fisher | 03-600-511 | Voor gebruik verhitten |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | Life Technologies | 15140-122 | Gebruik op 1:100 |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO), Hybri-max, sterile-filtered | Sigma | D2650 | |
| VEGFR Tyrosine Kinase Inhibitor II - CAS 269390-69-4 - Calbiochem | EMD Millipore | 676481 | |
| Rabbit Anti-Sox9 Antibody | Millipore | AB5535 | Gebruik op verdunning: 1:4.000 |
| Rat Anti-Mouse PECAM1 (CD31) Antibody | BD Pharmingen | 553370 | Gebruik op verdunning: 1:250 |
| Rabbit Cleaved Caspase-3 (Asp175) Antibody | Cell Signaling | 9661S | Gebruik op verdunning: 1:250 |
| Rat E-cadherin / CDH1 Antibody (ECCD-2) | Life Technologies | 13-1900 | Gebruik op verdunning: 1:500 |
| Hoechst 3342, trihydrochloride, trihydrate | Invitrogen (Molecular Probes) | H1399 | Gebruik op 2 µg/ml |
| Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG (H+L) | Jackson Immunoresearch | 712-165-153 | Gebruik op verdunning: 1:500 |
| Alexa Fluor 647 AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG (H+L) |
Referenties
- Kalaskar, V. K., Lauderdale, J. D. Mouse embryonic development in a serum-free whole embryo culture system. J. Vis. Exp. (85), e50803(2014).
- Maatouk, D. M., et al. Stabilization of beta-catenin in XY gonads causes male-to-female sex-reversal. Hum. Mol. Genet. <....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
