Herhaalde bloedafname voor Blood Tests in Adult zebravis

Samenvatting

Herhaalde bloedmonsters zijn noodzakelijk en belangrijk in dieronderzoek. We ontwikkelden een nieuwe, niet-dodelijke en betrouwbare methode voor herhaalde bloedopname bij volwassen zebravissen en pasten deze methode toe op de studie van bloedbiochemie, inclusief glucosemetabolisme.

Samenvatting

Herhaalde bloedafname is een van de meest gebruikte technieken uitgevoerd op laboratoriumdieren. Echter, een niet-dodelijke protocol voor bloedafname uit zebravis niet vastgesteld. De vorige methoden voor bloedafname uit zebravis zijn dodelijk, zoals laterale incisie, onthoofding en de staart ablatie. Zo hebben we een nieuwe "herhaalde" bloedafname methode een gedetailleerd protocol waarin deze procedure ontwikkeld, en hier aanwezig. Deze methode is minimaal invasief en resulteert in een zeer lage mortaliteit (2,3%) voor zebravis, waardoor herhaalde bloedmonsters van hetzelfde individu. Het maximale volume bloedafname is afhankelijk van het lichaamsgewicht van de vis. Het volume voor herhaalde bloedafname tussenpozen moet ≤0.4% lichaamsgewicht per week of ≤1% per 2 weken, die werden geëvalueerd door meting van hemoglobine zijn. Bovendien, hemoglobine, nuchtere bloedglucose, plasma triacylglycerol (TG) en totaal cholesterol niveaus in mannelijke en vrouwelijke volwassen zebravissen werden gemeten. We pasten deze methode ook de ontregeling van het glucosemetabolisme in dieet-geïnduceerde obesitas onderzoeken. Deze bloedafname methode vele toepassingen, waaronder glucose en lipidemetabolisme en hematologische onderzoeken, die het gebruik van zebravis zal toenemen menselijke ziekte modelorganisme toestaan.

Inleiding

Zebravis winnen steeds populairder als een waardevol model van menselijke ziekten vanwege hun organen en genetica zijn vergelijkbaar met die van mensen ^1,2. Op het gebied van de ontwikkelingsbiologie, hebben vele studies aangetoond dat de zebravis en de mens vertonen gemarkeerd gelijkenis in hematopoiesis ^3, hemostase ^4,5 en myelopoiese ^6. Volwassen zebravissen worden ook gebruikt voor het bestuderen immunologische ^7, neurodegeneratieve ⁸ en obesitas gerelateerde ziekten ⁹ omdat modelorganisme kent gemeenschappelijke pathways met die verstoord menselijke ziekten. Voor overgewicht en obesitas gerelateerde ziekten (diabetes, leververvetting en niet-alcoholische steatohepatitis en atherosclerose), zebravis bloedglucose en lipiden niveaus grondig zijn onderzocht in verschillende transgene en dieet-geïnduceerde zwaarlijvigheid modellen ^10-13.

Herhaalde bloed bemonstering van individuele dieren zullen gebruik en december dier te verminderenrease interindividuele verschillen. Echter, herhaalde monstername in kleine dieren zoals zebravis technisch moeilijk vanwege hun relatief kleine bloedvolume en het gebrek aan gemakkelijk toegankelijke vaartuigen. Verschillende werkwijzen voor eenmalige bloedafname van zebravis ontwikkeld, alhoewel deze methoden hebben hun eigen nadelen, zoals dodelijkheid, geassocieerde weefselbeschadiging en beperkte bloedvolume. Zo kan 1-5 gl bloed worden geoogst uit een laterale incisie van ongeveer 0,3 cm in lengte in het gebied van de dorsale aorta ^5. Onthoofding met een schaar door te snijden door de schoudergordel kan 5-10 ul bloed ¹⁰ te verzamelen. Een andere handige bloedafname methode is staart ablatie ^14. Hartpunctie is één potentiële alternatieve methode voor herhaalde bloedafname van dezelfde vis, maar de zeer kleine hoeveelheid verkregen (ongeveer 50 nl) met deze procedure beperkt het aantal analyses die kan worden uitvoemed ^11. Dienovereenkomstig is een nieuw protocol nodig om herhaaldelijk niet-dodelijke bloedmonsters, die een kritische vooruitgang nodig zou zijn voor dit organisme een standaard modelorganisme voor menselijke ziekten mogelijk. Deze techniek zou het mogelijk maken het testen van farmacologische respons, ontdekking van moleculaire biomarkers voor de diagnose, bepaling van prognose en het volgen van verschillende ziekten, zoals stofwisselingsziekten, degeneratieve ziekten en verschillende soorten tumoren.

We daarom een minimaal invasieve werkwijze voor het verkrijgen van bloed uit zebravis serie ^15. Hier laten we de procedure visueel en een gedetailleerd protocol voor deze techniek. Met behulp van deze methode, werden de normale waarde op basis van verschillende parameters, zoals hemoglobine, nuchtere bloedglucose en lipiden in het bloed van gezonde volwassen zebravissen geëvalueerd. Daarnaast hebben we ook onderzocht of deze methode geschikt is voor studies die seriële monsters per m nodigMonitoring van de temporele veranderingen in de bloedsuikerspiegel tijdens overvoeding experimenten.

Protocol

Alle dierlijke procedures werden goedgekeurd door de ethische commissie van Mie University, en werden uitgevoerd volgens de Japanse dierenwelzijn regelgeving 'Wet op het Welzijn en beheer van Animals' (Ministerie van Milieu van Japan) en nageleefd internationale richtlijnen.

1. Voorbereiding van de naald

LET OP: Alle experimenten werden uitgevoerd onder verdoving, en alle inspanningen werden gedaan om het lijden te minimaliseren. Voor euthanasie, werden vis ondergedompeld in een ijs-waterbad (5 delen ijs / 1 deel water bij ≤4 ° C) gedurende ≥20 min.

1. Bereid de glazen microcapillaire naalden door het trekken van een 1,0-mm-outer diameter glazen capillair met een naald trekker (Figuur 1A).
2. Snijd de uiteinden van de naalden schuin behulp van fijne schaar (figuur 1B). De ideale tip diameter moet ongeveer 100-200 micrometer (figuur 1C). Als de tip diameter is te smal, zal het bloed niet de naald in te voeren.
3. Los héparine in zoutoplossing tot een concentratie van 5 mg / ml.
4. Plaats een voorgesneden naald in het neusstuk einde van een beluchtingsbuis assemblage en houd het mondstuk in de mond, of sluit de naald om een ​​gloeilamp dispenser. Dompel de naald in de heparine-oplossing, en heparinize de naald door het zuigen en blazen door de oplossing (figuur 1D en 1E).
   Opmerking: De aspirator buisstelsel wordt al zebravis sperma cryopreservatie ^16. Lange rubberen buis kan elke bloed vliegen in de mond stoppen. Een filter instellen in het midden van de buis kan voorkomen dat de gevaren.
5. Bewaar de gehepariniseerde naalden in een 10-cm petrischaal en drogen aan de lucht gedurende ten minste 1 uur. Een groot aantal naalden kunnen worden voorbereid.

2. Anesthesie

1. Bereid de verdoving oplossing in een kleine plastic geval door het mengen van 200 ml water vissen met 100 ul van 2-fenoxyethanol (2-PE). De eindconcentratie van de verdoving is 500 ppm.
   LET OP! 2-PE heeft een snelle werking.
2. Verwijder gewenste aantal vissen (AB stam) uit de circulatie systeem.
3. Gebruik een net om de vis te brengen in de anesthesie voor 1-2 min (Figuur 1F). Let op de vis geleidelijk te zwemmen, verspreiden de borstvinnen horizontaal, snik, en hebben een snelle operculum bewegingen binnen 1 min.
4. Naarmate de tijd vordert, nemen de vis lag op de bodem van de zaak en uiteindelijk stoppen met zwemmen. De chirurgische vlak van anesthesie zal bereiken wanneer de vis stopt om te hijgen en het operculum bewegingen zijn traag. Op dit punt, vis is klaar voor bloedafname.
5. Met behulp van een skimmer til de verdoofde vis uit het 2-PE en zachtjes plaats het op een papieren handdoek gedrenkt in de anesthesie (figuur 1G). Bedek de kop van de vis met zacht weefsel papier ook doordrenkt met 2 PE-oplossing voor droge ogen te voorkomen en voorzichtig gebruik een andere droge zacht weefsel papierdrogen het lichaamsoppervlak.

3. bloedafname

1. Plaats een gehepariniseerde naald in de neusstuk einde van de beluchtingsbuis montage (of de gloeilamp dispenser) en houd het mondstuk einde van de beluchtingsbuis assemblage in de mond.
2. Pak de neusstuk einde en de naald samen, en de storende schalen verwijder voorzichtig met de naald. Steek de naald op een 30 - 45 ° hoek in de bloedafname website. Vermijd punctie van het maagdarmkanaal (Figuur 1H). In het geval van het gebruik van lamp dispenser, drukt u op de lamp met duim en middelvinger, en blokkeren het gat aan het uiteinde van de lamp met eerste vinger, steek de naald zoals hierboven beschreven.
   Opmerking: De plaats voor bloedafname is langs de lichaamsas en posterior naar de anus in het gebied van de dorsale aorta. De dorsale aorta (da) en de achterste hoofdader (PCV) zijn ventraal aan de wervelkolom (figuur 2).
3. Begin met het zuigenmondstuk einde van de afzuigslang samenstel wanneer de naald wordt gevoeld aanraken van de wervelkolom. Als het bloed niet stijgt, beweegt de naald op subtiele wijze met de hand om de doorbloeding te stimuleren. Merk op dat zodra het bloed stijgt in de naald, onmiddellijk stoppen met schudden en zuigen zachtjes (figuur 1I). Bij gebruik lamp dispenser, laat de druk van de lamp om het bloed zuigen.
4. Houd het bloed langzaam in de naald rijzen op een pulserende wijze zonder afzuiging, die waarschijnlijk door de arteriële bloeddruk. Derhalve is het niet noodzakelijk te zuigen wanneer de naald goed doordringt de slagader.
5. Stop zuigkracht na de juiste hoeveelheid bloed wordt verzameld. Verwijder de naald uit de vis en druk op de prikplaats met zacht weefsel papier om het bloeden te stoppen. Observeer het bloeden te stoppen na ongeveer 10-20 seconden van de vinger druk (figuur 1J).
6. Nadat het bloeden is gestopt, onmiddellijk de vis transfer terug naar een keleen warm-water (~ 28 ° C) tank. Help de vis te herstellen door voorzichtig schudden water naar de kieuwen tot het begint te zwemmen.
   Opmerking: Bewaar tot 5 postsampling vis in een 2 L tank en sluit de tank naar het circulatiesysteem de vis zuurstof. Toevoeging van antibiotica om de vissen water niet noodzakelijk. Handhaving van de vis met een normale huisvesting en voeding.
7. Verdrijf het bloed van de naald op een schone ruimte van een stuk parafilm (figuur 1K).
8. Bloedglucose meten met behulp van een commerciële handheld glucometer (figuur 1L).
   Opmerking: De glucometer gebruikt een glucose-dehydrogenase flavineadeninedinucleotide elektrode en vergt een monstervolume van 0,6 pl.
   1. Steek een teststrip volledig in de meter en direct contact met de bloeddruppel. Let op de bloedafname in de teststrip automatisch en het verkrijgen van de bloedglucose resultaat 5 seconden op het display. Noteer het resultaat en de teststrip weggooien. Gebruik eennieuwe teststrip voor elke meting.
9. (optionele stap) Verricht nauwkeurige hoeveelheden bloed door pipetteren en het bloed over te brengen naar een microcentrifugebuis voor verdere analyse (hemoglobine, triacylglycerol (TG), totale cholesterol, etc.). Eventueel verdunnen geheel bloed van een vis met zoutoplossing. Centrifugeer de bloedmonsters voor 3 min bij 680 xg bij RT en de oogst van het plasma. Breng het plasma in een nieuwe buis. Op dit punt is het klaar voor gebruik in biochemische analyses.

Resultaten

Deze bloedafname methode veroorzaakt minimale schade aan de zebravis (een <1 mm punctie Figuur 1J) en levert een zeer laag sterftecijfer van 2,3%. We onderzochten de maximale hoeveelheid bloed die kunnen worden verzameld uit een enkele vis en evalueerde de relatie met haar lichaamsgewicht (figuur 3). We vonden dat de maximale bloedvolume verzameld lineair was gecorreleerd met het lichaamsgewicht (R = 0,813). Het grootste volume van het bloed verzameld van een individuele vis (lichaam...

Discussie

Wij presenteren hier een gedetailleerd protocol voor serieel verkrijgen van bloed van volwassen zebravissen. Deze werkwijze is eenvoudig uit te voeren en we gebruiken in lab dagelijks. Deze bloedafname methode is gebaseerd op het plaatsen van een glazen capillaire naald in de zebravis de dorsale aorta. Tijdens deze procedure is het essentieel om voorzichtig te zijn om niet ablateren de wervelkolom, omdat het criterium voor het zoeken naar de dorsale aorta. Het verminderen van de wervelkolom letsel zal de overlevingskans...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Glas capillairen met gloeidraad	Narishige	GD-1	1,0 mm buitendiameter.
Naaldtrekker	Narishige	PC-10	Voor het produceren van de naalden
Heparine	Wako Pure Chemical Industries	081-00136	Voor heparinisatie
Aspiratiebuisassemblage	Drummond	2-040-000	Voor bloedafname
Pomp	Drummond	1-000-9000	Voor bloedafname
2-fenoxyethanol	Wako Pure Chemical Industries	163-12075	Voor verdoving van de vissen
DRI-CHEM3500V	Fujifilm	-	Voor hemoglobinemeting
DRI-CHEM Slides	Fujifilm	Hb-WII	Voor hemoglobinemeting
Glutest Neo Super	Sanwa Kagaku Kenkyusho	-	Voor bloedglucosemeting
Wako L-type TG kit	Wako Pure Chemical Industries	464-44201	Voor TG-meting
Wako L-type CHO kit	Wako Pure Chemical Industries	460-44301	Voor totale cholesterolmeting
Parafilm M	Alcan Packaging	PM996	Om het bloed te verdrijven