Methodenartikel

Generatie van genetisch gemodificeerde Organotypische Skin Culturen behulp gedevitaliseerde Human Dermis

DOI:

10.3791/53280

⸱

14 december 2015

 , 
1Department of Dermatology, UCSD Stem Cell Program, University of California, San Diego, 2Department of Cellular and Molecular Medicine, UCSD Stem Cell Program, University of California, San Diego

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het doel van dit artikel is om een uitgebreid en gedetailleerd protocol te geven over hoe genetisch gemodificeerde humane organotypische huid te genereren uit epidermale keratinocyten en gedevitaliseerde humane dermis.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Organotypische kweken kan de reconstructie van een 3D-omgeving essentieel voor cel-cel contact en cel-matrix interacties die de functie en fysiologie van hun tegenhangers in vivo weefsel nabootst. Dit wordt geïllustreerd door organotypische huid culturen die trouw recapituleert de epidermale differentiatie en gelaagdheid programma. Primaire menselijke epidermale keratinocyten genetisch manipuleerbaar door middel van retrovirussen, waar genen gemakkelijk kan worden tot overexpressie gebracht of neergehaald. Deze genetisch gemodificeerde keratinocyten kan vervolgens worden toegepast om menselijke epidermis in organotypische kweken huid die een krachtige model te bestuderen genetische pathways beïnvloedende epidermale, differentiatie en ziekteprogressie regenereren. De hier gepresenteerde protocollen beschrijven werkwijzen voor devitalized menselijke dermis bereiden en genetisch manipuleren van primaire humane keratinocyten om organotypische kweken skin genereren. Geregenereerde menselijke huid kan worden gebruikt in stroomafwaartseeam toepassingen zoals genexpressie profiling, immunokleuring en chromatine immunoprecipitaties gevolgd door high throughput sequencing. Aldus zal genereren van deze genetisch gemodificeerde organotypische kweken skin de bepaling van genen die essentieel zijn voor het handhaven van homeostase huid mogelijk moeten maken.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De menselijke epidermis is een gelaagd epitheel die aansluit op de onderliggende dermis door een extracellulaire matrix bekend als het basaal membraan zone.The epidermis niet alleen dient als een ondoordringbare barrière voor het verlies van vocht te voorkomen, maar ook als een eerste verdedigingslinie voor de bescherming lichaam van vreemde en giftige stoffen 1. De basale laag, die de diepste laag van de epidermis, bevat de epidermale stamcellen en progenitorcellen die tot de gedifferentieerde nageslacht dat de rest van de epidermis 2 te vormen. Epidermale stamcellen differentiëren ze migreren omhoog naar de eerste laag van gedifferentieerde cellen zogenaamde doornuitsteeksels laag 3 te vormen. In de doornuitsteeksels laag cellen zet de expressie van keratine 1 en 10, die vervolgens over een kracht om fysieke stress te weerstaan ​​van de gedifferentieerde lagen van de epidermis. Aangezien de doornuitsteeksels laag cellen verder te differentiëren, zij omhoog bewegen in de epidermis voorm de granulaire laag die wordt gekenmerkt door de vorming van keratohyalin en lamellaire korrels en structurele eiwitten die onder de plasmamembraan worden geassembleerd. Aangezien de cellen doorgaan in het differentiatieproces, de eiwitten onder de plasmamembraan zijn verknoopt met elkaar, terwijl de lamellaire korrels geëxtrudeerd uit de cellen van een lipide rijke barrière genoemd stratum corneum 4 vormen.

Ziekten die veranderingen in epidermale differentiatie en effect ~ 20% van de bevolking 5 betrekken. Aldus begrip van de mechanismen van dit proces van groot belang. Omdat manifestatie van veel van deze ziekten is afhankelijk cel-cel- of cel-matrix contact zijn organotypische kweken waarbij de menselijke epidermis wordt gereconstitueerd in een 3D-omgeving gecreëerd 6-10. Deze methoden omvatten meestal het gebruik van primaire of getransformeerde keratinocyten gezaaid op extracellulaire matrix zoals gedevitaliseerde mensdermis, Matrigel of collageen.

Om gen regulerende mechanismen die belangrijk zijn in de epidermale en differentiatie zijn te begrijpen, kunnen keratinocyten genetisch gemanipuleerd worden door middel van retrovirale vectoren om knockdown of overexpressie van genen in 2D cultuur en vervolgens opnieuw in 3D. Deze methoden zijn uitgebreid gebruikt om genen betrokken bij epidermale stamcellen en cellen zelfvernieuwing en differentiatie alsmede progressie naar neoplasie 11-21 karakteriseren. Hier wordt een diepgaand protocol over genexpressie in de epidermis organotypische kweken veranderen door het gebruik van retrovirussen ontvangen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De menselijke huid protocol werd uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van de Universiteit van Californië, Research Ethics Committee van San Diego. Menselijke huid kan worden verkregen uit afgedankte chirurgische monsters of gekocht van de huid banken (huid bank is opgenomen in de Material / Equipment tabel). De locatie waar de huid afkomstig is van of leeftijd van de donor is niet kritisch voor de proef zolang de basaalmembraan zone proteïnen (collageen / laminine) in de dermis niet afgebroken.

1. Voorbereiding van gedevitaliseerde Human Dermis

  1. Na ontvangst van de menselijke huid, plaats het weefsel in de weefselkweek kap ontdooien (~ 3-5 min). Afhankelijk van de grootte van de huid, plaatst ontdooide weefsel in een steriele 50 ml conische buis of 125 ml flesje. De typische grootte van de huid van de huid bank is 0,75 vierkante voet.
  2. Vul het reservoir 75% vol met 4x penicilline en streptomycine (pen / strep) in 1x PBS. Schud krachtig gedurende5 min en afvoeren van de vloeistof. Herhaal deze stap 3 keer.
  3. Na de laatste wasbeurt, dragen het weefsel naar een nieuwe buis / fles en voeg verse 4x pen / strep / PBS te vullen 75% van de container. Incubeer dit mengsel in een weefselkweek incubator bij 37 ° C gedurende 2 weken om de scheiding van de dermis van de epidermis mogelijk maken.
  4. Onder steriele omstandigheden, een tang om afpellen de epidermis van de dermis. De dermis is helemaal wit, terwijl de epidermis kleuring zal hebben afhankelijk van het ras van de donor (figuur 1A). Gooi de epidermis volgens het protocol van de instelling voor het omgaan met menselijk weefsel.
  5. Plaats de dermis in een buis of fles en was het in 4x pen / strep verdund in 1x PBS met heftig schudden (5 min wast voor 4 keer). Na de laatste wasbeurt, de overdracht van de dermis naar een nieuwe buis / fles in 4x pen / strep verdund in 1x PBS en bewaar bij 4 ° C tot gebruik. Dermis kan worden opgeslagen bij 4 ° C gedurende maximaal een jaar.

2. het genetisch modificeren van primaire humane keratinocyten

OPMERKING: Gebruik amphotrope Phoenix cellen gekweekt in compleet DMEM-medium [DMEM + 10% foetaal runderserum (FBS) + pen / strep] om virussen te produceren om primaire humane keratinocyten te infecteren. Virale verpakkingen genen die eiwitten als gag-pol en envelop coderen worden stabiel geïntegreerd in het genoom Phoenix die zorgt voor virusproductie wanneer getransfecteerd met een retrovirale vector. Phoenix cellen kunnen worden getransfecteerd met hoge efficiëntie waardoor een hoge virale titer productie. Virus bereid van deze verpakkingslijn kan infecteren een grote verscheidenheid aan zoogdiercellen waaronder humane.

  1. Dag 1: De dag voor transfectie, zaad Phoenix cellen in een 6-wells plaat met een dichtheid van 800.000 cellen per putje in compleet DMEM media.
  2. Dag 2: De dag van transfectie gebruikt 3 ug retrovirale vectoren per putje. Aliquot 3 ug retrovirale vector in een 1,5 ml buis. Gebruik een mix van 100 μ; l DMEM plus 6 pl transfectie reagens voor elke 3 ug vector. Meng 6 pl transfectie reagens met 100 ul DMEM in een 1,5 ml buis. (De retrovirale vectoren die gebruikt worden in de tabel materiaal / materialen).
    1. Incubeer gedurende 5 min en voeg 106 ul mengsel in de pre-gealiquoteerde buis met het 3 ug retrovirale vector. Meng en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 min. Voeg deze gehele mengsel druppelsgewijs toegevoegd aan elk putje van de Phoenix cellen.
  3. Dag 3: De dag na transfectie, verwijder de media uit de Phoenix cellen en voeg 2 ml vers compleet DMEM media. Op dezelfde dag, zaad primaire menselijke keratinocyten in 6-wells platen met een dichtheid van 75.000 cellen per putje. Handhaving van de keratinocyten in een keratinocyten serum vrij medium (KCSFM) met antibiotica (pen / strep).
    OPMERKING: De primaire humane keratinocyten werden gekocht. Cellen kunnen worden gekocht bij verschillende leveranciers (in het Material / Equipment tabel).
  4. Dag 4: Harvest van de media van de getransfecteerde phoenix cellen, die nu bestaat uit virale deeltjes. Passeren de media door een 0,45 pm filter met behulp van een injectiespuit (één verontreinigende phoenix cellen te verwijderen) en plaats 2 ml op de keratinocyten (uitgeplaat bij 75.000 cellen / putje van de vorige dag: zie stap 2.3). Voeg hexadimethrinebromide (5 ug / ml) aan de media te bemiddelen het infectieproces. Virale titers ~ 1 x 10 7 TU / ml.
    1. Draai de 6-wells platen in een centrifuge bij 200 x g gedurende 1 uur bij KT. Na de spin, verwijder de media die virus en was de cellen eenmaal met 1x PBS voor het toevoegen KCSFM.
  5. Dag 5: Infect dezelfde partij keratinocyten weer zoals in stap 2.4.
    OPMERKING: Selecteer de keratinocyten met een geneesmiddel als er een selecteerbare marker op de retrovirale vector en uit te breiden voor gebruik in downstream analyse of toepassingen zoals organotypische kweken.

3. Instellen Organotypische Skin Culturen

  1. Bouw deorganotypische cassette uit gangbare materialen die in het laboratorium of de cassettes kunnen op maat gemaakt door een metalen fabricage winkel (Figuur 2A - F). Om deze cassettes te maken van een 3,5 cm weefsel kweekplaat, gebruikt een cauterisatie om een 1,0 cm x 1,0 cm vierkant van het centrum van het deksel van een 3,5 cm schaal (Figuur 2A-B) te verwijderen. Doe dit onder steriele omstandigheden.
    1. Hechten vierkante pinnen aan de onderkant van de cassette (deksel van 3,5 cm schotel) met behulp van duidelijke nagellak (figuur 2C). Laat 5 min voor de nagellak drogen en draai de cassette om zodat deze rust op de vierkante pennen (figuur 2D). Plaats de cassette in een 6 cm schaaltje.
      OPMERKING: De vierkante pinnen kan worden gekocht uit een verscheidenheid aan kunst en kunstnijverheid winkels.
  2. Bereid keratinocyt groeimedium (KGM) bestaande uit 66% DMEM, 22% Ham's F12, 100 eenheden / ml penicilline, 100 ug / ml streptomycine, 10% FBS, 2,67 ug / ml adenine, 40 ng / ml hydrocortison, 10 ng / ml choleratoxine, 4,94 ug / ml insuline, 5 ug / ml transferrine, 1,36 ng / ml trijood-L-thyronine, 10 ng / ml EGF, en 10 ug / ml ciprofloxacine hydrochloride. Filtreer de media door een 0,22 urn filter en bewaar bij 4 ° C tot gebruik.
  3. Neem de dermis van de 4x pen / strep + PBS oplossing en was 2 maal in KGM en incubeer in KGM bij 37 ° C gedurende twee dagen voorafgaand aan gebruik.
  4. Snijd de dermis met behulp van een scalpel tot 1,5 cm x 1,5 cm stukjes en leg op de organotypische cassette. Plaats de dermis met de bovenkant van de dermis omhoog. De bovenkant van de dermis de zijde die in contact komt met de keratinocyten (figuur 1B) zijn.
  5. Plaats de voorgesneden dermis op de vierkante opening van het organotypische cassette met de bovenzijde van de dermis omhoog (figuur 3A).
  6. Flip de gehele organotypische cassette met de dermis dan met behulp van een pincet (Figuur 3B). Ontdooi de extracellulaire matrix oplossing op ijs. Gebruik een naald en spuit te trekken uit 100 ul van extracellulaire matrix oplossing per cassette. Voeg 5 druppels aan de onderzijde van de dermis (glanzende zijde) en schud licht tot een gelijkmatige verdeling in de dermis (figuur 3B) te waarborgen.
  7. Laat 5 min voor commerciële extracellulaire matrix oplossing volledig stollen (figuur 3C). Na het stollen, een tang om de cassette terug over te spiegelen. Voeg 4 ml KGM de 6 cm schaal.
  8. Plaats 0,5-1.000.000 genetisch gemodificeerde keratinocyten op de organotypische cassettes met de dermis (Figuur 3D).
    1. Trypsinize keratinocyten door het plaatsen van 4 ml van 0,05% trypsine op 10 cm platen gedurende 5 min en blussen met 4 ml compleet DMEM media.
    2. Tel de keratinocyten met behulp van een hemocytometer en spin down bij 200 xg gedurende 5 min. Resuspendeer 0,5-1.000.000 cellen (afhankelijk van het aantal beschikbare cellen) in 90 μl KGM en plaats alle cellen op de dermis.
      Opmerking: Het is belangrijk om hetzelfde aantal cellen te plaatsen op dermis binnen hetzelfde experiment opdat konden verschillen in dikte van de geregenereerde epidermis niet door verschillen in starten celaantal. Het plaatsen van minder dan 0,5 miljoen cellen op dermis kan leiden tot slechte stratificatie en differentiatie.
  9. Veranderen KGM media op de organotypische culturen om de andere dag. Harvest tissue 1-14 dagen na plaatsing van keratinocyten op de dermis. Volledige stratificatie en differentiatie van de epidermis treedt meestal na dag 5.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De eerste stap bij het genereren van organotypische menselijke huid is de epidermis van de dermis verwijderd. De twee weken incubatie van de huid bij 37 ° C in 4x pen / strep / PBS dient de scheiding van de dermis van de epidermis (figuur 1A) toe. Als het scheiden van de opperhuid en de lederhuid is moeilijk plaats dan het weefsel bij 37 ° C in 4x pen / strep / PBS voor een week en probeer het opnieuw peeling met behulp van een tang.

Een van de sleutels tot regenererende hum...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Genetische manipulatie in de menselijke huid organotypische kweken bieden vele voordelen vaak bestudeerd 2D-gekweekte cellen evenals muismodellen. 2D culturen missen de driedimensionale cel-cel en cel-extracellulaire matrix interacties in intacte weefsels en organen. Recente studies hebben ook gevonden enorme verschillen tussen 2D en 3D gekweekte huid kankercellen met de 3D-gekweekte cellen waaruit veel meer genexpressie gelijkenissen met primaire menselijke huidtumoren 16. Menselijke huid organotypische cult...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wij hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk was supportedby de American Cancer Society Research Geleerden Grant (RSG-12-148-01-DDC) en de CIRM Basic Biologie Award (RB4-05779).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Human skinNew York Firefighters Skin Bankhttp://www.cornellsurgery.org/pro/services/burn-surgery/skin-bank.html
PEN/STREPGIBCO15140-122
amphotropic phoenix cell linesATCCCRL-3213
FUGENE 6 transfection reagentPromegaE2691
Keratinocyte Media (KCSFM)Life Technologies17005042
DMEMGIBCO11995
Ham's F12Cambrex12-615F
FBSGIBCO10437-028
AdenineSigmaA-9795
Cholera ToxinSigma C-8052
HydrocortisoneCalbiochem3896
InsulinSigmaI-1882
EGFInvitrogen13247-051
Transferrin SigmaT-0665
Ciprofloxacin HydrochlorideSerologicals89-001-1
cauteryBovie Medical CorporationAA01
MatrigelCorning354234
Keratin 1 antibodyBiolegendPRB-149P
square pegsArts and crafts stores
human neonatal keratinocytesATCCPCS-200-010
human neonatal keratinocytesCell Applications102K-05n
MSCV retroviral vectorClontech634401
LZRS retroviral vectorAddgene
pSuper.Retro.Puro Retroviral vectorOligoengineVEC-PRT-0002 
hexadimethrine bromide SigmaH9268-5G

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Tadeu, A. M., Horsley, V. Epithelial stem cells in adult skin. Current topics in developmental biology. 107, 107-131 (2014).
  2. Sen, G. L. Remembering one's identity: the epigenetic basis of stem cell fate decisions. FASEB J. 25, 2123-2128 (2011).
  3. Segre, J. A. Epidermal barrier formation and recovery in skin disorders. J Clin Invest. 116, 1150-1158 (2006).
  4. Eckert, R. L., Sturniolo, M. T., Broome, A. M., Ruse, M., Rorke, E. A. Transglutaminase function in epidermis. J Invest Dermatol. 124, 481-492 (2005).
  5. Lopez-Pajares, V., Yan, K., Zarnegar, B. J., Jameson, K. L., Khavari, P. A. Genetic pathways in disorders of epidermal differentiation. Trends Genet. 29, 31-40 (2013).
  6. Fuchs, E. Epidermal differentiation: the bare essentials. J Cell Biol. 111, 2807-2814 (1990).
  7. Green, H., Kehinde, O., Thomas, J. Growth of cultured human epidermal cells into multiple epithelia suitable for grafting. Proc Natl Acad Sci U S A. 76, 5665-5668 (1979).
  8. Khavari, P. A. Modelling cancer in human skin tissue. Nat Rev Cancer. 6, 270-280 (2006).
  9. Parenteau, N. L., Bilbo, P., Nolte, C. J., Mason, V. S., Rosenberg, M. The organotypic culture of human skin keratinocytes and fibroblasts to achieve form and function. Cytotechnology. 9, 163-171 (1992).
  10. Oh, J. W., Hsi, T. C., Guerrero-Juarez, C. F., Ramos, R., Plikus, M. V. Organotypic skin culture. J Invest Dermatol. 133, e14(2013).
  11. Sen, G. L., et al. ZNF750 Is a p63 Target Gene that Induces KLF4 to Drive Terminal Epidermal Differentiation. Dev Cell. 22, 669-677 (2012).
  12. Sen, G. L., Webster, D. E., Barragan, D. I., Chang, H. Y., Khavari, P. A. Control of differentiation in a self-renewing mammalian tissue by the histone demethylase JMJD3. Genes Dev. 22, 1865-1870 (2008).
  13. Mistry, D. S., Chen, Y., Wang, Y., Zhang, K., Sen, G. L. SNAI2 controls the undifferentiated state of human epidermal progenitor cells. Stem Cells. 32, 3209-3218 (2014).
  14. Truong, A. B., Kretz, M., Ridky, T. W., Kimmel, R., Khavari, P. A. p63 regulates proliferation and differentiation of developmentally mature keratinocytes. Genes Dev. 20, 3185-3197 (2006).
  15. Kretz, M., et al. Control of somatic tissue differentiation by the long non-coding RNA TINCR. Nature. 493, 231-235 (2013).
  16. Ridky, T. W., Chow, J. M., Wong, D. J., Khavari, P. A. Invasive three-dimensional organotypic neoplasia from multiple normal human epithelia. Nat Med. 16, 1450-1455 (2010).
  17. Mistry, D. S., Chen, Y., Sen, G. L. Progenitor function in self-renewing human epidermis is maintained by the exosome. Cell Stem Cell. 11, 127-135 (2012).
  18. Kretz, M., et al. Suppression of progenitor differentiation requires the long noncoding RNA ANCR. Genes Dev. 26, 338-343 (2012).
  19. Mulder, K. W., et al. Diverse epigenetic strategies interact to control epidermal differentiation. Nat Cell Biol. 14, 753-763 (2012).
  20. Boxer, L. D., Barajas, B., Tao, S., Zhang, J., Khavari, P. A. ZNF750 interacts with KLF4 and RCOR1, KDM1A, and CTBP1/2 chromatin regulators to repress epidermal progenitor genes and induce differentiation genes. Genes Dev. 28, 2013-2026 (2014).
  21. Jameson, K. L., et al. IQGAP1 scaffold-kinase interaction blockade selectively targets RAS-MAP kinase-driven tumors. Nat Med. 19, 626-630 (2013).
  22. Mistry, D. S., Chen, Y., Wang, Y., Sen, G. L. Transcriptional profiling of SNAI2 regulated genes in primary human keratinocytes. Genomics data. 4, 43-46 (2015).
  23. Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339, 823-826 (2013).
  24. Doebis, C., et al. Efficient in vitro transduction of epithelial cells and keratinocytes with improved adenoviral gene transfer for the application in skin tissue engineering. Transpl immunol. 9, 323-329 (2002).
  25. Melo, S. P., et al. Somatic correction of junctional epidermolysis bullosa by a highly recombinogenic AAV variant. Mol Ther. 22, 725-733 (2014).
  26. Nanba, D., Matsushita, N., Toki, F., Higashiyama, S. Efficient expansion of human keratinocyte stem/progenitor cells carrying a transgene with lentiviral vector. Stem cell res ther. 4, 127(2013).
  27. Sen, G. L., Reuter, J. A., Webster, D. E., Zhu, L., Khavari, P. A. DNMT1 maintains progenitor function in self-renewing somatic tissue. Nature. 463, 563-567 (2010).
  28. Shamir, E. R., Ewald, A. J. Three-dimensional organotypic culture: experimental models of mammalian biology and disease. Nat Rev Mol Cell Biol. 15, 647-664 (2014).
  29. Krejci, N. C., Cuono, C. B., Langdon, R. C., McGuire, J. In vitro reconstitution of skin: fibroblasts facilitate keratinocyte growth and differentiation on acellular reticular dermis. J Invest Dermatol. 97, 843-848 (1991).
  30. Mathes, S. H., Ruffner, H., Graf-Hausner, U. The use of skin models in drug development. Adv Drug Deliv Rev. 69-70, 81-102 (2014).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Primaire humane keratinocytenretrovirale vector transfectieepidermale differentiatiestromale vasculaire fractieassemblage van organotypische cassetteskeratinocyten groeimediumgenexpressieprofielanalyseimmuunkleuringsanalyse

Gerelateerde artikelen